專利名稱：重組金黃色葡萄球菌腸毒素n口服制劑及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物工程，涉及重組金黃色葡萄球菌腸毒素N (Staphylococcal Enterotoxin N， SEN)的制備以及以SEN主要有效成分的口服制劑的制備和 在腫瘤治療中的應用。具體地說，就是利用基因工程的方法制備高純度重組 金黃色葡萄球菌腸毒素N蛋白及其相關蛋白制品，并將其制備成口服制劑， 用于腫瘤患者的治療和康復。
背景技術：
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxin)由金黃色葡萄球菌 產(chǎn)生。目前己經(jīng)獲得鑒定的腸毒素有二十余種，其中包括經(jīng)典的腸毒素如 SEA、 SEB、 SEC、 SED、 SEE等，以及新近發(fā)現(xiàn)的腸毒素SEG SEQ。不同 種類腸毒素分子量為25 33kD不等，各類腸毒素氨基酸序列具有一定的同源 性(28% 98%)，通過蛋白質(zhì)晶體衍射以及計算機三維結(jié)構(gòu)模擬技術可知， 各類腸毒素的三維結(jié)構(gòu)十分相似，均具有兩個結(jié)構(gòu)域，多數(shù)腸毒素包含一個 對維持三維結(jié)構(gòu)十分重要的二硫鍵。
金葡菌腸毒素是一類典型的細菌性超抗原，能在短時間內(nèi)引起宿主體內(nèi)T 細胞的大量增殖與活化。研究發(fā)現(xiàn)，腸毒素分子可以以完整分子結(jié)合于抗原 提呈細胞(Antigen presenting cells, APC)表面的MHC-II類分子的抗原肽結(jié)合 溝槽外側(cè)，進而通過與T細胞受體(T cell receptor, TCR) 區(qū)特異性結(jié)合激 活T細胞。與普通抗原不同的是，腸毒素不需要同時被TCR分子的Va、 Ja、 J(3、 V(3和DP等各部分共同識別，也無MHC-II限制性，使得金葡菌腸毒素只 需極低濃度(0.01 10ng/mL)即可激活2 30%的初始T淋巴細胞，是普通抗 原激活的T細胞數(shù)量的103 106倍。同時，腸毒素亦能促進受其激活的T細 胞分泌多種細胞因子，間接激活B細胞、NK細胞，因此金葡菌腸毒素能高效 地刺激和增強免疫應答。
介于此性質(zhì)，國內(nèi)外對腸毒素超抗原應用于腫瘤治療的研究已有大量的 文獻報導。Frank等人將SEB ( 10pg/mL)膀胱內(nèi)灌注荷RT112和RT4細胞小 鼠，六周后約76%的小鼠膀胱內(nèi)腫瘤消失，其余小鼠膀胱內(nèi)的腫瘤細胞則產(chǎn) 生明顯調(diào)亡現(xiàn)象。Hedlund等人進行的體內(nèi)實驗表明，SEA激活T細胞使之增殖作用在每只小鼠0.1 — 100嗎范圍內(nèi)呈劑量依賴關系，注射后1天出現(xiàn)最 大效應，增殖效應維持4天。Litton等人用結(jié)腸癌相關抗原C242的單抗Fab 片段和SEA制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)能夠高效地促進T細胞和 單核細胞在腫瘤組織處聚集、滲透，并誘導T細胞產(chǎn)生大量細胞因子，同時 誘導結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生IL-4、 IL-IO、 TNF-ct等細胞因子，并引起癌細胞IFN-y 受體、Fas受體表達上調(diào)，從而有效誘導腫瘤細胞調(diào)亡。Kodama等制備了 SEA 的突變體mSEAD227A，該突變蛋白與天然SEA相比降低了與MHC-II分子 的結(jié)合能力，但未改變對T細胞的刺激增殖能力。實驗證明家兔對該突變體 的耐受力是天然SEA的500倍。利用該突變蛋白與抗MUC1抗原的單克隆抗 體MUSEll制備融合蛋白，證明該融合蛋白在體內(nèi)和體外均能高效地增強 T-LAK細胞對表達MUC1的膽管癌細胞的特異性細胞毒作用。
