專利名稱：大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物和基因及制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物和基因及制法及用途，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
組織傷口修復(fù)是一個(gè)由血細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與，交互作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程。組織傷口修復(fù)包括三個(gè)階段炎癥反應(yīng)，組織形成和組織再造。在炎癥反應(yīng)階段，通過(guò)周圍的受損的血管，從血清中釋放各種生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和低分子量的小分子化合物，引起炎癥反應(yīng)，與受損血管周圍的細(xì)胞外基質(zhì)相互膠聯(lián)，凝結(jié)，形成一道防御外界微生物的屏障，也作為早期創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中生長(zhǎng)因子作用的支架。同時(shí)，釋放的各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子能夠啟動(dòng)傷口修復(fù)中的細(xì)胞增殖和遷移。在組織形成和組織再造階段，在各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的作用下，在傷口周圍出現(xiàn)由新形成的毛細(xì)血管長(zhǎng)出物組成的肉芽組織，最終肉芽組織結(jié)痂，形成疤痕，修復(fù)傷口。
最新研究表明，組織傷口修復(fù)反應(yīng)與腫瘤發(fā)生過(guò)程有密切關(guān)系，腫瘤生長(zhǎng)也可以被視為一種不受調(diào)節(jié)的組織修復(fù)過(guò)程。在正常的組織中，組織修復(fù)反應(yīng)被誘導(dǎo)發(fā)生，在完成損傷組織修復(fù)后，它能夠被調(diào)控停止下來(lái)。但是在有致癌性的突變的情況下，最初的腫瘤生長(zhǎng)被認(rèn)為是對(duì)組織的損害而激發(fā)組織修復(fù)反應(yīng)的發(fā)生。這就導(dǎo)致了一個(gè)惡性循環(huán)組織修復(fù)產(chǎn)生的細(xì)胞會(huì)被用于腫瘤團(tuán)的生長(zhǎng)，而更大的腫瘤團(tuán)將被認(rèn)為是更大的組織損害，從而導(dǎo)致組織修復(fù)反應(yīng)提供更多的細(xì)胞用于腫瘤的生長(zhǎng)。如果能夠鑒定出啟動(dòng)因子信號(hào)及其負(fù)控制因子信號(hào)，就能試著去中和它，從而阻止腫瘤組織修復(fù)程序，進(jìn)而也能幫助來(lái)抑制或阻止腫瘤的生長(zhǎng)。因此，尋找腫瘤所利用的觸發(fā)組織修復(fù)反應(yīng)的重要啟動(dòng)因子信號(hào)及其負(fù)控制因子信號(hào)成為目前和未來(lái)的腫瘤研究的熱點(diǎn)方向之一。
脊椎動(dòng)物中，晶狀體蛋白(crystallin)是眼球晶狀體的結(jié)構(gòu)蛋白(C.T.Morner于1893年最早發(fā)現(xiàn))，決定了晶狀體的折光性和通光性。晶狀體蛋白分為α和βγ兩大類，α-晶狀體蛋白屬于廣泛分布的小的熱休克蛋白質(zhì)家族。βγ-晶狀體蛋白具有特征性的希臘鑰匙模體(Greek key motifs)，每個(gè)模體由40個(gè)氨基酸殘基組成，而兩個(gè)結(jié)構(gòu)模體可通過(guò)不對(duì)稱性排列形成一個(gè)結(jié)構(gòu)域，故將它們歸為βγ-晶狀體蛋白超家族。除了晶狀體外，非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)(non-lens βγ-crystallin)廣泛分布在其他組織中。在微生物中，非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)主要為壓力誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)蛋白質(zhì)。例如Protein S和Spherulin3a。Protein S是一種來(lái)源于土壤中革蘭氏陰性細(xì)菌Myxococcus xanthus的孢子專一蛋白，當(dāng)處于營(yíng)養(yǎng)缺乏的惡劣條件下，Protein S被誘導(dǎo)大量分泌表達(dá)，并結(jié)合鈣離子通過(guò)寡聚化作用在細(xì)菌表面組裝形成多層衣殼，在惡劣條件下保護(hù)自身。Spherulin 3a，來(lái)源于細(xì)菌Physarum polycephalum的囊泡形成蛋白，在各種壓力環(huán)境下合成，參與形成胞囊和休眠。在脊椎動(dòng)物中，已知的非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)包括ep37和AIM1。EP37(epidermis-specific protein 37，表皮分化蛋白37)是表達(dá)在兩棲動(dòng)物Cynopspyrrhogaster(日本蠑螈，潮汕蠑螈或稱赤腹蠑螈)的胚胎表皮，皮膚腺和胃表皮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。黑色素瘤缺失蛋白1(AIM1，absent in melanoma 1)，為一類首先在人黑色素瘤疾病模型中缺失的與腫瘤抑制相關(guān)的新基因。AIM1在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中時(shí)空特異性的表達(dá)調(diào)節(jié)，具有不同大小的轉(zhuǎn)錄本，在成體中AIM1大量表達(dá)于皮膚，肺，心臟，肝和腎等器官，認(rèn)為是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。盡管EP37蛋白和AIM1基因被認(rèn)為可能參與表皮發(fā)育和腫瘤抑制，但是目前對(duì)于他們的分子特性，生理功能和分子作用機(jī)制還知之甚少。
三葉因子(trefoil factor，TFF)為一類含有一個(gè)或者多個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域(或稱為P-結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約38～39個(gè)氨基酸殘基組成，含有6個(gè)半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫鍵)的分泌型的蛋白質(zhì)，廣泛地分布在哺乳動(dòng)物的胃腸道上皮及其他的上皮系統(tǒng)中，被認(rèn)為與粘膜保護(hù)，損傷修復(fù)和腫瘤抑制密切相關(guān)。第一個(gè)三葉因子多肽pS2/TFF1發(fā)現(xiàn)于人乳腺癌MCF7細(xì)胞中，在基因敲除三葉因子，小鼠的腫瘤發(fā)生率升高，同時(shí)三葉因子能夠引起腫瘤細(xì)胞凋亡，因此推測(cè)三葉因子為潛在的腫瘤抑制因子。三葉因子能夠引起趨化反應(yīng)，促進(jìn)表皮細(xì)胞的細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)，在胃粘膜的損傷修復(fù)中起到重要的作用，因此，三葉因子還作為促進(jìn)生長(zhǎng)蛋白。例如，目前報(bào)導(dǎo)重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(rat intestinalepithelial cell Lines，IEC-6)的細(xì)胞遷移能力，但是其所需要的濃度約為80多微摩爾。但是，自三葉因子蛋白發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直作為孤兒配體存在，與三葉因子作用的受體和詳細(xì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不清楚，也沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道三葉因子家族蛋白和非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)能夠聯(lián)合協(xié)同作用。
細(xì)胞內(nèi)泛素化修飾信號(hào)的具有多種功能，例如多泛素化修飾信號(hào)認(rèn)為是蛋白酶體降解蛋白的信號(hào)，單泛素化修飾信號(hào)則參與了其他不依賴于蛋白酶體降解的重要的細(xì)胞生理功能，包括介導(dǎo)細(xì)胞外分子內(nèi)吞，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核調(diào)節(jié)。最近研究表明，蛋白激素，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子可通過(guò)單泛素化修飾，經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，能夠直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)，發(fā)揮著重要的生理作用。例如，成纖維成長(zhǎng)因子(fibroblastgrowth factors，F(xiàn)GFs)，血小板生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factors，PDGF)，表皮生長(zhǎng)因子(epithelial growth factors，EGF)，和血管生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactors，VEGF)結(jié)合受體后，經(jīng)過(guò)單泛素化修飾，能夠被細(xì)胞內(nèi)吞，直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，增殖和分化，在胚胎發(fā)育，組織再生等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
大蹼鈴蟾(Bombina maxima)主要分布在中國(guó)西南的云南省和四川省，是我國(guó)特有的資源性兩棲動(dòng)物種類，也是特色的民族民間藥物。大蹼鈴蟾皮膚分泌物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的小分子量的肽類活性組分，如具有調(diào)節(jié)或者激素的功能的肽類，為哺乳動(dòng)物激素分子，神經(jīng)遞質(zhì)和生長(zhǎng)因子的類似物；抗菌肽類，作為兩棲動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前，在兩棲類動(dòng)物皮膚中尋找活性單體化合物和大分子先導(dǎo)化合物已成為了國(guó)內(nèi)外新藥和研究工具性探針的熱點(diǎn)之一。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物，還提供這種蛋白復(fù)合物的基因，以及其制備方法，還提供這種蛋白復(fù)合物及其基因的用途。大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物在體外具有ATPase和GTPase活性，為一類新的ATPase和GTPase酶。其具有多種細(xì)胞生物活性在體外納摩爾水平能夠殺死多種腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞脫落和凋亡；在皮摩爾水平具有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的活性；在細(xì)胞外經(jīng)單泛素化修飾，能夠直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控從而調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)，包括細(xì)胞遷移、脫落，生長(zhǎng)。本發(fā)明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物提供了非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細(xì)胞生物學(xué)功能及其能夠與三葉因子蛋白協(xié)同作用的機(jī)制，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)試劑制備和抗腫瘤以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)制藥。
本發(fā)明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物是從兩棲類皮膚中純化得到的天然大分子蛋白質(zhì)，其天然分子量為72kDa，由兩種類型的亞基所組成，α亞基和β亞基按αβ2的分子形式以非共價(jià)鍵連接而成。序列測(cè)定表明其α亞基由336個(gè)氨基酸殘基組成，具有SEQ ID NO1中的氨基酸序列，為非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)超家族成員。β亞基成熟肽由146個(gè)氨基酸殘基組成，包含三個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域，具有SEQ IDNO2中的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)被命名為大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物(complex of non lens-βγ crystallin and trefoil factor)，縮寫為βγ-CAT。
本發(fā)明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物是從兩棲類皮膚中得到的天然存在的非晶狀體βγ-晶狀體蛋白家族成員與三葉因子家族成員的蛋白質(zhì)復(fù)合物，也是非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子在天然條件下聯(lián)合協(xié)同作用。
編碼本發(fā)明大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基的cDNA由1251個(gè)核苷酸組成，該cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端為SEQ ID NO3，其特征在于編碼成熟的βγ-CAT的α亞基蛋白為SEQ ID NO3中第22-1029位核苷酸，其編碼相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO1。
