專利名稱：：一個蒲公英木質(zhì)素酸用于抑制乙酰膽堿酯酶的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及有機化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及從多種蒲公英藥材中分離得到的一個木質(zhì)素酸用于防治老年性癡呆的藥物用途。該化合物，即蒙古蒲公英酸A具有強效抑制乙酰膽堿酯酶的生物活性，因此該化合物及其可藥用的鹽，以及含有該化合物的藥物組合物，可預(yù)期作為防治老年性癡呆藥物用途。
背景技術(shù)：
：蒲公英藥材為菊科植物蒙古蒲公英蒲公英(7krarac，，，2ic鵬Hand-Mazz)或同屬數(shù)種植物的干燥全草，為清熱解毒中藥，臨床上常用于治療急性乳腺炎、淋巴腺炎、疔毒瘡腫、急性結(jié)膜炎、感冒發(fā)熱、急性扁桃體炎、急性支氣管炎、肝炎、腫囊炎及尿路感染等疾病。現(xiàn)代天然產(chǎn)物化學(xué)對蒲公英屬植物的化學(xué)成分和生物活性研究發(fā)現(xiàn)，該生藥具有高效的抗炎作用，具有較高的研究和開發(fā)價值。乙酰膽堿酯酶(AChE)又稱為真性或特異性膽堿酯酶，位于神經(jīng)細胞、骨骼肌、平滑肌、各種腺體和血紅細胞。乙酰膽堿(ACh)在腦中維持一定的水平對人體記憶功能有重要作用。AChE在腦內(nèi)的生理作用是迅速使乙酰膽堿水解并失活。所以，抑制乙酰膽堿酯酶是治療老年性癡呆的方法之一。根據(jù)抗炎藥物可以影響老年性癡呆疾病發(fā)展的思路，我們從菊科蒲公英屬植物之根、莖、葉、花各部位提取物中，用乙酰膽堿抑制作用為篩選指標，活性追蹤提純其最有效抑制乙酰膽堿酯酶的部位，并從中得到抑制乙酰膽堿酯酶作用最強的單體化合物，經(jīng)化學(xué)測定其結(jié)構(gòu)為蒙古蒲公英酸A，從而提供了可期待用于制備與乙酰膽堿缺失引起或有關(guān)的生理改變或疾病的治療藥物及預(yù)防保健品。其中，與乙酰膽堿缺失引起或有關(guān)的生理改變或疾病包括但不限于老年性癡呆癥(俗稱阿茲海莫癥，Alzeimer'sDisease)。本發(fā)明說明從清熱解毒的中藥資源中發(fā)現(xiàn)新的老年性癡呆藥物尤其是乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物具有實際的應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供蒙古蒲公英酸A的乙酰膽堿酯酶抑制活性。本發(fā)明的另一目的是提供蒙古蒲公英酸A及其可藥用的鹽用于制備預(yù)防和治療由乙酰膽堿(ACh)在腦中缺失造成的人體記憶功能障礙和與之相關(guān)疾病，特別是老年性癡呆的藥物用途。本發(fā)明的另一目的是提供了含有蒙古蒲公英酸A的藥物組合物。本發(fā)明通過從菊科蒲公英屬植物中提取制備得到所述的木質(zhì)素酸化合物，具體結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>稱為蒙古蒲公英酸A，即"6，9，IO-三羥基-氧雜蒽-1，2-二羧酸"。蒙古蒲公英酸A來源于菊科植物蒲公英的各個部位，優(yōu)選從中國藥品市場上常見的蒲公英藥材，例如蒙古蒲公英(TaraxacummongolicumHand-Mazz)、堿地蒲公英(TaraxacumsinicumKitag)、熱河蒲公英(TaraxacumplatypecidumDiels)、東北蒲公英(TaraxacumohwianumKitag)、反複蒲公英(TaraxacumgrypodonDahlst)、興安蒲公英(TaraxacumfalcilobumKitag)制備而得。優(yōu)選藥材的全草，包括根莖、葉、花，可以是干品或鮮品。最優(yōu)選蒙古蒲公英和/或堿地蒲公英的全草部分，本發(fā)明之說明書中均簡稱蒲公英。以往的植物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蒲公英屬植物中主要含有三萜類、香豆素類、酚酸類(包括含酚羥基的黃酮類)、倍半萜類、植物甾醇類、胡蘿卜素類和長鏈脂肪酸類化合物。