專利名稱:含有余甘根苷b的藥物組合物及其藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域,具體地,涉及一種以從葉下 珠屬藥用植物余甘子中分離提取的倍半萜類余甘根苷B(PhyllaemblininB)為有效成分的藥物組合物,及其在制備抗柯薩奇 病毒B3藥物中和在制備治療病毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù):
柯薩奇病毒B3是正鏈RNA病毒,屬于小RNA病毒 科,腸道病毒屬??滤_奇病毒B3是引起病毒性心肌炎的主要病原體, 可經(jīng)呼吸道和消化道感染。病毒性心肌炎是以心肌細(xì)胞變性壞死、 間質(zhì)單個(gè)核細(xì)胞浸潤為主要病變的一種臨床常見病,在兒童和青少 年中高發(fā),嚴(yán)重危害人類健康。目前,西醫(yī)臨床治療病毒性心肌炎 的主要方法是使用普通抗病毒藥、免疫抑制劑、干擾素及心肌細(xì)胞 營養(yǎng)劑等,但療效并不理想。近年來大量研究表明,中藥在病毒性 心肌炎的臨床治療中顯示出極大優(yōu)勢。目前臨床上針對病毒性心肌 炎的中成藥只有個(gè)別品種,大多為醫(yī)生自擬的處方湯藥或復(fù)方粗提 物,急需開發(fā)出有針對性,有效成分清楚,作用機(jī)制明確,療效肯 定,劑型先進(jìn),服用攜帶方便,質(zhì)量穩(wěn)定可控的中藥制劑?,F(xiàn)有技 術(shù)中未見有從中藥中分離出來的倍半萜類成分余甘根苷B(Phyllaemblinin B)具抗柯薩奇病毒B3及治療病毒性心肌炎的藥理 作用的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供以從葉下珠屬藥用植物余甘 子中分離提取的倍半萜類余甘根苷B (Phyllaemblinin B)為有效成分 的藥物組合物,及其在制備抗柯薩奇病毒B3藥物中和在制備治療病 毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的,本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 藥物組合物,其中含有治療有效量的余甘根苷B,和/或藥物學(xué) 上可接受的載體?;衔镉喔矢誃在制備抗柯薩奇病毒B3藥物中的應(yīng)用。 化合物余甘根苷B在制備治療病毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明以柯薩奇病毒B3毒株(CVB3)和HeLa細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象 進(jìn)行藥效試驗(yàn)。在HeLa細(xì)胞上進(jìn)行的體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明,本 發(fā)明藥物的TCso為50.3(Hig/mL,對CVB3病毒的IC50為7.75貼/mL, 治療指數(shù)(TI)為6.49,表明本發(fā)明藥物體外對CVB3病毒有顯著 抑制作用。采用不同給藥方式觀察倍半萜類成分余甘根苷B的對抗柯薩奇 病毒B3的活性。結(jié)果證明,(1)倍半萜類成分余甘根苷B對CVB3 感染的細(xì)胞具有預(yù)防作用;(2)倍半萜類成分余甘根苷B對CVB3 感染的細(xì)胞具有治療作用;(3)倍半萜類成分余甘根苷B對CVB3 具有直接殺傷作用?;谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,本發(fā)明證實(shí)了倍半萜類成分余甘根苷B具 有預(yù)防和治療柯薩奇病毒B3感染引起的疾病的新用途,可用于制備 抗柯薩奇病毒B3及治療病毒性心肌炎的藥物。
圖1為正常細(xì)胞對照組的顯微鏡圖U00x); 圖2為病毒對照組的顯微鏡圖(lOOx); 圖3為陽性藥物病毒唑?qū)φ战M的顯微鏡圖(100x); 圖4為倍半萜余甘根苷B試驗(yàn)組顯微鏡圖(100x)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容做進(jìn)一步闡述,但 不以此對本發(fā)明有任何限定。實(shí)施例l:從余甘的根中提取制備甘根苷B (PhyllaemblininB)。(1) 余甘根原料去雜、洗凈、烘干、粉碎成過30目篩的粗粉。(2) 上述粗粉1.77 kg用80%含水丙酮冷浸提取3次,每次浸 提取時(shí)間2天,過濾、合并濾液、減壓濃縮、回收溶劑(可用于反 復(fù)提取)。