編碼本發(fā)明大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的β亞基的cDNA由1830個(gè)核苷酸組成，該cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端為SEQ ID NO4。其特征在于編碼成熟的βγ-CAT的β亞基蛋白為SEQ ID NO4中第82-519位核苷酸，其編碼相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物，其制備方法可以通過(guò)生物化學(xué)分離純化方法，從中國(guó)特產(chǎn)兩棲動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚中分離純化得到將野外采集的活體大蹼鈴蟾飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用清水沖洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加適量的無(wú)水乙醚刺激，密閉容器3～5分鐘，待大蹼鈴蟾皮膚表面有大量的泡沫狀分泌物產(chǎn)生，打開(kāi)容器，輕柔按摩動(dòng)物背部皮膚，并用含5mM EDTA的生理鹽水溶液沖洗大蹼鈴蟾，收集皮膚分泌物，離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)，上清液冷凍干燥，即得皮膚分泌物。
將皮膚分泌物液經(jīng)過(guò)凍干，溶解，透析和離心處理，分別通過(guò)分子凝膠層析(AKTASephadex superfine G-100分子篩層析柱)和離子交換柱(AKTA Mono-Q HR5/5陰離子層析柱)兩道分離純化流程，即可獲得純化的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物。
大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基和β亞基的基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA的純化及反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建皮膚cDNA文庫(kù)，分別根據(jù)兩個(gè)亞基的N端已知序列和部分內(nèi)肽片段序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR篩選法篩選編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基和β亞基的基因，根據(jù)βγ-CAT的α亞基的全cDNA推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的蛋白序列，結(jié)合肽指紋圖譜和已知內(nèi)肽片段序列進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)編碼βγ-CAT的α亞基的全cDNA。
大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基和β亞基的全cDNA作為基因工程制備大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物具有ATPase和GTPase活性，還具有核苷酸結(jié)合活性，為一類全新的尚未報(bào)道過(guò)的ATPase和GTPase， 可用于生物醫(yī)學(xué)試劑制備和制藥 本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物在納摩爾水平能夠選擇性的殺死腫瘤細(xì)胞，并且能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生脫落和凋亡。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物在皮摩爾水平(50pM)就能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物在皮摩爾水平就能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，具有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的活性。目前報(bào)導(dǎo)的重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(rat intestinal epithelial cellLines，IEC-6)的細(xì)胞遷移能力，但是其所需要的濃度太高，約為80多微摩爾(83μM)。本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物誘導(dǎo)細(xì)胞遷移時(shí)候所需要的濃度僅在皮摩爾水平，活性比其他報(bào)道的哺乳動(dòng)物來(lái)源的單鏈三葉因子蛋白要高一百萬(wàn)倍左右。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物能夠通過(guò)單泛素化修飾，以囊泡化的方式，直接迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控從而調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)，包括細(xì)胞遷移、脫落，生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物揭示脊椎動(dòng)物非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細(xì)胞生物學(xué)功能及其能夠與三葉因子蛋白協(xié)同作用的協(xié)同機(jī)制。
下面結(jié)合附圖，通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本發(fā)明的內(nèi)容并不僅局限于此。



圖1為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT的分離制備流程，A圖為分子篩凝膠層析分離圖譜，B圖為陰離子凝膠層析圖譜。
圖2為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT的α亞基的氨基酸全序列表。
圖3為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT的β亞基的氨基酸全序列表。
圖4為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT的α亞基基因的核苷酸全序列表。
圖5為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT的β亞基的基因的核苷酸全序列表 圖6為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT體外測(cè)定ATPase和GTPase，核苷酸結(jié)合活性，A和B圖為核苷酸結(jié)合測(cè)定，C圖為ATPase和GTPase活性測(cè)定。
圖7為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT體外選擇性對(duì)多種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞毒殺傷作用。
圖8為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT誘導(dǎo)人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞HCT116發(fā)生凋亡。
圖9為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT抑制黑色素瘤A375細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖10為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移和傷口修復(fù)，A圖為βγ-CAT誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞遷移的量效關(guān)系圖，B圖為βγ-CAT誘導(dǎo)HUVEC傷口修復(fù)的量效關(guān)系圖。
圖11為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)產(chǎn)生囊泡化，A圖為活體觀察βγ-CAT的囊泡化效應(yīng)，B圖為氯化銨對(duì)βγ-CAT的囊泡化效應(yīng)的影響，C圖為βγ-CAT的囊泡化效應(yīng)的量效和時(shí)效曲線。
圖12為本發(fā)明蛋白復(fù)合物βγ-CAT通過(guò)囊泡化，經(jīng)單泛素化修飾，直接轉(zhuǎn)運(yùn)到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞核，A圖為Cy3標(biāo)記βγ-CAT顯示細(xì)胞核定位，B圖為FITC標(biāo)記抗體原位雜交顯示βγ-CAT的細(xì)胞核定位，C圖為抗體免疫雜交分析βγ-CAT在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)中間體及其單泛素化修飾。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的分離純化，結(jié)構(gòu)測(cè)定和α亞基和β亞基基因的分子克隆 (一)大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的分離純化 第一步將野外采集的活體大蹼鈴蟾飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用清水沖洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加適量的無(wú)水乙醚刺激，密閉容器3～5分鐘，待大蹼鈴蟾皮膚表面有大量的泡沫狀分泌物產(chǎn)生，打開(kāi)容器，輕柔按摩動(dòng)物背部皮膚，并用含5mM EDTA的生理鹽水溶液沖洗大蹼鈴蟾，收集皮膚分泌物，離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)，上清液冷凍干燥，即得皮膚分泌物。
第二步分子篩Sephadex superfine G-100層析將皮膚分泌物液凍干粉溶于緩沖液(50mM Tris-HCl buffer，pH7.8，containing 150mM NaCl and 5mM EDTA)，4℃過(guò)夜充分溶解后離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)取上清。上清液經(jīng)0.45μm濾頭過(guò)濾后，上樣于以相同的緩沖液預(yù)先平衡好的AKTA Sephadex superfine G-100分子篩層析柱(2.6×100cm)，流速為1.0ml/min。按檢測(cè)器280nm的光吸收值收集第二峰初樣(見(jiàn)圖1A)。
第三步AKTA Mono-Q HR5/5陰離子層析柱經(jīng)凍干濃縮和透析處理后(20mMTris-HCl，pH7.8，4℃透析24小時(shí))，上樣于以透析緩沖液預(yù)先平衡好的AKTA Mono-QHR5/5陰離子層析柱，通過(guò)鹽梯度進(jìn)行洗脫(A液20mM Tris-HCl，pH8.3；B液20mM Tris-HCl，pH8.3，containing 1M NaCl；A和B為等體積)。收集箭頭所示峰，即得大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物，見(jiàn)圖1B。
純化得到的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的純度采用SDS-PAGE/NATIVE-PAGE測(cè)定，電泳方法參照Laemmli(Laemmli 1970)，蛋白條帶純度采用銀染方式檢測(cè)。
(二)大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)測(cè)定 1.βγ-CAT分子量測(cè)定βγ-CAT的表觀分子量采用Gel Pro V3.0軟件對(duì)銀染的SDS-PAGE(T＝10％)電泳膠進(jìn)行分析。天然分子量測(cè)定采用分子篩排阻層析(Sephadexsuperfine G-100，2.6×100cm)，Phosphatase B(97.4kDa)，BSA(66.2kDa)，Ovalbumin(45.0kDa)，Chymotrypsin(25.0kDa)作為內(nèi)參分子量標(biāo)準(zhǔn)，取1mg βγ-CAT上樣，流速為0.2ml/min，按5min/tube收集，計(jì)算βγ-CAT天然分子量，同時(shí)采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)βγ-CAT的精確分子量。
2.βγ-CAT的蛋白定量βγ-CAT的蛋白定量測(cè)試采用BIO-RAD公司的PROTEIN ASSAYKIT，采用考馬斯亮蘭G-250染料，BSA做為濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，依照產(chǎn)品技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行。
3.βγ-CAT的α亞基和β亞基的N末端氨基酸序列測(cè)定純化的βγ-CAT經(jīng)SDS-PAGE(T＝10％)電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用美國(guó)Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列儀，用Edman降解法分別測(cè)定βγ-CAT的α亞基和β亞基的N末端氨基酸序列。
4.βγ-CAT的α亞基和β亞基的拆分采用HPLC1100系統(tǒng)Vydac C4 RP-HPLC層析柱來(lái)實(shí)現(xiàn)拆分βγ-CAT的兩個(gè)亞基。流動(dòng)相分別為30％乙腈-70％去離子水-0.1％三氟乙酸和30％異丙醇-70％乙腈-0.1％三氟乙酸。
5.βγ-CAT的α亞基和β亞基的內(nèi)肽序列分析將用VydacC4 RP-HPLC拆分得到的βγ-CAT的α亞基和β亞基采用胰蛋白酶/Endoprotease Glu-CV8消化參照產(chǎn)品指導(dǎo)進(jìn)行，通過(guò)Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列儀進(jìn)行序列分析。