本發(fā)明人以乙酰膽堿酯酶抑制率為生物活性篩選模型，對該植物的各提取部位進行篩選，并通過多種正、反相層析手段對最強效抑制乙酰膽堿酯酶部位跟蹤篩選得到該有效抑制乙酰膽堿酯酶的活性化合物，并經(jīng)紅外、質(zhì)譜、紫外和核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)為木質(zhì)素酸化合物。本發(fā)明得到的該木質(zhì)素酸成分，即蒙古蒲公英酸A具有強效抑制乙酰膽堿酯酶的作用，提供了可期待用于制備與乙酰膽堿缺失引起或有關(guān)的生理改變或疾病的治療藥物及預(yù)防保健品，包括但不限于防治老年性癡呆癥的醫(yī)藥或保健品用途。本發(fā)明的蒙古蒲公英酸A或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學(xué)上常用的輔料或載體結(jié)合，制備得到具有蒙古蒲公英酸A抑制活性從而可以用于防治老年性癡呆疾病的藥物組合物。上這種藥物組合物可以采用片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑等劑型藥物；還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的有益之處是蒲公英為中藥常見藥材，從中提取分離強效的乙酰膽堿酯酶抑制劑，其制備過程簡便、成本低廉、低污染，并且符合醫(yī)藥市場上回歸自然的趨勢，因此具有較好的市場化前景。具體實施方式下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。必須說明，下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分數(shù)是重量百分數(shù)。實施例l:蒙古蒲公英酸A的制備(1)儀器與試劑熔點用北京泰克公司生產(chǎn)的顯微熔點儀測定，溫度未校正；旋光在日本產(chǎn)Polax-2L型自動旋光儀上測定；紅外光譜(IR)由BrukerVector-22紅外光譜儀測定，經(jīng)KBr壓片；紫外光譜用ShimadzuUV-240紫外分光光度計測定；核磁共振氫譜CH-NMR)，核磁共振碳譜。C-NMR)和二維核磁共振波譜(2DNMR)由IN0VA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIANINOVA-400MHz)測定(四甲基硅醚為內(nèi)標)；電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)由BrukerEsquire3000+質(zhì)譜儀測定，柱層析用硅膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用硅膠GF254(10-40目)均購自青島海洋化工廠；柱色譜用聚酰胺(14-30目和100-200目)采用浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠產(chǎn)品；葡聚糖凝膠(S印hadexLH-20)采用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司產(chǎn)品；反相硅膠(RP-18)采用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日本三菱化工公司產(chǎn)品；所用試劑均為分析純，其中石油醚沸程為60-9(TC;薄層制備層析(PTLC)采用Merck公司的鋁箔硅膠板，薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇、2%三氯化鐵-甲醇、磷鉬酸以及溴甲酚綠溶液。(2)植物來源與鑒定供提取用蒲公英藥材為蒙古蒲公英(7araX3CW歷7Z70/7^h'CLffl7Hand.-Mazz.)的全草(2001年8月購于安徽亳州藥材市場)。