(3) 上述殘留水溶液,進(jìn)一步濃縮至小體積后,用正丁醇 U-BuOH)萃取3次,合并正丁醇層液、減壓濃縮、回收溶劑。(4)上述正丁醇萃取物(30.6 g),以薄層層析法檢測指導(dǎo)洗 脫(薄層層析的條件為氯仿-甲醇-水(7:3:0.5)為展開劑,10%的 硫酸水溶液為顯色劑,加熱顯色),通過多種柱層析手段,包括硅 膠G柱層析(氯仿-甲醇-水梯度洗脫),以及Diaion HP20S& Sephadex LH-20、 MCI gelCHP20P、 Chromatorex ODS等反相柱層析(以不同 濃度的甲醇梯度洗脫),從中得到余甘根苷B(PhyllaemblininB)(80 mg)。上述余甘根苷B (Phyllaemblinin B)的物理常數(shù)和光譜數(shù)據(jù) 余甘根苷B (Phyllaemblinin B):分子式C33H44019分子量744結(jié)構(gòu)式性狀淡黃色粉末;易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水。旋光[a]D26 10.4° (c 0.58, MeOH) 紅外光譜v咖x(KBr)cm":3206, 2933, 1778, 1718, 1604, 1452, 1294, 1124, 1012. 紫外光譜Xmax (MeOH) nm (log s):279 (2.91), 272 (2,99). 質(zhì)譜(FAB+-MS): 767 [M+Na]+, 745 [M+H]+ 元素分析for C33H44019'5/2 H20,計(jì)算值C 50.13%, H 5.91%;實(shí)測值C 50.19%, H 6.25%. & NMR (氖代甲醇中,500 MHz):s 8.16 (2H, dd, / = 7.5, 1.5 Hz, H-3',7'), 7.66 (IH, br t, J = 7.5 Hz, H-5'), 7.57 (2H, br t, / = 7.5 Hz, H曙4',6'), 5.36 (1H, q, J= 3.0 Hz, H國IO), 4.29 (IH, br s, H-5), 4.03 (IH, t /= 11.0 Hz, H國12a), 3.93 (IH, br s, H-l), 3.58 (IH, br d, J = 11.0 Hz, H-12b), 2.94 (IH, tt,/- 13.5, 2.5 Hz, H-3), 2.36 (IH, br d,13.5 Hz,H-4a), 2.28 (1H, dd, / = 15.0, 3.0 Hz, H-9a), 2.18 (1H, m, H-ll), 2.01 (1H, dd, J = 15.0, 3.0 Hz, H-9b), 2.04 (1H, br d, J = 13.5 Hz, H-2a), 1.90 (1H, dt, / = 13.5, 4.0 Hz, H國4b), 1.77 (1H, dt, J = 13.5, 2.5 Hz, H-2b), 0.89 (3H, d, / = 7.0 Hz, H誦14); inner glucose: 5.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, glc H-l), 4.08 (IH, dd, </ = 9.0, 8.0, glc H畫2), 3.89 (IH, dd, J = 12.0, 2.5 Hz, glc H-6a), 3.75 (IH, dd, J = 12.0, 5.0 Hz, glc H-6b), 3.62 (IH, t, / = 9.0 Hz, glc H-3), 3.46 (IH, dd, J = 9,5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.39 (IH, m, glc H-5); terminal glucose: 4.18 (IH, d, / = 8.0 Hz, glc H-l), 3.62 (IH, dd, / = 12.0, 2.5 Hz, glc H畫6a), 3.56 (IH, dd, J = 12.0, 4.5 Hz, glc H-6b), 3.25 (IH, dd, J = 9.5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.23 (IH, dd, /= 9.5, 9.0 Hz, glc H-4), 3.11 (IH, dd, J= 9.0, 8.0, glc H-2), 2.76 (IH, m, glc H-5).13C NMR (氖代甲醇中,125 MHz): S 213.7 (C-7), 175.8 (C-13), 167.8 (C-l'), 134.4 (C-5'), 