6.βγ-CAT的α亞基和β亞基肽質(zhì)量指紋圖譜的鑒定先將βγ-CAT的α亞基和β亞基先進(jìn)行二硫鍵的還原及巰基保護(hù)(碘乙酰胺化)，處理方法為將0.1mg βγ-CAT溶解于100μl 0.5M pH8.5 NaHCO3中，再加入10μl 0.1 M DTT，于42℃反應(yīng)60分鐘，然后加入20μl 0.2M碘乙酰胺室溫暗處反應(yīng)2小時(shí)。再將處理的βγ-CAT經(jīng)10％SDS-PAGE分離，用考馬斯亮蘭R-250染色，待脫色至背景清晰后切下采用PEBiosystems Voyager System 6192進(jìn)行胰蛋白酶酶解肽質(zhì)量指紋圖譜的測(cè)定。
(三)大蹼鈴蟾非晶狀體βr-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基和β亞基編碼基因的分子克隆 技術(shù)路線包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA的純化及反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建皮膚cDNA文庫(kù)，分別根據(jù)兩個(gè)亞基的N端已知序列和部分內(nèi)肽片段序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR篩選法篩選編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子復(fù)合物βγ-CAT的α亞基和β亞基的基因。
1.大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，快速搗毀腦、脊髓處死動(dòng)物，迅速剝皮，放入液氮中速凍4h，取150mg皮膚組織，加入2ml總RNA提取緩沖液，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30min，加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12,000rpm離心10min，取上清，加入等體積異丙醇，室溫放置10min，4℃，12,000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2.大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國(guó)Invitrogen公司的mRNA分離純化試劑盒進(jìn)行純化。取大蹼鈴蟾皮膚總RNA 500μg溶于500μl經(jīng)過(guò)DEPC處理的滅菌水中，65℃水浴10min，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠(隨mRNA分離純化試劑盒)輕彈混勻，至磁力架吸附30sec，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30sec，最后加0.1ml0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10min，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的離心管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30sec，移上清至上述離心管，上清中為純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA。加入1/10體積3 M乙酸鈉，pH5.2，等體積異戊醇，于-70℃放置30min，然后于4℃，12,000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3.大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫(kù)的構(gòu)建采用SuperScriptTM Plasmid cloning System(GIBCO/BRL)試劑盒來(lái)構(gòu)建皮膚cDNA文庫(kù)，但是操作方法有所改進(jìn)。cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)，于1.5ml試管中加入2μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶，于37℃保溫1小時(shí)后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應(yīng)總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時(shí)；加入2μl T4DNA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，加入70μl 7.5 M乙酸銨，0.5ml無(wú)水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的連接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl 5XT4DNA連接酶緩沖液，10μl Sal I adapter，5μl T4DNA連接酶，反應(yīng)總體積50μl，于16℃保溫16小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過(guò)程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶切，于cDNA溶液中加入5μl酶切緩沖液，4μl Not I酶，反應(yīng)體積50μl，于37℃保溫2小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過(guò)程，沉淀溶解于100μlTEN緩沖液中。將cDNA樣品過(guò)DNA分級(jí)分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組分合并，體積為20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸銨，0.6ml無(wú)水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN緩沖液中。合成的cDNA連接酶緩沖液，1μlpSPORT1質(zhì)粒(Not I-Sal I酶水解，50ng)，4μl 5X T4DNA連接酶，反應(yīng)體積20μl，室溫反應(yīng)3小時(shí)，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的制備，挑取單個(gè)HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時(shí)，待菌液540nm 0.D.值為0.4時(shí)，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5μl加入50μl感受態(tài)細(xì)胞冰浴20分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無(wú)氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.4ml，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養(yǎng)16小時(shí)，每個(gè)LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10％甘油凍存構(gòu)建的cDNA大約含4×105個(gè)單獨(dú)克隆。
4.βγ-CAT的β亞基的分子克隆按測(cè)定的N未端及內(nèi)肽序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩條引物，上游引物P1F和下游引物P3R，P1F5’-TT(CT)TCNGA(CT)(CT)TNCA(AG)ATAGG-3’，對(duì)應(yīng)于βγ-CAT-β N端的1-7氨基酸殘基，P3R5’-ATNGGNTCNGC(TG)CT(TC)TTCCT-3’，對(duì)應(yīng)于內(nèi)肽102-108氨基酸殘基。以5μg mRNA為模板，以oligo-d(T)18為引物，獲得cDNA第一鏈。利用P1F和P3R兩條引物進(jìn)行部分序列的PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃ 2min，92℃10sec，50℃ 30sec，72℃90sec，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。所得片段克隆到pGEM-T載體(Promega)，測(cè)序，獲得目的序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物，上游引物P85’-AGTCTGAAGTGTGCAGTTGCA-3’對(duì)應(yīng)于β亞基成熟肽的8-14氨基酸殘基，和下游引物P86R5’-TAATGCATGAAAACAGCAGCC-3’，對(duì)應(yīng)于β亞基成熟肽的80-86氨基酸殘基。以P8和P86R為特異性引物，參照張?jiān)莆恼轮兴龇椒?，在所?gòu)建的大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫(kù)中篩選βγ-CAT的β亞基全長(zhǎng)cDNA克隆。篩選陽(yáng)性克隆的方法細(xì)菌接種于96孔板上以8×8矩陣排列的方式培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基(內(nèi)含有100μg/ml胺芐青霉素)，總共64孔，每孔100μl 37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第一輪篩選將細(xì)菌稀釋到1000個(gè)細(xì)菌/100μl，第二輪篩選稀釋至50個(gè)細(xì)菌/100μl。于64個(gè)培養(yǎng)孔按照橫豎方式分別合并細(xì)菌，由64孔合并為16孔，然后用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，找出具有陽(yáng)性克隆的孔再進(jìn)行第二輪篩選，第二輪篩選結(jié)束后，將含目的克隆的培養(yǎng)細(xì)菌劃線培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行PCR測(cè)定，最后篩選出陽(yáng)性單克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。PCR條件94℃，2min；92℃10sec，50℃ 30sec，72℃ 40sec，共35個(gè)循環(huán)。
5.βγ-CAT的α亞基的分子克隆根據(jù)測(cè)序獲得的內(nèi)肽片段序列，共設(shè)計(jì)合成15條正義引物和17條反義引物，將這些引物以一定的排列組合進(jìn)行嵌套PCR，將PCR產(chǎn)物亞克隆進(jìn)pGEM-T載體(Promega)，進(jìn)行測(cè)序，篩選出含有βγ-CAT的α亞基內(nèi)肽片段的亞克隆。以引物BMT-H-23(5’-ATTATT CTT TA(CT)gA(CT)gA(Ag)CC-3’)和BMT-H-23R(5’-gg(CT)TC(gA)TC(gA)TAA AgA ATA AT-3’)擴(kuò)增出一個(gè)確定含有內(nèi)肽的0.8kb片段。第二步，基于此cDNA片段序列設(shè)計(jì)專一引物進(jìn)行cDNA篩庫(kù)。從獲得的cDNA片段序列，設(shè)計(jì)兩條專一引物正義引物P9(5’-GGTCTGAGCTTAGAACTCACCAGG-3’)，對(duì)應(yīng)于βγ-CAT的α亞基的16-23氨基酸殘基，和反義引物P9R(5’-GAGCACCTGCCAAGAAGAAGC-3’)，對(duì)應(yīng)于βγ-CAT的α亞基的121-127氨基酸殘基，進(jìn)行下一倫篩庫(kù)以獲得陽(yáng)性單克隆。獲得的克隆采用ABIPRISM 377 DNA(Applied Biosystems)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
6.編碼βγ-CAT的α亞基和β亞基的基因的確認(rèn) 將由cDNA推導(dǎo)出的亞基全序列進(jìn)行已獲得的亞基肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行驗(yàn)證。將全序列和已有的亞基肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)輸入EXPASY FindPep Tool進(jìn)行分析確認(rèn)(http://au.expasy.org/cgi-bin/findpept.pl)。
從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中純化的βγ-CAT，在SDS-PAGE膠中，還原與非還原條件下βγ-CAT均由兩條蛋白條帶組成，表觀分子量一條為18kDa(β亞基)，另一條為38kDa(α亞基)，表明兩個(gè)亞基通過(guò)非共價(jià)鍵形式存在。通過(guò)Gel Pro V3.0對(duì)兩條蛋白條帶含量分析表明，α亞基含量占55.5％，β亞基含量占44.5％，α和β亞基含量比例接近1∶1。在Native-PAGE膠中，銀染的βγ-CAT顯示只有一條帶，并且在濃縮膠中未觀察到有未進(jìn)膠的蛋白條帶，表明在天然狀態(tài)下α和β兩個(gè)亞基是以非共價(jià)鍵形成βγ-CAT復(fù)合物。天然分子量測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，βγ-CAT的天然分子量為72kDa。通過(guò)C4 RP-HPLC層析柱實(shí)現(xiàn)了βγ-CAT的兩個(gè)亞基的拆分，表明兩個(gè)亞基之間是通過(guò)疏水相互作用形成復(fù)合物。
通過(guò)測(cè)序分析獲得β亞基N末端15個(gè)氨基酸(FSDLQIGSLLHAVAA)，βγ-CAT的α亞基六段內(nèi)肽片段，共102個(gè)氨基酸；β亞基四段內(nèi)肽片段，共65個(gè)氨基酸。最終分別得到編碼βγ-CAT的α亞基和β亞基的cDNA全克隆(SEQ ID NO3編碼α亞基，見(jiàn)圖4；SEQ ID NO4編碼β亞基，見(jiàn)圖5)。根據(jù)cDNA推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)的α亞基(SEQ ID NO1，見(jiàn)圖2)和β亞基(SEQ ID NO2，見(jiàn)圖3)氨基酸全序列，能夠與已經(jīng)獲得的N末端氨基酸序列和內(nèi)肽序列片段完全匹配。同時(shí)，將由cDNA推導(dǎo)出的亞基氨基酸全序列輸入EXPASY FindPep Tool進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析，同已有的亞基肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，得到的結(jié)果表明從獲得的全cDNA推導(dǎo)出的氨基酸序列的肽質(zhì)量指紋圖譜與已獲得的亞基肽質(zhì)量指紋圖譜匹配完全，即獲得的cDNA確切分別編碼βγ-CAT的α和β亞基。