(3)提取與分離樣品(干重5.0公斤)粉碎后用75%工業(yè)酒精沸水下熱提兩次，提取液冷卻后合并，經(jīng)減壓濃縮得462克棕褐色粘稠狀粗提物。將粗提物用甲醇溶解，大孔樹脂(D-101型)拌樣，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓除去甲醇，以變色硅膠為干燥劑，4(TC真空干燥過夜，加樣到水平衡好的D~101柱中，收集50%甲醇-水洗脫部位，將洗脫液濃縮至干，再用蒸餾水制成懸浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有機層減壓蒸干后分別得3克，32克，127克浸膏，余為水部位。(4)各提取部位對乙酰膽堿酯酶的活性測定將雄性Wistar大鼠斷頭處死，迅速分出大腦，分離紋狀體并稱重，加19倍體積的0.05摩爾/升磷酸緩沖液(pH7.2，大約7毫克蛋白/毫升)用勻漿器勻槳。取混懸液25微升加1毫升溶劑或不同濃度的試驗藥物，在37'C水浴中預(yù)孵10分鐘。加入10毫摩爾濃度二硫一雙硝基苯甲酸10微升，405nm波長處比色。以他克林(Tacrine)為陽性對照，測試了蒲公英石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位粗提物對AChE的抑制活性。發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯部位在0.05毫克/毫升濃度下對AChE活性最強，有28%的抑制活性。陽性對照他克林在0.001毫克/毫升濃度下對AChE抑制率為91.2%。(5)蒲公英酸A的分離純化取蒲公英乙酸乙酯部位浸膏82克置于硅膠柱(900克，200-300目)中，以氯仿-甲醇(1:0—0:1)為洗脫劑梯度洗脫，根據(jù)薄層層析TLC情況共分6個部位(F1-F6)。按上述方法對各部位進行乙酰膽堿酯酶抑制活性追蹤檢測，結(jié)果顯示對藥效活性最強的部位集中在F6部位，由此判斷強效抑制AChE活性的物質(zhì)集中在該F6部位。取F6(1克)用葡聚糖凝膠(100mL)柱層析，以甲醇洗脫，并經(jīng)水一醇重結(jié)晶得到化合物l(12.2毫克)。(6)蒙古蒲公英酸A的結(jié)構(gòu)鑒定化合物l:紅色無定型粉末；ClfiH,08;紫外入，(紫外)196,226，276，317，373nm;紅外K盟J(cnf'):3400，1721，1608，1520;ESI-MSy7/z:353[M-H]—;核磁共振氫譜(DMS0-A，400MHz):《8.05(1H，單峰，H-7)，7.46(1H，雙峰，/=8.8Hz,H-6)，7.40(1H，單峰，H-6')，7.25(1H，雙峰，/二8.8Hz,H-5),6.62(1H，單峰，H-3');核磁共振碳譜(DMS0-A，100MHz):"71.6(s,C-9，)，167.8(s，C-9)，148.6(s，C-4')，146.4(s,C-2，)，142.l(s，C_5，)，141.8(s，C-4)，136.7(s，C-3),128.4(d,C—7)，126.2(s，C—8)，125.8(s，C-l)，123.3(s，C一2)，123.O(s，C-7，)，122.3(s，C-8')，121.4(d，C-6)，120.O(d，C-5)，112.5(d，C—6，)，109.7(s，C-1，)，103.9(d，C-3，)。根據(jù)上述結(jié)構(gòu)鑒定相關(guān)數(shù)據(jù)可以看出，化合物1的UV、^-NMR和13ONMR譜與化合物Rufescidride非常相似，ESI-MS顯示分子離子峰m/z353[M-H]—，比Rufescidride多18個質(zhì)量單位，因此可以判斷Rufescidride可能為化合物1脫水的產(chǎn)物，即化合物1可能為Rufescidride的9和9'位酸酐水解成兩個羧酸的化合物。IR中1721cm—1處的吸收峰，以及化合物1溴甲酚綠顯藍色也證明了化合物中具有羧酸基團。