132.1 (C國2'), 130.8 (C國3', 7'), 129.9 (C-4', 6'): 100.5 (C-8), 76.3 (C-5), 75.4 (C-6), 71.5 (C-l), 70.9 (C-10), 63.4 (C-12), 34.3 (C-ll), 32.7 (C-9), 32.2 (C-2, 3), 29.3 (C-4), 13.1 (C陽14); inner glucose: 93.7 (glc C-1) 83.1 (glc C-2), 78.9 (glc C-5), 77.8 (glc C-3), 70.8 (glc C-4), 62.3 (glc C畫6); terminal glucose: 105.9 (glc C-1), 77.7 (glc C-3), 77.6 (glc C-5), 75.9 (glc C-2), 70.7 (glc C-4), 62.0 (glc C-6);下述的制劑實(shí)施例是按實(shí)施例1的方法先制得化合物余甘根苷B,按常規(guī)制成注射液、粉針劑、口服液以及加入賦形劑的粉劑、制粒壓片、膠囊。[制劑實(shí)施例1]片劑按照本領(lǐng)域已知的方法制備片劑,每片含有下述成分化合物余甘根苷B 50mg乳糖 70mg硬脂酸鎂 3mg聚乙烯吡咯烷酮 7mg合計(jì) 130mg若需要,片劑可用羥丙基甲基纖維素、滑石和著色劑進(jìn)行膜包覆。[制劑實(shí)施例2]膠囊按照本領(lǐng)域已知的方法制備膠囊劑,每個(gè)膠囊中含有下述成分-化合物余甘根苷B 50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸鎂 1mg聚乙烯吡咯垸酮 4mg合計(jì) 150mg[制劑實(shí)施例3]注射劑按實(shí)施例1-8的方法先制得本發(fā)明化合物余甘根苷B,取余甘根 苷B按本領(lǐng)域已知的方法制備注射劑,加注射用水,精濾,灌封滅菌 制成注射液。[制劑實(shí)施例4]粉針劑按實(shí)施例1的方法先制得余甘根苷B,將其溶于無菌注射用水 中,攪拌使溶,用無菌抽濾漏斗過濾,再無菌精濾,分裝于2安瓿中, 低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。[制劑實(shí)施例5]粉劑將所分離得到的余甘根苷B與賦形劑重量比為9:1的比例加入賦 形劑,制成粉劑。[制劑實(shí)施例6]口服液按實(shí)施例1的方法先制得余甘根苷B,按常規(guī)口服液制法制成口 服液。[制劑實(shí)施例7]:按實(shí)施例1的方法先制得余甘根苷B按其與賦形劑重量比為5:1 的比例加入賦形劑,制成膠囊或顆粒劑或沖劑。下述的試驗(yàn)例可進(jìn)一步說明本發(fā)明所述倍半萜類成分余甘根苷B 及其藥物組合物的有益效果,試驗(yàn)例包括了本發(fā)明的藥效學(xué)試驗(yàn)等。試驗(yàn)例h倍半萜類成分余甘根苷B對柯薩奇病毒B3 (CVB3)感染HeLa 細(xì)胞的影響試驗(yàn)。 細(xì)胞毒性試驗(yàn)將培養(yǎng)生長良好的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入96孔培養(yǎng)板中 待其貼壁,24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液。分組如下正常對照組每孔加入細(xì)胞維持液lOOpL;陽性藥物病毒唑?qū)φ战M每孔加入梯度稀釋的病毒唑溶液10(HlL,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔;給藥組加入梯度稀釋的倍半萜余甘根苷B溶液10(HlL/孔,每個(gè) 稀釋度四個(gè)復(fù)孔;在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生存情況,按照四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)法計(jì)算本發(fā)明藥物對HeLa細(xì)胞的TCso??箍滤_奇病毒B3試驗(yàn)將培養(yǎng)生長良好的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入96孔培養(yǎng)板中 待其貼壁,24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液。