分別將βγ-CAT的α亞基和β亞基的氨基酸全序列通過(guò)NCBI BLAST進(jìn)行搜索分析，結(jié)果顯示在世界范圍內(nèi)尚未有氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)或cDNA序列相同的基因報(bào)道。βγ-CAT的α亞基由336個(gè)氨基酸殘基組成，為非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(zhì)超家族成員；而其β亞基成熟肽由146個(gè)氨基酸殘基，包含三個(gè)三葉因子結(jié)構(gòu)域，因而將該蛋白質(zhì)被命名為大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物(complex of non lens-βγcrystallin and trefoil factor)，縮寫為βγ-CAT。
實(shí)施例2大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物βγ-CAT體外ATPase和GTPase，核苷酸結(jié)合活性測(cè)定 核苷酸結(jié)合活性測(cè)試 βγ-CAT與核苷酸結(jié)合活性測(cè)試具體實(shí)驗(yàn)流程為將βγ-CAT與10μM TNP-GTP/ATP(溶解于溶液50mM Tris-HCl(pH7.8)+20％(v/v)glycerol)在室溫孵育5分鐘，然后進(jìn)行熒光激發(fā)測(cè)試(激發(fā)為410nm，發(fā)射為565-600nm)，與核苷酸類似物結(jié)合能力由575nm TNP-GTP/ATP熒光發(fā)射強(qiáng)度的改變來(lái)判斷。
GTPase/ATPase活性測(cè)試 βγ-CAT的GTPase/ATPase活性測(cè)試采用GTPase/ATPase比色kit(Innova Biosciences，UK，high sensitivity)，參照KIT指南進(jìn)行，酶活單位為nmol/min。
結(jié)果表明βγ-CAT能夠與GTP/ATP的類似物TNP-GTP/TNP-ATP在體外實(shí)驗(yàn)體系中結(jié)合，表明βγ-CAT具有GTP/ATP結(jié)合活性(見(jiàn)圖6A-B)。結(jié)合βγ-CAT在HUVEC中能夠快速轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，表明βγ-CAT可通過(guò)其GTPase/ATPase酶活性和NTP結(jié)合活性來(lái)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活，調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。
同時(shí)βγ-CAT在體外檢測(cè)到了GTPase/ATPase活性，其酶活性分別為0.23nM/min和0.15nM/min(見(jiàn)圖6C)，通過(guò)WEB OF SCIENCE檢索，在世界范圍內(nèi)尚未有相關(guān)報(bào)道，表明βγ-CAT為一類全新的GTPase/ATPase，。
實(shí)施例3大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物βγ-CAT對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用 腫瘤細(xì)胞株HCT116，AGS，K562購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；腫瘤細(xì)胞株Hela，HT29，MCF-7，THP-1，A375，Hacat購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫(kù)。
倒置顯微鏡(Olympus，USA)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，German)；35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，美國(guó))，各種規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))。膠原酶(Sigma，美國(guó))；胰酶(Sigma，美國(guó))；青霉素，鏈霉素，四環(huán)素(Sigma，美國(guó))；臺(tái)盼藍(lán)(Sigma，美國(guó))；胎牛血清(Hyclone，美國(guó)血源)；各種培養(yǎng)基(M199，McCoy’s 5a，MEM，Ham’sF12K，RP1640)(Gibco，美國(guó))，血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體(Invitrogen，美國(guó))，熒光素FITC-標(biāo)記的羊抗兔二抗(Invitrogen，美國(guó))；熒光素標(biāo)記的低密度脂蛋白(Invitrogen，美國(guó))；生化試劑(EDTA，DMSO，丙酮，Triton-100，NaCl，KCl，NaHCO3，KH2PO4等，Amersco)。
(一).各種腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 1.1結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，HT29。
1.購(gòu)買結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，HT29。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為McCoy’s 5a培養(yǎng)基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度。
3.棄培養(yǎng)基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量McCoy’s 5a培養(yǎng)基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
1.2乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。
1.購(gòu)買乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)其他微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為MEM(Eagle)培養(yǎng)基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.1M非必須氨基酸，1mM丙酮酸鈉，0.01mg/ml牛胰島素，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度。
3.棄培養(yǎng)基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量MEM(Eagle)培養(yǎng)基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.1M非必須氨基酸，1mM丙酮酸鈉，0.01mg/ml牛胰島素，10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
1.3胃腺癌細(xì)胞株AGS。
1.購(gòu)買胃腺癌細(xì)胞株AGS。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)其他微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為Ham’s F12K培養(yǎng)基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度。
3.棄培養(yǎng)基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量Ham’s F12K培養(yǎng)基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
1.4宮頸癌表皮細(xì)胞株Hela。
1.購(gòu)買宮頸癌表皮細(xì)胞株Hela。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)其他微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度。
3.棄培養(yǎng)基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
1.5急性白血病單核細(xì)胞株THP-1；慢性髓原白血病細(xì)胞株K562。
1.購(gòu)買急性白血病單核細(xì)胞株THP-1。復(fù)蘇本實(shí)驗(yàn)室保存慢性髓原白血病細(xì)胞株K562。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)其他微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，懸浮培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)明顯增加。
3.加入新鮮RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
4.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
1.6皮膚癌細(xì)胞株惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375；病毒轉(zhuǎn)染的永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat。
1.購(gòu)買皮膚癌惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375；病毒轉(zhuǎn)染的永生化角質(zhì)細(xì)胞Hacat。置倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)其他微生物污染。
2.更換培養(yǎng)基為RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，持續(xù)觀察無(wú)任何污染，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度。
3.棄培養(yǎng)基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量RP1640培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細(xì)胞，分入2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞長(zhǎng)至90％滿度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
(二)MTT法測(cè)定βγ-CAT對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 1.分別消化長(zhǎng)至90％滿度的腫瘤細(xì)胞株HCT116，HT29，MCF-7，AGS，Hela，A375，Hacat，THP-1，K562。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2.5×105 cell/ml。接種于96孔板中，每孔200μl。
2.置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。
3.更換新鮮培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)。
4.加入βγ-CAT至終濃度分別為0，5nM，25nM和100nM。同時(shí)設(shè)置凋零孔，對(duì)照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔。37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30min。
5.離心，小心吸去上清。PBS輕輕洗滌，再次離心，棄上清。
6.每孔加入180ul新鮮M199培養(yǎng)液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
7.終止培養(yǎng)，離心，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。PBS輕輕洗滌，再次離心，棄上清。
8.每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀595nm處測(cè)量各孔的吸光值。
9.計(jì)算細(xì)胞存活率[(對(duì)照孔-凋零孔)-(實(shí)驗(yàn)孔-凋零孔)]/(對(duì)照孔-凋零孔)×100％。
MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，βγ-CAT對(duì)9種不同的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒選擇性。如圖7所示，圖中橫坐標(biāo)為βγ-CAT的濃度，縱坐標(biāo)為癌細(xì)胞的存活率。βγ-CAT在0，5，25，100nM四個(gè)濃度時(shí)對(duì)5種不同的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的體外細(xì)胞毒作用，隨著βγ-CAT濃度增加，癌細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，顯示出明顯的量效關(guān)系，即具有劑量依賴性。βγ-CAT在0，5，25，100nM四個(gè)濃度內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞AGS，Hacat，A375和K562無(wú)明顯的細(xì)胞毒活性。βγ-CAT對(duì)具有細(xì)胞毒作用的癌細(xì)胞表現(xiàn)出高效的細(xì)胞毒活性，其對(duì)低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT116的CC50為3nM，為最敏感；對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29的CC50為3nM；對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的CC50為75nM；對(duì)急性白血病單核細(xì)胞THP-1的CC50為60nM；對(duì)宮頸癌表皮細(xì)胞Hela的CC50為100nM。