在國外，以金葡菌腸毒素及其融合蛋白為主要有效成分的藥物已經(jīng)進入 了臨床研究。如Giantonio等人完成的PNU-214565 (重組SEA與C242單克 隆抗體的Fab片段制備的融合蛋白)的I期臨床實驗表明，患者可能產(chǎn)生的細 胞毒性與給藥劑量密切相關，而給藥劑量又取決于患者的體重和血液循環(huán)中 抗SEA抗體濃度。在給藥過程中，76%的患者出現(xiàn)不同程度的體溫升高，62 %的患者出現(xiàn)不同程度的血壓降低，其主要因素是誘導產(chǎn)生的IL-2和TNF， 毒副作用均為暫時性的，容易得到控制。他們發(fā)現(xiàn)，治療開始之前病人體內(nèi) 抗SEA抗體在一定程度上降低了毒副反應，通過綜合考慮個體體重與抗SEA 抗體濃度，可以確定一個副作用最小的給藥劑量。Jonathan等人完成了 PNU-214565的第二代產(chǎn)品PNU-214936的I期臨床實驗，目的為了在非小細 胞肺癌(non-small-cell lung cancer ， NSCLC)患者身上實現(xiàn)個體化給藥，并 使用Bayesian模型結(jié)合過量劑量控制方法進行劑量放大，確定了該藥的最大 耐藥劑量(MTD)。
在我國，以腸毒素C2 (SEC2)為主要有效成分的金葡菌濾液制劑應用于 臨床腫瘤治療已逾十年。資料顯示，該類制劑不僅可以顯著增強中晚期腫瘤 患者的機體免疫能力，同時可以減輕因放化療引起的毒副作用，對惡性腫瘤 患者生存期的延長和生存質(zhì)量的改善具有重要的臨床價值和意義。如朱根海 等研究了 56例卵巢上皮癌患者化療后及高聚金葡萄素輔助治療后的機體細胞 免疫狀態(tài)，治療結(jié)果顯示應用高聚生金葡素聯(lián)合化療后，CD4"CD8+比例、 NK細胞活性較單純化療顯著提高，同時高聚金葡素聯(lián)合化療組2個療程治療 后血中CA125、TSGF等惡性腫瘤特異性生長因子降至正常的例數(shù)多于單純化療組，白細胞或血小板計數(shù)低于正常的例數(shù)少于單純化療組。羅鋒等對35例 淺表轉(zhuǎn)移性腫瘤應用高聚生金葡素局部治療，治療一個月后總有效率達82.9 %，并證實經(jīng)高聚生金葡素治療后腫瘤細胞平均細胞調(diào)亡率增加(PO.Ol)。 湯煒等對早期口腔癌采用局部金葡素治療及對晚期口腔癌應用金葡素聯(lián)合化 療，觀察療效和病理改變，發(fā)現(xiàn)應用金葡素可使大量淋巴細胞及纖維組織聚 集在癌巢附近，并能觀察到腫瘤細胞顯著減少，甚至部分病例腫瘤細胞消失。 吳潔等觀察了高聚金葡素在食管癌根治性放療期間，對近期療效、胃腸道反 應、白細胞變化以及對全身狀況的輔助作用，結(jié)果顯示與對照組相比，觀察 組在放療期間的胃腸道反應、白細胞數(shù)量變化差異顯著，表明高聚金葡素可 明顯升高白細胞數(shù)量，減輕胃腸道反應。同時，觀察組Kps評分增加〉10分的 患者占86. 6%，對照組僅占36.6% (尸<0. 05)，說明高聚金葡素有明顯的改 善全身狀況的作用。但另一方面，由于制劑中含有大量雜質(zhì)蛋白，其中包括 多種金葡菌屬的毒素蛋白，如溶血素、白細胞殺傷因子、表皮剝落因子等， 在應用金葡菌濾液注射制劑用于腫瘤患者治療時，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者使用時普遍 出現(xiàn)低熱，低血壓等毒副作用，同時也會導致注射或灌注部位紅腫、疼痛等 癥狀，對腫瘤患者的治療和生存質(zhì)量產(chǎn)生一定影響。