分組如下正常對照組每孔加入細(xì)胞維持液10(HlL;病毒對照組每孔加入CVB3病毒液100pL,設(shè)四個(gè)復(fù)孔;陽性藥物病毒唑?qū)φ战M每孔加入梯度稀釋的病毒唑溶液和CVB3 病毒液各50pL,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔;給藥組每孔加入梯度稀釋的倍半萜余甘根苷B溶液和CVB3病 毒液各50pL,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后在倒置相差顯微鏡下觀察,HeLa細(xì)胞被CVB3病毒感染后,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、變圓、碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象, 給藥后如藥物有效,就可以降低被病毒感染細(xì)胞的死亡率。按照四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法計(jì)算本發(fā)明藥物對HeLa細(xì)胞的IC50。結(jié)果倍半萜類成分余甘根苷B和病毒唑的TC5Q分別為50.30貼/mL和425.97貼/mL,對CVB3病毒的ICso分別為7.75pg/mL 和20.30pg/mL,治療指數(shù)(TI)分別為6.49和20.98,表明本發(fā)明藥 物體外對CVB3病毒有顯著抑制作用。 試驗(yàn)例2.:倍半萜類成分余甘根苷B不同加藥方式對柯薩奇病毒B3 (CVB3) 感染HeLa細(xì)胞的影響試驗(yàn)。倍半萜類成分余甘根苷B對細(xì)胞的保護(hù)作用將培養(yǎng)生長良好的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入96孔培養(yǎng)板中 待其貼壁,24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液。分組如下正常對照組每孔加入細(xì)胞維持液10(HlL;病毒對照組每孔加入細(xì)胞維持液100pL,孵育1小時(shí),棄去上清,用PBS溶液清洗三次,加入CVB3病毒液100pL/孔培養(yǎng),設(shè)四個(gè)復(fù)孔;陽性藥物病毒唑?qū)φ战M每孔加入梯度稀釋的病毒唑溶液100pL,孵育l小時(shí),棄去上清,用PBS溶液清洗三次,加入CVB3病毒液100tiL/孔,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔;給藥組每孔加入梯度稀釋的倍半萜余甘根苷B溶液10(HiL,'孵 育1小時(shí),棄去上清,用PBS溶液清洗三次,加入CVB3病毒液100pL/ 孔,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后在倒置相差顯微鏡下觀察,HeLa細(xì)胞被CVB3病 毒感染后,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、變圓、碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象, 給藥后如藥物有效,就可以降低被病毒感染細(xì)胞的死亡率。CPE法觀察記錄結(jié)果。CPE (cytopathic effect,細(xì)胞病變效應(yīng)),是指常規(guī)于倒置顯微鏡下觀察試驗(yàn)細(xì)胞病變狀態(tài)。倍半萜類成分余甘根苷B對柯薩奇病毒B3增殖的影響 將培養(yǎng)生長良好的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入96孔培養(yǎng)板中待其貼壁,24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液。分組如下正常對照組每孔加入細(xì)胞維持液lOOpiL;病毒對照組每孔加入CVB3病毒液100pL,孵育1小時(shí),棄去上 清,用PBS溶液清洗三次,加入細(xì)胞維持液100pL/孔培養(yǎng),設(shè)四個(gè)復(fù) 孔;陽性藥物病毒唑?qū)φ战M每孔加入CVB3病毒液100nL,孵育1 小時(shí),棄去上清,用PBS溶液清洗三次,加入梯度稀釋的病毒唑溶液 100pL/孔,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔;給藥組每孔加入CVB3病毒液100pL,孵育1小時(shí),棄去上清, 用PBS溶液清洗三次,加入梯度稀釋的倍半萜余甘根苷B溶液lOOpL/ 孔,每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后在倒置相差顯微鏡下觀察,HeLa細(xì)胞被CVB3病 毒感染后,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、變圓、碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象, 給藥后如藥物有效,就可以降低被病毒感染細(xì)胞的死亡率。