實(shí)施例4大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物體外誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞凋亡 凋亡DNA抽提試劑盒(上海華舜)；瓊脂糖；乙醇(Amresco)；UV凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))，TUNEL染色試劑盒，細(xì)胞色素c釋放檢測(cè)試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；Caspases酶活性測(cè)定試劑盒(Calbiochem)；PI，Hoechst(Sigma，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(FACSVantage SE，Becton Dickinson)；熒光分光光度計(jì)(Perkin Elmer LS50B)所需溶液 1)PI溶液將PI溶于PBS(pH7.4)中，終濃度為100μg/ml，含RNase 100μg/m用棕色瓶4℃避光保存。
2)Hoechst染色液用雙蒸水配成1mg/ml，pH7.0。使用時(shí)，將Hoechst 33342儲(chǔ)液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中，終濃度為10μg/ml。
3)D-Hanks液配方(g/L)KCl，0.4g；KH2PO4，0.06g；NaCl，8.0g；NaHCO3，0.35g；Na2HPO4·7H2O，0.09g；酚紅，0.01g。
4)PBS緩沖液配方(g/L)NaCl，8.0g；KCl，0.2g；Na2HPO4·H2O，1.56g；KH2PO4，0.2g。
1.流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生 在長(zhǎng)到90％滿度的HCT116細(xì)胞中，加βγ-CAT后，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別孵育30min和2h，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(加入PBS)。中止培養(yǎng)后，平行組細(xì)胞分別用下述的PI單染色法和PI/Hochest染色法染色，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)HCT116，HT29，A375，THP-1的細(xì)胞凋亡情況。
A.PI單染色法測(cè)定經(jīng)βγ-CAT處理后二倍體亞峰的產(chǎn)生 1.在長(zhǎng)到90％滿度的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加βγ-CAT至終濃度為25nM，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育不同時(shí)間0h，2h，4h，12h。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(加入H2O2)和陰性對(duì)照(加入PBS)。
2.收集細(xì)胞離心，棄上清液。
3.PBS清洗一次。
4.離心棄去PBS，加入預(yù)冷的70％的乙醇固定，4℃，15min。
5.離心棄去固定液，PBS緩沖液重懸。
6.用1ml PI染液，4℃避光，染色30min。
7.流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。
B.PI和Hochest雙染色法測(cè)定經(jīng)βγ-CAT處理后二倍體亞峰的產(chǎn)生 1.在長(zhǎng)到90％滿度的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加βγ-CAT至終濃度分別為0nM，5nM，30nM，100nM。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。
2.中止培養(yǎng)，傾出上層培養(yǎng)基。PBS清洗兩次，與上層培養(yǎng)基合并。
3.胰酶溶液消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液與2中的溶液合并。
4.離心，棄上清液。
5.PBS清洗一次。
6.加入Hochest染色液，4℃避光，染色10min。
7.加入0.5ml PI染液，4℃避光，染色10min。
8.流失細(xì)胞儀上檢測(cè)。
2.TUNEL染色法檢測(cè) 培養(yǎng)HCT116細(xì)胞于蓋玻片上，加入βγ-CAT(終濃度分別為5nM，25nM，100nM)，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別孵育2小時(shí)。設(shè)立陰性對(duì)照(只加入PBS緩沖液)。中止培養(yǎng)。按TUNEL KIT中染色法進(jìn)行染色，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察。
3.試劑盒檢測(cè)細(xì)胞色素c釋放 培養(yǎng)HCT116細(xì)胞于蓋玻片上。加βγ-CAT至終濃度分別為5nM，25nM，100nM，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別孵育2小時(shí)。設(shè)立陰性對(duì)照(只加入PBS緩沖液)。中止培養(yǎng)，吸出上層培養(yǎng)基，PBS清洗兩次。按照試劑盒操作步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，透明，封閉，染色等步驟。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
4.Caspases酶活性測(cè)定 在長(zhǎng)到90％滿度的HCT116細(xì)胞中，分別加入不同濃度的βγ-CAT，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育2h。設(shè)立陰性對(duì)照(加入PBS)。中止培養(yǎng)，傾出上層培養(yǎng)基。PBS清洗兩次，與上層培養(yǎng)基合并。離心，棄上清液收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)平行組。一個(gè)組中僅檢測(cè)貼壁細(xì)胞；一個(gè)組中檢測(cè)貼壁細(xì)胞和上清液所有收集細(xì)胞。裂解液裂解收集的所有細(xì)胞，測(cè)定并調(diào)整總蛋白質(zhì)的濃度。處理細(xì)胞，分別加入試劑盒中的各種底物。37℃孵育2小時(shí)。熒光分光光度計(jì)檢測(cè)。結(jié)果計(jì)算Caspases酶活性表示為每μg總蛋白每個(gè)小時(shí)的最大熒光凈增量。
結(jié)果表明，βγ-CAT能夠誘導(dǎo)HCT116腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。βγ-CAT(濃度為0nM，5nM，30nM，100nM)分別處理30分鐘和2小時(shí)，通過(guò)PI/Hochest雙染料染色法染色能夠明顯地看到死亡細(xì)胞數(shù)隨著劑量的增加、孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(被PI穿透的細(xì)胞數(shù)明顯增多)，即βγ-CAT能夠以劑量，時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)HCT116發(fā)生凋亡。
HCT116經(jīng)βγ-CAT處理后，TUNEL染色陽(yáng)性，能夠檢測(cè)到線粒體細(xì)胞色素c的釋放和caspases酶激活。在整體細(xì)胞(包括脫落的細(xì)胞和貼壁細(xì)胞)中，caspase-1/2/6/8/9被大量的激活，表明βγ-CAT能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞HCT116通過(guò)經(jīng)典凋亡途徑發(fā)生凋亡(見(jiàn)圖8)。
實(shí)施例5大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物βγ-CAT體外抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞株A375的生長(zhǎng) MTT法測(cè)定βγ-CAT對(duì)黑色素瘤細(xì)胞株A375的生長(zhǎng)的狀態(tài)影響 1.消化長(zhǎng)至90％滿度的黑色素瘤細(xì)胞株A375，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至104cells/ml。接種于96孔板中，每孔200μl。同時(shí)設(shè)定已知的不同細(xì)胞濃度的孔以作對(duì)照。
2.置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6小時(shí)，至細(xì)胞貼壁后，更換含有βγ-CAT不同終濃度的培養(yǎng)基(從0-25nM)，培養(yǎng)不同的時(shí)間(共7天)。每隔24小時(shí)，MTT法測(cè)定當(dāng)天的細(xì)胞數(shù)，并更換一次含有相應(yīng)濃度的βγ-CAT培養(yǎng)基。每個(gè)劑量和時(shí)間點(diǎn)都設(shè)定三個(gè)復(fù)孔。
3.計(jì)算每天細(xì)胞的存活率。并作生長(zhǎng)曲線。
如圖9所示，在體外βγ-CAT能夠顯著的抑制皮膚癌惡性黑色素瘤細(xì)胞A375的生長(zhǎng)。隨著βγ-CAT濃度的增加(25pM，50pM，250pM，1nM，5nM，25nM)，細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，即具有劑量依賴性。
實(shí)施例6大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物βγ-CAT促進(jìn)人源臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)測(cè)定 嬰兒臍帶來(lái)自自愿捐贈(zèng)者；膠原包被的Boyden chamber細(xì)胞遷移測(cè)定試劑盒；VEGF(Singma，美國(guó))；EGF(Singma，美國(guó))。
1)Harvesting緩沖液含有2mM EDTA的PBS緩沖液。
2)Quenching Medium含有5％BSA的無(wú)血清完全培養(yǎng)基。
3)饑餓培養(yǎng)基HUVEC饑餓培養(yǎng)基含有2％胎牛血清的HUVEC完全培養(yǎng)基。
HUVEC的培養(yǎng)和鑒定 (一).HUVEC的原代培養(yǎng) 1.在無(wú)菌條件下，取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶，(長(zhǎng)20cm以上，不宜超過(guò)6小時(shí))，選擇無(wú)夾痕，無(wú)扭曲，無(wú)凝血阻塞的部分。
2.在臍靜脈兩端開(kāi)口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上，注入D-Hanks液沖洗臍靜脈，至無(wú)血跡。
3.從一端的注射器向臍靜脈徐徐注入0.1％膠原酶溶液，至血管充盈。注意兩端封閉，以防止液體返流。立即放入37℃的無(wú)菌D-Hanks液中，10min后取出。
4.通過(guò)注射器吸取收集酶液，同時(shí)注入含20％胎牛血清的199培養(yǎng)液沖洗靜脈。合并于同一離心管中，以1000rpm/min離心7-10min。
5.棄去離心沉淀后的上清液，加入20％胎牛血清的199培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，并調(diào)整至細(xì)胞密度為1.5-2.0×105個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)皿中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6.第2天棄培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕洗1次，以去除不貼壁的細(xì)胞或死細(xì)胞，換入新鮮含20％胎牛血清、抗生素的199培養(yǎng)液。繼續(xù)置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
7.每2-3天換液一次。每次換1/2-2/3量。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，即可傳代。
(二).HUVEC的傳代培養(yǎng) 1.待原代培養(yǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)后，棄培養(yǎng)液，用預(yù)溫的D-Hanks液清洗2次，加入0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細(xì)胞覆蓋，室溫下消化1-2min。
2.鏡下見(jiàn)細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增寬后，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，棄酶液。
3.可再用D-Hanks液輕輕洗1次，加入新鮮含10％胎牛血清，和抗生素的M199培養(yǎng)液。
4.用吸管吸取培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞捶打下來(lái)，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×105cells/ml，按實(shí)驗(yàn)需要接種到新的培養(yǎng)瓶或其他培養(yǎng)器皿中。一般按照1∶2-1∶3的比例傳代。
5.每隔2-3天換液一次，每次換掉2/3量。待細(xì)胞長(zhǎng)至融合狀態(tài)，又可傳代。
(三).HUVEC的鑒定 1.光鏡下觀察。就培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下直接觀察。內(nèi)皮細(xì)胞成扁平的短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區(qū)域較無(wú)核的區(qū)域突出，細(xì)胞呈單層鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列生長(zhǎng)，并有接觸抑制現(xiàn)象。
2.血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體免疫熒光染色。