^-麗R和DEPT譜顯示化合物l中具有18個s^雜化的碳，包括5個次甲基，5個連氧季碳和兩個羰基；在'H-麗R譜中，顯示三個芳基氫的單峰信號S8.05(單峰，H-7)，7.409(單峰，H-6，)和6.62(單峰，H-3，)以及苯環(huán)鄰位氫的兩個雙峰信號S7.46(雙峰，J二8.8Hz，H-6)和7.259(雙峰，J=8.8Hz，H-5)。式(1)顯示了在HMBC譜中幾個主要的相關(guān)信號，其中H-6與C-2，C-4和C-7之間有遠程相關(guān)；H-5與C-1和C-3之間有遠程相關(guān)以及H-7與C-2，C-6，C-8，C-9和C-9'之間有遠程相關(guān)說明化合物1中具有二羧基萘環(huán)結(jié)構(gòu)。H-6'與C-4'，C-2和C-7'之間有遠程相關(guān)以及H-3'與C-1'和C-5'之間存在的遠程相關(guān)信號說明化合物1中具有一三氧取代的苯環(huán)與奈環(huán)相連。因此可以確定化合物1為芳基萘類木脂素，最后通過與文獻發(fā)現(xiàn)的芳基奈類木脂素相對比可鑒定出化合物1為蒙古蒲公英酸A。式(1)實施例2:蒙古蒲公英酸A的乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測(1)將蒙古蒲公英酸A溶于二甲亞砜中，配制成5毫克/毫升溶液，再用磷酸緩沖液稀釋成50微克/毫升，10微克/毫升，以及20微克/毫升。以他克林為陽性對照。(2)試驗結(jié)果如下表l所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)實驗結(jié)論:AChE是老年性癡呆(Alzheimer'sDisease,簡稱AD)的指標性測試酶，老年癡呆患者的AChE降低是引起老年性癡呆的重要原因之一。許多藥物是基于對AChE起抑制作用而成為老年性癡呆藥物的。本實驗表明該木質(zhì)素酸成分具有強效抑制乙酰膽堿酯酶的作用，具有較強的開發(fā)潛力，有可能進一步發(fā)展成為新的抗老年癡呆癥用藥。實施例3:五種蒲公英屬植物根莖與地上部分莖葉中化合物1的比較(1)供比較含量用蒙古蒲公英(7krarac咖_z'c"/77Hand.-Mazz)、堿地蒲公英(7krarac〃/T75"j./7ic"yz7Kitag)、熱河蒲公英(7krazac鵬;7a力7/ecio^/z7Diels)、東；(匕、蒲公英(7krax3c〃/so/ptj.<3/7"/z7Kitag)、反複蒲公英(7kraxaci//77^7y;7。c/0/Dahlst)、興安蒲公英(7kra義acw/T7Z^cj7W"邁Kitag)干品各20克由中科院昆明植物所彭華教授采集并鑒定。(2)用沃特斯高效液相色譜(WatersHPLC，2695分離系統(tǒng)包括四元泵、柱溫箱自動進樣器；2996紫外二極管矩陣檢測器，Empower色譜操作軟件和SymmetryC18色譜柱(4.6mmx250ram)，5^對上述生藥中的蒙古蒲公英酸A的含量進行了檢測。(3)供試樣品處理陰干粉碎后的樣品各稱取0.5克(±0.1毫克)，置25毫升容量瓶，加20毫升甲醇，253(TC下超聲60分鐘，加甲醇至刻度，用0.45pm濾膜濾過。(4)標準溶液的制備準確稱取蒙古蒲公英酸A標準品10.0毫克，分別加入8毫升甲醇超聲溶解，再加入甲醇配成0.5毫克/毫升的標準儲備液。用甲醇按照l:l、1:10、1:50、1:100配制成標準溶液，冷藏備用。(5)試劑甲醇為HPLC級，水為二次蒸餾水。色譜條件柱溫30。C，檢測波長254nrn，流速0.8毫升/分鐘，進樣量20微升，流動相甲醇/O.l%HAc=75:25等度洗脫。(6)含量測試將提取溶媒、標準品溶液、供試樣品分別進樣，記錄色譜圖。以峰面積對應(yīng)標準溶液濃度繪制曲線，計算線性范圍，相關(guān)系數(shù)^).998。從標準曲線分別計算出蒙古蒲公英酸A的含量。(7)檢測結(jié)果如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(8)結(jié)果表明蒙古蒲公英根莖和地上部分都含有本發(fā)明所述的強效乙酰膽堿酯酶抑制劑化合物，并且堿地蒲公英、熱河蒲公英、東北蒲公英、反苞蒲公英、興安蒲公英中都含有不同含量的蒙古蒲公英酸A，說明該化合物是菊科蒲公英屬植物中的特征性成分之一，所以運用本屬植物包括并不限于蒙古蒲公英、堿地蒲公英、熱河蒲公英、東北蒲公英、反苞蒲公英、興安蒲公英等都可以制備本發(fā)明所要求的含有蒙古蒲公英酸A的抗老年癡呆藥物。