CPE法觀 察記錄結(jié)果。倍半萜類成分余甘根苷B對柯薩奇病毒B3的直接殺傷作用 將培養(yǎng)生長良好的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,加入96孔培養(yǎng)板中 待其貼壁,24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液。分組如下正常對照組每孔加入細(xì)胞維持液lO(HlL;病毒對照組細(xì)胞維持液與CVB3病毒液各50ul混合后,置37'C作用1小時(shí)后,將孵育液加入細(xì)胞孔中培養(yǎng),設(shè)四個(gè)復(fù)孔;陽性藥物病毒唑?qū)φ战M梯度稀釋的病毒唑溶液與CVB3病毒液各50ul混合后,置37'C作用1小時(shí)后,將孵育液加入細(xì)胞孔中培養(yǎng),每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔;給藥組梯度稀釋的倍半萜余甘根苷B溶液與CVB3病毒液各50ul混合后,置37'C作用1小時(shí)后,將孵育液加入細(xì)胞孔中培養(yǎng),每個(gè)稀釋度四個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48小時(shí)后在倒置相差顯微鏡下觀察,HeLa細(xì)胞被CVB3病 毒感染后,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞皺縮、變圓、碎裂、脫落等細(xì)胞病變現(xiàn)象, 給藥后如藥物有效,就可以降低被病毒感染細(xì)胞的死亡率。CPE法觀 察記錄結(jié)果。結(jié)果倍半萜類成分余甘根苷B不同加藥方式均能降低HeLa細(xì) 胞由柯薩奇病毒B3引起的細(xì)胞病變,見表l。表1:倍半萜類成分余甘根苷B不同加藥方式抗柯薩奇病毒B3的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果濃度 預(yù)防作用 治療作用 直接殺傷作用(ug/ml)余甘根苷B病毒唑余甘根苷B病毒唑余甘根苷B 病毒挫病毒對照組++++,正常對照組一注"ND"為沒設(shè)的濃度;CPE等級"+"為細(xì)胞病變25%以下;"++"為細(xì)胞病變25 % 50 % "+++"為細(xì)胞病變50 % 75 % "++++ 為細(xì)胞病變75 %以上。25 +12.5 ++6.25 +++3.13 +++1.56 ++++0.78 ++++++ N++ N+++ N++++ +++++ ++++++ ++ND ++ND +++ ND+++ +++++ +++++ ++ND +++ND +++ND +++++ +++ +++ ++++ ++++D D DN N ND D DN N N+ ++D D DD D DN N N
權(quán)利要求
1、藥物組合物,其中含有治療有效量的余甘根苷B和/或藥物學(xué)上可接受的載體。
2、 權(quán)利要求1化合物余甘根苷B在制備抗柯薩奇病毒B3藥物 中的應(yīng)用。
3、 權(quán)利要求1化合物余甘根苷B在制備治療病毒性心肌炎藥物 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以倍半萜類化合物余甘根苷B(Phyllaemblinin B)為活性成分的藥物組合物,該化合物可從葉下珠屬藥用植物余甘子中提取分離,本發(fā)明還提供該藥物活性成分在制備抗柯薩奇病毒B3藥物中的應(yīng)用,以及在制備治療病毒性心肌炎藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/12GK101229179SQ200810058110
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月22日
發(fā)明者哲 任, 張美英, 張穎君, 朱宏濤, 楊崇仁, 東 王, 王一飛, 王亞峰, 王曉燕 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所