2.1胰酶消化已經(jīng)長(zhǎng)至90％滿度的HUVEC為單細(xì)胞懸液。
2.2使用血球計(jì)數(shù)板上計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×105細(xì)胞每毫升培養(yǎng)基。
2.3接種1ml細(xì)胞懸液到放置于35mm小皿中蓋玻片上，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
2.4光鏡下觀察，細(xì)胞貼壁狀態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)正常。更換培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定2小時(shí)。
2.5棄上層培養(yǎng)基，用D-Hanks清洗兩次。
2.6丙酮固定。用D-Hanks清洗。Triton-100穿透。用D-Hanks清洗。
2.7加入抗血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體，4℃，孵育過(guò)夜。
2.8 D-Hanks清洗三次。加入商業(yè)化FITC-標(biāo)記的羊抗兔二抗，4℃，孵育過(guò)夜。
2.9 D-Hanks清洗三次。封片。
2.10激光共聚焦顯微鏡下觀察。
細(xì)胞遷移活性測(cè)定(Cell migration assay) 采用Boyden Chamber(Chemicon，美國(guó))系統(tǒng)來(lái)測(cè)定細(xì)胞遷移活性，具體操作步驟如下 1.準(zhǔn)備和收集實(shí)驗(yàn)細(xì)胞HUVEC培養(yǎng)到約80％滿度。更換細(xì)胞培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞約18小時(shí)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。PBS清洗細(xì)胞。加入Harvesting緩沖液消化細(xì)胞5min。加入足量Quenching Medium中和消化液中的胰酶和EDTA。離心，棄上清。加入少量Quenching Medium重新懸浮細(xì)胞。計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×106cells/ml。
2.藥物處理按照試劑盒說(shuō)明將細(xì)胞300μl加入到所需的chamber室里同時(shí)加入VEGF25pM作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS，作為陰性對(duì)照；加入25pM βγ-CAT，50pM βγ-CAT。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。中止培養(yǎng)。倒置顯微鏡下，拍照。
3.細(xì)胞染色和分析用槍頭和棉簽完全移走chamber室內(nèi)朝里面的所有培養(yǎng)基和細(xì)胞。使用試劑盒內(nèi)部提供的結(jié)晶紫染色液，室溫下對(duì)細(xì)胞染色30min。染色結(jié)束后，用PBS清洗3次，并完全浸入去離水中清洗。倒置顯微鏡下，拍照。加入抽提緩沖液，抽提細(xì)胞內(nèi)色素結(jié)晶紫。分光光度計(jì)，550nm波長(zhǎng)讀數(shù)。計(jì)算并比較不同藥物濃度下的細(xì)胞遷移率。
傷口修復(fù)活性測(cè)定(Wound healing assay) 采用人工劃傷模型來(lái)測(cè)定βγ-CAT的體外傷口修復(fù)活性，具體操作步驟如下 1.消化并收集HUVEC，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/ml。接種2ml細(xì)胞懸液至膠原預(yù)鋪被的6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。
2.倒置顯微鏡下，觀察至細(xì)胞完全貼壁，鋪滿培養(yǎng)板底。
3.用200μl槍頭劃線，造成人工的“傷口”模型。PBS清洗去除漂浮的、死亡的細(xì)胞，更換培養(yǎng)基為饑餓培養(yǎng)基。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定2小時(shí)。倒置顯微鏡下，拍照。
4.在HUVEC中，加入βγ-CAT至終濃度為25pM；50pM。設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，HUVEC中加入VEGF 25pM。設(shè)立陰性對(duì)照，加入體積相同的PBS。在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。每隔24小時(shí)，更換一次饑餓培養(yǎng)基，并補(bǔ)充藥物至相應(yīng)的濃度；倒置顯微鏡下，拍照，記錄下“傷口”的閉合情況。
5.持續(xù)觀察72小時(shí)。
6.以上的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。
在倒置顯微鏡下觀察到原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區(qū)域較無(wú)核的區(qū)域突出，細(xì)胞呈單層鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列生長(zhǎng)，并有接觸抑制現(xiàn)象。血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體免疫熒光染色呈陽(yáng)性。表明體外原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成功。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，使用的都是第二代到第三代的HUVEC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果表明，在膠原包被的基質(zhì)上，βγ-CAT能夠誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)。在極低濃度(25pM和50pM)的下，βγ-CAT能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞穿過(guò)膠原鋪被的Boyden chamber的板底面(圖10A左)。25pM濃度下，發(fā)生遷移而穿過(guò)膜底面的細(xì)胞大約為陰性對(duì)照的1.5倍；50pM濃度下，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)量增大為陰性對(duì)照的3倍左右；高于25pM的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)HUVEC細(xì)胞的遷移誘導(dǎo)作用。在倒置顯微鏡下，可以清晰地看到穿過(guò)膜底面的細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖10A右)。
傷口修復(fù)(Wound healing)結(jié)果表明，βγ-CAT能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞在膠原鋪被的基質(zhì)上完成“人工傷口”的閉合。在陰性對(duì)照中，72小時(shí)后，傷口”仍然保持比較大的開(kāi)放狀態(tài)，遷移到傷口面上的細(xì)胞也非常少；在VEGF處理陽(yáng)性對(duì)照中，隨著時(shí)間的推移，過(guò)傷口逐漸變小，72小時(shí)后，“傷口”基本上已經(jīng)合攏。βγ-CAT處理的傷口隨著時(shí)間的增加逐漸閉合，50pMβγ-CAT處理的效果比25pMβγ-CAT處理的效果明顯。72小時(shí)后，50pMβγ-CAT處理的“傷口”基本上接近閉合(圖10B)。
同時(shí)，將拆分的βγ-CAT的α亞基和β亞基分別進(jìn)行細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)活性測(cè)試，結(jié)果表明在100nM的濃度下，未觀察到單獨(dú)的βγ-CAT的α亞基和β亞基具有明顯的上述活性，從而進(jìn)一步表明βγ-CAT的α亞基和β亞基需要協(xié)同作用，才能發(fā)揮其高效的生物學(xué)活性。
目前報(bào)導(dǎo)的重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(rat intestinal epithelial cell Lines，IEC-6)的細(xì)胞遷移能力，但是其所需要的濃度太高，約為83μM。本發(fā)明提供的大蹼鈴蟾創(chuàng)傷修復(fù)和抗腫瘤蛋白βγ-CAT誘導(dǎo)細(xì)胞遷移時(shí)候所需要的濃度僅在皮摩爾(pM)水平，活性比其他報(bào)道的單鏈三葉因子蛋白大約要高一百萬(wàn)倍左右。
實(shí)施例7大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物βγ-CAT通過(guò)囊泡化直接轉(zhuǎn)運(yùn)到人源臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因表達(dá) (一).βγ-CAT誘導(dǎo)人源臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)生囊泡化 1.活體觀察生長(zhǎng)在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HUVEC，觀察狀態(tài)良好后，更換新鮮培養(yǎng)基。穩(wěn)定2小時(shí)。放置于激光共聚焦顯微鏡的二氧化碳培養(yǎng)小室中，培養(yǎng)，拍照。
加入βγ-CAT 30nM，活體觀察HUVEC的細(xì)胞形態(tài)變化。放大倍數(shù)200倍，每隔10秒連續(xù)拍照。
2.中性紅染色生長(zhǎng)在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HUVEC，觀察狀態(tài)良好后，更換新鮮培養(yǎng)基。穩(wěn)定2小時(shí)。加入βγ-CAT 30nM處理細(xì)胞30min，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養(yǎng)基。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3.劑量效應(yīng)生長(zhǎng)在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HUVEC，觀察狀態(tài)良好后，更換新鮮培養(yǎng)基。穩(wěn)定2小時(shí)。加入不同濃度的βγ-CAT(nM)處理細(xì)胞30min，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養(yǎng)基。然后每孔加入100 ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性紅。540nm讀數(shù)。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；設(shè)置對(duì)照孔和凋零孔。陽(yáng)性對(duì)照，NH4Cl 8mM作用18小時(shí)； 陰性對(duì)照，PBS孵育18小時(shí)。
4.NH4Cl依賴實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HUVEC，觀察狀態(tài)良好后，更換新鮮培養(yǎng)基。穩(wěn)定2小時(shí)。分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行4種處理1)PBS，2)PBS和NH4Cl，3)PBS和βγ-CAT，4)NH4Cl和βγ-CAT。作用30min后，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養(yǎng)基。然后每孔加入100ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性紅。540nm讀數(shù)。
(二).βγ-CAT轉(zhuǎn)運(yùn)到人源臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)細(xì)胞核 1.βγ-CAT標(biāo)記熒光染料Cy3，細(xì)胞核定位觀察 熒光染料Cy3標(biāo)記按照試劑說(shuō)明標(biāo)記βγ-CAT分子，并經(jīng)過(guò)G50分子篩分離純化。生長(zhǎng)在35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的HUVEC，觀察狀態(tài)良好后，更換新鮮培養(yǎng)基。放置于激光共聚焦顯微鏡的二氧化碳培養(yǎng)小室中，培養(yǎng)，拍照。加入Cy3標(biāo)記-βγ-CAT 30nM，熒光下實(shí)時(shí)觀察βγ-CAT分子的細(xì)胞定位。放大倍數(shù)200倍，每隔10秒連續(xù)拍照。
2.熒光染料FITC標(biāo)記輕重鏈抗體，37℃條件下對(duì)βγ-CAT輕鏈和重鏈的細(xì)胞定位 2.1βγ-CAT的α和β亞基兔源多克隆抗體的生產(chǎn)新西蘭大白兔耳靜脈采血，分離血清，作為抗血清的陰性對(duì)照。經(jīng)多步驟分離純化的βγ-CAT蛋白質(zhì)在12％SDS-PAGE上電泳，電泳結(jié)束后，分別割下約位于1.8kDa和3.6kDa分子量處的βγ-CAT的α和β亞基條帶，進(jìn)行膠回收。回收蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白濃度，并用磷酸緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為1mg/ml。與同體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化。背部皮下多點(diǎn)注射，免疫新西蘭大白兔，注射8-10點(diǎn)，總體積為400μl。以后每隔10天，用與第一次同等劑量的βγ-CAT與不完全佛氏佐劑的乳化液進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共四次。最末一次免疫后五天，耳緣靜脈取血，分離血清，用免疫酶聯(lián)吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到為1/5000左右時(shí)，處死免疫兔，收集血液。將血液置于37℃保溫1h后于4℃放置過(guò)夜，2,000g離心5min，收集血清。通過(guò)硫酸胺沉淀法，去除非IgG免疫球蛋白質(zhì)。純化抗體溶解于PBS緩沖液中，小量分裝并保存于-20℃，用于實(shí)驗(yàn)。