實施例4:鮮品和干品蒲公英中蒙古蒲公英酸A含量的比較(1)供干鮮品含量比較之蒙古蒲公英(7arax3Ctt^/ff朋^h'c"/z7Hand.-Mazz)和堿地蒲公英(7krazacsj'/7ic咖Kitag)鮮品各100克由浙江大學(xué)藥學(xué)院陳柳蓉副教授鑒定。(2)用沃特斯高效液相色譜(WatersHPLC，2695分離系統(tǒng)包括四元泵、柱溫箱自動進樣器；2996紫外二極管矩陣檢測器，Empower色譜操作軟件和SymmetryC18色譜柱(4.6mmx250mm)，5|jm對蒙古蒲公英酸A進行了含量檢測。(3)含量測試將提取溶媒、標準品溶液、供試樣品分別進樣，記錄色譜圖。以峰面積對應(yīng)標準溶液濃度繪制曲線，計算線性范圍，相關(guān)系數(shù)20.998。從標準曲線計算出蒙古蒲公英酸A的含量。具體操作同實施例3。(4)結(jié)果如表3所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>__(5)結(jié)果表明蒙古蒲公英和堿地蒲公英的干品和鮮品中都含有不同含量的蒙古蒲公英酸A，含量并無大的差異。說明蒙古蒲公英酸A在菊科蒲公英屬植物中存在和含量較為穩(wěn)定，所以運用本屬植物的干品和鮮品都可以制備本發(fā)明所要求的含有蒙古蒲公英酸A的抗老年癡呆藥物。權(quán)利要求1.一個木質(zhì)素化合物及其可藥用鹽或其溶劑化物用于抑制乙酰膽堿酯酶的用途，其特征為該木質(zhì)素化合物具有下列結(jié)構(gòu)稱為6，9，10-三羥基-氧雜蒽-1，2-二羧酸，又稱為蒙古蒲公英酸A。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蒙古蒲公英酸A的用途，其特征是在制備預(yù)防和治療乙酰膽堿缺失導(dǎo)致的相關(guān)癥狀或疾病，尤其是防治老年性癡呆的藥物中的用途。3.—種用于防治老年性癡呆的藥物組合物，其特征是含有治療有效量的作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物及其可藥用的鹽與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成藥物組合物。4.根據(jù)權(quán)利要求2的蒙古蒲公英酸A的用途，其特征是所述藥物的制劑形式包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑、控釋或緩釋劑、或納米制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之化合物的制備途徑，其主要來源于任意一種中國產(chǎn)的蒲公英屬植物之任一部位；可以是干品或鮮品；可以是蒲公英藥材植物的根、莖、葉、花、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物及全草部分。全文摘要本發(fā)明涉及從蒲公英屬植物中分離得到的一個木質(zhì)素酸以及該化合物的強效抑制乙酰膽堿酯酶活性。從蒲公英中分離純化制備而得的蒙古蒲公英酸A，即6，9，10-三羥基-氧雜蒽-1，2-二羧酸具有明顯的乙酰膽堿酯酶抑制作用，因此該化合物及其可藥用的鹽，以及與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成的藥物組合物可預(yù)期作為防治老年性癡呆藥物用途。文檔編號A61K31/352GK101214237SQ200810059059公開日2008年7月9日申請日期2008年1月9日優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日發(fā)明者葉發(fā)青,艷徐,施樹云,楊雷香,南董,昱趙,馬建設(shè),黃可新申請人:溫州醫(yī)學(xué)院