2.2 FITC分別標(biāo)記α和β亞基抗體用碳酸鈉緩沖液(sodium carbonate buffer，0.1M，pH9)將兔源的βγ-CAT的α和β亞基多克隆IgG抗體的蛋白質(zhì)濃度調(diào)節(jié)到2mg/ml。FITC按照1mg/ml的濃度溶解于DMSO中。每毫升的蛋白質(zhì)溶液，加入50微升的FITC。
每次緩慢的加入5ul的溶液，同時(shí)輕輕的不斷的搖晃。加完所有的FITC后，將混合物置于黑暗中，4℃，反應(yīng)8小時(shí)。加入NH4Cl至終濃度為50mM，4℃孵育2小時(shí)，封閉未結(jié)合的FITC。加入二甲苯青至0.1％，甘油至5％。分子篩(G50)層析分離未結(jié)合的FITC和已標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子。標(biāo)記好的蛋白質(zhì)分子先流出，而二甲苯青和未標(biāo)記的FITC則后流出。4℃避光保存?？杉尤氙B氮鈉至終濃度為15mM。產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的熒光比例可由495nm和280nm的吸收值來(lái)計(jì)算。
3.細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理消化HUVEC，接種于蓋玻片上。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞長(zhǎng)到約90％滿度時(shí)，加入βγ-CAT至終濃度為10nM，分別在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中和4℃的條件下，孵育不同的時(shí)間5min；30min；2h。孵育結(jié)束后中止培養(yǎng)。
4.顯微鏡觀察小心吸走上層培養(yǎng)基。磷酸緩沖液清洗細(xì)胞表面兩次。4％多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫下放置20min。磷酸緩沖液清洗細(xì)胞表面兩次。0.1％Triton-X 100透明，室溫下放置10min。磷酸緩沖液清洗細(xì)胞表面兩次。2％BSA封閉，4℃，過(guò)夜孵育。加入2％牛血清白蛋白稀釋的標(biāo)記抗體(1/200)100μl，室溫下避光放置，1小時(shí)。2％BSA清洗細(xì)胞表面三次。磷酸緩沖液清洗細(xì)胞表面三次。PI染液復(fù)染核，室溫下避光放置5min，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
(三).Western Blot檢測(cè)βγ-CAT的細(xì)胞定位。
3.1藥物處理細(xì)胞在長(zhǎng)至90％滿度的HUVEC株中，加入βγ-CAT至終濃度為25nM，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育30min，中止培養(yǎng)。吸出上層培養(yǎng)基，用磷酸緩沖液清洗兩次貼壁細(xì)胞表面，與上層培養(yǎng)基合并。離心(1000rpm，5min)，棄上清，用磷酸緩沖液洗滌三次，離心。然后加入細(xì)胞裂解液(SIGMA，美國(guó))裂解細(xì)胞沉淀及培養(yǎng)瓶壁的貼壁細(xì)胞，冰上放置15min。吸出細(xì)胞裂解液，加入6×SDS加樣緩沖液，10％SDS-PAGE上電泳，100V，2小時(shí)。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜。
3.2 Western Blot分析Western Blot分析按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行，分別用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CATα亞基和抗-βγ-CAT β亞基多克隆兔源抗體和兔源抗單泛素的(rabbitanti-mono-ubiquitin)單克隆抗體作為一抗，二抗為羊抗兔的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗體(conjugated-HRP goat anti-rabbit antibody)，采用ECL(PIERCE)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)信號(hào)，采用X-膠片壓片顯影。
(四).采用人基因組Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix，USA)RNA芯片分析βγ-CAT對(duì)HUVEC細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 4.1βγ-CAT處理HUVEC，抽提總RNA將βγ-CAT(25nM)加入75cm2培養(yǎng)瓶中的HUVEC(三代之內(nèi)，95％滿度)中，37℃孵育2小時(shí)，按照TRIzol KIT中步驟抽提總RNA，陰性對(duì)照為溶劑對(duì)照。抽提得到的總RNA，用1％瓊脂電泳進(jìn)行分析。
4.2.RNA芯片雜交實(shí)驗(yàn) 1)將抽提的HUVEC總RNA進(jìn)行定量和質(zhì)檢，滿足要求的RNA樣品備用； 2)利用雙輪cRNA擴(kuò)增，生物素標(biāo)記法對(duì)樣品進(jìn)行靶標(biāo)制備，然后用于芯片雜交； 3)用Fluidics Station 450進(jìn)行洗脫和染色，然后用Scanner3000掃描芯片； 4)用GeneChip Operating software(GCOS 1.4)分析軟件對(duì)芯片圖像進(jìn)行分析， 把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。
4.3.芯片數(shù)據(jù)分析將原始數(shù)據(jù)采用dChip3.0軟件做校正和歸一化處理，篩選出信號(hào)值＞100并且P Value值為P和M的檢測(cè)值。
4.4.表達(dá)差異基因的篩選和展示采用SAM3.0軟件對(duì)四次生物學(xué)重復(fù)的芯片配對(duì)進(jìn)行表達(dá)差異性分析，設(shè)定篩選域值為fold change≥3，q value＝0，(false discoveryrate)FDR＝0，共獲得123個(gè)顯著性差異表達(dá)的基因。用Cluster和Treeview來(lái)展示顯著性差異表達(dá)的基因。
結(jié)果表明 1.通過(guò)活體觀察顯示，βγ-CAT能夠誘導(dǎo)HUVEC在10min內(nèi)發(fā)生快速囊泡化。中性紅染色可觀察到明顯的囊泡化(圖11A)，而且βγ-CAT形成的囊泡化是不依賴于NH4Cl的，但在低濃度的NH4Cl的存在下，能夠增強(qiáng)βγ-CAT的囊泡化(圖11B)。當(dāng)βγ-CAT的終濃度為2nM時(shí)，能夠引起HUVEC的最大的囊泡化。以后，隨著濃度的增高，測(cè)量到的囊泡化程度反而降低(圖11C)，這可能是由于高濃度的βγ-CAT直接引起HUVEC的脫落造成活細(xì)胞數(shù)目下降的緣故。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明βγ-CAT能夠通過(guò)囊泡化直接轉(zhuǎn)運(yùn)到HUVEC的細(xì)胞中。
2.分別通過(guò)熒光染料Cy3標(biāo)記βγ-CAT和熒光染料FITC標(biāo)記βγ-CAT的α和β亞基抗體，在激光共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察可見(jiàn)，βγ-CAT被迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到HUVEC細(xì)胞核。在37℃條件下，可見(jiàn)βγ-CAT快速內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，30min時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，2小時(shí)觀察βγ-CAT-α亞基完全集中細(xì)胞核區(qū)域，而βγ-CAT-β亞基主要分布在細(xì)胞核外周區(qū)域(圖12A-B)。
3.βγ-CAT(10nM)37℃ 30分鐘處理HUVEC后，分別采用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CAT-α亞基和抗-βγ-CAT-β亞基兔源多克隆抗體作為檢測(cè)探針，通過(guò)免疫雜交(Western Blot)來(lái)分析βγ-CAT在HUVEC內(nèi)的細(xì)胞核定位。結(jié)果表明，βγ-CAT能夠形成了SDS穩(wěn)定的，分子量為150kDa的大分子復(fù)合物。同時(shí)通過(guò)單泛素的兔源單克隆抗體檢測(cè)到150kDa的大分子復(fù)合物中有泛素化修飾。同時(shí)結(jié)合免疫熒光共聚焦顯微鏡，可觀察到熒光染料Cy3標(biāo)記的單泛素的兔源單克隆抗體熒光信號(hào)與FITC標(biāo)記βγ-CAT-α亞基抗體信號(hào)重合，表明βγ-CAT能夠被單泛素修飾后形成(圖12C)。
4.βγ-CAT(25nM，2小時(shí))處理HUVEC后，引起顯著性差異表達(dá)變化的基因共有123個(gè)，主要集中為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白和細(xì)胞組織重建相關(guān)的金屬蛋白酶等，例如早期生長(zhǎng)反應(yīng)相關(guān)家族因子，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如IL-6，IL-8，IL-1α)，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，核受體亞家族4受體，金屬蛋白酶，Kruppel-like factors和Fos members。這些基因都與細(xì)胞有絲分裂，分化和生長(zhǎng)，以及組織的再生和修復(fù)等基本生命活動(dòng)有密切聯(lián)系。數(shù)據(jù)表明βγ-CAT通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞上述基因的差異表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，遷移和創(chuàng)傷修復(fù)。
序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所
<120>大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物和基因及制法及用途
<160>4
<210>1
<211>336
<212>PRT
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>1
Met Ser Glu Asn Lys Ile Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Ser Phe Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Leu Glu Leu Thr Arg Ser Gln Thr Lys Leu Ala Arg Gln Asn
20 25 30
Phe Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Val Ile Gly Gln Pro Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Thr Gln Asn Phe Phe Lys Gly Glu Ala Arg Val Tyr Glu Glu
50 55 60
Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Asp Val Asp Asn Lys Ile Met Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Leu Ala Ser Leu Gly Asp Pro Val Ile Lys Leu Phe Glu Gly
85 90 95
Gln Ser Leu Ser Gly Lys Ser Ile Val Val Asn Glu Ala Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Phe Gly Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ser Ser Trp Gln Val Leu Ser
115 120 125
Gly Ala Trp Lys Ile Cys Asp Glu Val Lys Asp Asn Pro Arg Tyr Lys
130 135 140
Val Ser Asn Val Ala Asp Met Val Phe His Tyr Ser Glu Thr Gly Leu
145 150 155 160
Ser His Ser Ala Leu Ser Ile Tyr Pro Leu Leu Ala Gly Lys Pro Lys
165 170 175
Leu Thr Thr Asn Val Gln Trp Asp Arg Lys Lys Glu Leu Ser Asn Arg
180 185 190
Val Ser Gln Leu Asp Glu Ile Ile Val Val Asn Lys Ser Lys His Glu
195 200 205
Gln Asp Phe Ser His Ser Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Val Glu Met Lys Phe Ser Asn Glu Thr Thr Ile Glu Leu Gly Ala Ser
225 230 235 240
Phe Lys Val Pro Leu Ile Gly Glu Leu Ser Thr Thr Leu Thr Gln Thr
245 250 255
Ile Ser Ile Glu Lys Gly Lys Thr Glu Gly Thr Ser Thr Thr Val Thr
260 265 270
Asn Lys Val Thr Ile Pro Val Thr Val Pro Ala Asn Thr Lys Val Thr
275 280 285
Ile Asn Val Met Arg Arg Asp Ile Ser Tyr Ser Val Pro Val Glu Ile
290 295 300
Ile Ile Glu Arg Asn Asn Ala Arg Lys Ala Glu Tyr Ala Glu Leu Ile
305 310 315 320
Cys Arg Asp Gly Thr Asp Val His Ile Ser Arg Asn Asp Glu Ala Val
325 330 335
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>2
Met Ala Ser Lys Met Phe Phe Ile Val Thr Ile Ala Leu Ala Ile Gly
-20 -15 -10 -5
Cys Gly His Gly Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu Lys Cys Ala
-1 1 5 10
Val Ala Ala Tyr Asp Arg Ile Ala Cys Pro Gly Asn Thr Lys Glu Gln
15 20 25
Cys Asn Ala Arg Arg Cys Cys Tyr Asp Asn Arg Gln Ser Gly Ala Ile
30 35 40
Trp Cys Phe Arg Gln Arg Asp Leu Arg Pro Gly Cys Tyr Ile Asp Pro
45 50 55 60
Ala Glu Arg Val Gly Cys Ala Gly Glu Gly Val Thr Pro Thr Glu Cys
65 70 75
Arg Glu Lys Gly Cys Cys Phe His Ala Leu Thr Gly His Val Trp Cys
80 85 90
Tyr Lys Leu Asn Glu Ser Glu Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val Pro Ile
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Lys Arg Arg Val Ala Cys Ala Gly Ser Gly Val Thr Ala Ala Glu Cys
110 115 120
Lys Ala Lys Gly Cys Cys Tyr Asn Ser Ser Thr Tyr Asn Thr Ile Trp
125 130 135 140
Cys Phe Arg Pro Gln Val
145
<210>3
<211>1251
<212>DNA
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>3
TTCACATTCT GAAGAGGTAA AATGAGTGAA AACAAAATTA TTTTATATGA TGAGCCCTCA 60
TTTGAAGGTC TGAGCTTAGA ACTCACCAGG TCTCAGACTA AATTGGCTCG TCAAAATTTT 120
TCAAAGGCTG CTTCCTCTCT GCGTGTGATT GGCCAGCCAT GGGTCGCTTA TACTCAAAAC 180
TTCTTTAAGG GTGAAGCACG TGTGTATGAG GAGGGCAGTT ACAGTAATAT TGATGTTGAC 240
AACAAAATCA TGTCTTTATA TCTCATCCTT GCAAATCTGG GGAACCCAGT TATCAAGCTC 300
TTTGAAGGCC AAAGCTTGTC TGGCAAATCC ACTGTGGTGA ACGAAGCAGC TATTCTGAAC 360
TTTGGAAAAC TAGAAAATGG AGCTTCTTCT TGGCAGGTGC TCAGTGGTGC CTGGAAAATA 420
TGCGATGAAG TGAAGGATAA CCCCAGATAC AAGGTATCAA ACGTTGCAGA TATGGTTTTT 480
CATTACTCTG AAACAGGCTT GAGTCACTCA GCGTTAAGTA TTTATCCTCT ATTGGCTGGG 540
AAGCCTAAAC TTACAACAAA TGTCCAGTGG GACAGAAAGA AGGAGCTCAG TAACCGTGTT 600
GGCCAACTAG ATGAGATCAT TGTTGTTAAT AAGTCTAAGC ATGAACAGGA TTTTAGCCAC 660
AGTTCAGGCC GGGACTATAC CTCCAGTCCT GAAGTTGAAA TGAAATTTAG CAATGAAACT 720
ACTATCGAGT TGGGAACAGG CTTTAAGGTT CCTCTGATTG GTGAACTGAG TACCACTTTG 780
ACCCAAACCA TATCCATAGA GAAAGGAAAA ACTGAGGGCA CGTCTACCAC TGTCACCAAC 840
AAAGTGACCA TTCCTGTGAC GGTTCCAGCA AATACTAAAG TCACCATCAA TGTCATGAGA 900
AGAGACATCA GCTACTCTGT CCCAGTAGAA ATAATTATAG AAAGAAACAA TGCGAGGAAG 960
ACAGAATATG CTGAGCTTAT ATGCAGAGAT GGTACAGACG TGCACATCTC CCGAAATGAT 1020
GAGGCTGTTT AATCCTAAAA CTCCAAAGCA ACAAGAGACA GAAGATAGTG GTCTGATCTT 1080
TATTACTGGC AATAGAAGAC ATGTCCACAT CAGATTGTGC TAACTCTTCA AGTTATAAAT 1140
AGCTGCCCCT ACAACACCTT AAGGCTTGTA TCAGTATATA CCATACTGGG GCTGAACTCA 1200
CTGAACCATC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1251
<210>4
<211>1830
<212>DNA
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>4
TGTCTATTTT GTTGCATTTT CATGGCAAGC AAGATGTTCT TCATAGTGAC AATAGCATTG 60
GCTATTGGCT GTGGCCATGG ATTTTCAGAC CTTCAGATAG GTAGTCTGAA GTGTGCAGTT 120
GCAGCATATG ACAGAATTGC ATGTCCTGGA AATACAAAAG AACAATGCAA TGCCAGGCGG 180
TGTTGTTATG ATAATAGGCA ATCTGGTGCA ATCTGGTGCT TTAGACAAAG AGATCTCAGA 240
CCTGGATGCT ATATTGACCC TGCAGAAAGA GTTGGATGTG CAGGCGAAGG AGTGACACCC 300
ACTGAATGCA GGGAGAAAGG CTGCTGTTTT CATGCATTAA CTGGTCATGT TTGGTGCTAT 360
AAACTTAACG AATCAGAGGA TGCCTGGAAA TGTGCTGTCC CTATCAAACG GAGAGTTGCA 420
TGCGCTGGCT CAGGCGTCAC AGCTGCTGAG TGCAAGGCAA AAGGTTGTTG TTACAATTCA 480
AGCACCTACA ATACCATATG GTGCTTTAGA CCTCAAGTAT AACTGATCTA TAAAATGGAA 540
TTGTTCAGGT GTTCAAGATG AGAACAAGGT TGAAGATTAG TGAAGAATTC CTCTTCAATC 600
TAGTGATTTC TTTTTTTTGT GCTAAACCTA ACAATGATTT AAATTATATT CTTTCTCAGA 660
TGTATGTTCC CTCTAAGGCA TAAGAATGTG CATGCTGTTA TTGAACGTTT AGGGCTATAT 720
TACAAGAGGC ACGCTATTGC TAACGCGGGT CACAATATCC AATATCGCAA CTGTGCTAAC 780
CTGTGCACAT ATTACAAGTT GAAAGGAAAC GGGTGAGCTT GTGCGTAAAT AAATTTGCGG 840
TTGTTGGGTT AGAGGTTACC GTAAAGAATA GAGTGCACCA AACACAACAT AAATACATTA 900
ATATCAAGTG TTACACTCAT ATATATACAC CATCTGATAA CAATTATTTA TATCAATATT 960
AAGAAAATAT TTTTAGAAGG GTTTAAAGGT ATATGGTAAT TATGTAGGGT GACCATGTTG 1020
CCGCTTTGGA AGGGGACACA TGTGTGTTTT TCATGTGTGT CCCTTTTTGA AGCGGCAGTG 1080
TGGTCAGCCT AGGTATATGT ATAAGTTTAA ATGTGTGTGT GTGAATATAT ATATATATAT 1140
ATATATATAT ATATATTAAC AATGTGGGGT CAAGCACTCA CGACACTGAT AATCCAATGC 1200
CCCAGGTGCA GTCCTGACAA TAGTATACAC AGTTTCGGGA GGGCAAGGAA GAGGTGCTCT 1260
CACGGGGTCT TTAGTGGATA TGGGAATGAA ACCCATGTTT GTTGAGGACC CCGTGGGTGT 1320
GCCTCTTTTT TGCCTTCTTG AAATTGTGTA TATATATATA TATATATATA TATATATATT 1380
GTATATACAT GTGTATTTAT GTATTTATAT ATGTATATGC ATACATATAT GTACACAAAT 1440
TAACACATAT GTATAGACAT ATACACACAC ACACACATAT ATACATATAT ATATATATAT 1500
GTATATATAT ATATACACAC ACGCTTTGGA GGCCTTTCCA CTCAAATACC TTAAAACATG 1560
TAAAATAATT TTTAAAAATG TTAATATTTT ATAATGGGCC AGATTACAAG TGGAGCACAA 1620
ATTAATGCTT CAGCTTGAGC ATTAATTGCT CTAGAAGTAA GCTTTATTGC GCTTGTTGGG 1680
TTGCACTCGT ATTACAAGTT AAAAAGTAAA CTCTATTGGC TCTTGCGCTA AACCGACACG 1740
CACAAAAGCC GAAGTTAGAA TATCACGTGC ACGTTCACGT ATTCCCCCAT AGAAGTCAAT 1800
GAAGAAAAAA AAGTTAAAAA AAAAAAAAAA 1830
權(quán)利要求
1.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物，其特征在于其分子量為72kDa，由兩種類型的α和β亞基，按αβ2的分子形式以非共價(jià)鍵連接而成，其α亞基由336個(gè)氨基酸殘堝組成，其氨基酸序列為SEQ ID NO1；其成熟β亞基由146個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。
2.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的基因，其特征在于編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的α亞基的基因由1251個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為SEQ ID NO3，對(duì)應(yīng)的編碼其成熟的α亞基蛋白為SEQ ID NO3中第22-1029位核苷酸，其編碼相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ IDNO1；編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的β亞基的基因由1830個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為SEQ ID NO4，對(duì)應(yīng)的編碼其成熟的β亞基蛋白為SEQ ID NO4中第82-519位核苷酸，其編碼相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
3.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物的制備方法，其特征在于從中國(guó)特產(chǎn)兩棲動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚中分離純化得到。
4.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復(fù)合物為一類新的ATPase和GTPase，可用于生物醫(yī)學(xué)試劑制備和制藥。
5.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復(fù)合物在抗腫瘤制藥中的應(yīng)用。
6.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復(fù)合物在創(chuàng)傷修復(fù)制藥中的應(yīng)用。
7.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復(fù)合物從細(xì)胞外經(jīng)泛素化修飾，能夠直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控，可用于生物醫(yī)學(xué)試劑制備和制藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復(fù)合物和基因及制法及用途。其天然表觀分子量為72kDa，由α亞基和β亞基按αβ2的分子形式以非共價(jià)鍵連接而成，為一類新的ATPase和GTPase酶，具有多種細(xì)胞生物活性，在體外納摩爾水平能夠殺死多種腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞脫落和凋亡。在皮摩爾水平具有促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的活性。在細(xì)胞外經(jīng)單泛素化修飾，能夠直接轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控從而調(diào)節(jié)細(xì)胞狀態(tài)，包括細(xì)胞遷移、脫落、生長(zhǎng)。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物提供了非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細(xì)胞生物學(xué)功能及其能夠與三葉因子蛋白協(xié)同作用的機(jī)制，可應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)試劑制備和抗腫瘤以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)制藥。
文檔編號(hào)A61K38/43GK101230339SQ200810058028
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月14日
發(fā)明者云 張, 劉樹(shù)柏, 何英英, 李文輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所