一般認為，蛋白質(zhì)以及多肽類物質(zhì)在進入胃腸道以后，胃內(nèi)低pH環(huán)境以 及胃腸道內(nèi)大量存在的胰蛋白酶、糜蛋白酶、多肽酶等多種酶類對蛋白質(zhì)以 及多肽的生物學活性以及分子的完整性有著非常大的影響，大多數(shù)蛋白以及 多肽類物質(zhì)會很快分解為氨基酸從而被人體吸收利用。目前，對于二肽、三 肽等寡肽分子的胃腸道內(nèi)吸收的研究開展地較為廣泛，在小腸絨毛上皮表面 也尋找到了部分二肽、三肽轉(zhuǎn)運蛋白，上述研究結(jié)果也對傳統(tǒng)的人體內(nèi)蛋白、 多肽的分解、吸收等代謝途徑給予了新的補充，但是，對于完整的蛋白以及 多肽分子的胃腸道吸收的研究仍然處于起步階段，目前也只有極少數(shù)蛋白被 推測可能能夠以完整形式被人體直接吸收利用。
目前，對于腸毒素在胃腸道內(nèi)的作用原理和方式的研究開展地并不深入， 對金葡菌腸毒素如何導致食物中毒癥狀以及是否能夠通過口服吸收進而產(chǎn)生 超抗原作用仍未能取得共識。由于給予外源性的IL一2可以模擬產(chǎn)生食物中 毒時的癥狀，因此有學者認為腸毒素引起的食物中毒癥狀可能與其超抗原性 質(zhì)有關，并猜測腸道上皮細胞表面存在能夠與腸毒素分子結(jié)合的受體，他們 指出腸道中存在MHC-II+的M細胞，該類細胞能夠與腸毒素分子結(jié)合。腸毒 素正是通過該類細胞產(chǎn)生超抗原作用。但也有研究人員認為腸毒素的致嘔吐作用和超抗原作用并無直接聯(lián)系，他們利用氨基酸突變的方法分別找到了對 腸毒素分子的這兩種活性有重要影響的氨基酸殘基，從而猜測胃腸道上皮細
胞表面存在其他種類的受體或轉(zhuǎn)運分子與其發(fā)生相互作用。Hamad等證實了 MHC-I廠的Caco-2細胞能夠?qū)EB實現(xiàn)雙向轉(zhuǎn)運(Apical—Basolateral, Basolateml—Apical),并且在轉(zhuǎn)運過程中能夠保持SEB分子的完整性，Shupp 等也利用體外實驗證實了模擬小腸隱窩上皮細胞的T84細胞系能對SEA、SEB 實現(xiàn)單向轉(zhuǎn)運，提示腸毒素分子有可能在穿越胃腸道上皮進入血液循環(huán)系統(tǒng) 后產(chǎn)生超抗原作用。馬海英等將金葡菌濾液制劑經(jīng)灌胃給藥，可使因注射環(huán) 磷酰胺所致的免疫功能低下模型小鼠的細胞免疫能力和體液免疫功能得到良 好的改善和提高，其中以細胞免疫功能的改善和提高尤為明顯。需要指出的 是，腸毒素在腸道中未必僅限于以某種單一方式發(fā)揮作用，可能存在更為復 雜的機理，如Gerburg等人發(fā)現(xiàn)口服給予低劑量腸毒素后雖可以迅速激活大量 存在于腸系膜淋巴節(jié)以及皮氏小節(jié)處的V(38+T細胞，但對體循環(huán)系統(tǒng)中的T 淋巴細胞并無顯著的刺激作用?？梢姼淖兡c毒素給予的劑量和時間與腸毒素 在腸道內(nèi)以及全身的生物學效應存在著微妙的關系。
以金葡菌腸毒素為主要成分的口服抗腫瘤制劑的理論研究和治療應用開 展地也較為緩慢，且主要以經(jīng)典腸毒素如SEA、 SEB、 SEC等為研究對象。 如中國專利CN 1509762A公開了一種金葡菌發(fā)酵液中提取代謝產(chǎn)物用于治療 和預防艾滋病，其中主要成分包括了 SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、和SED，病 人口服后可以提高抗病毒能力；中國專利CN 1509725A公開了一種金葡菌發(fā) 酵液中提取獲得SEA、 SEB、 SEC、 SED以及TSST—1制備用于提高機體免 疫功能的口服制劑，病人使用后可以提高白細胞數(shù)量、改善健康狀況；中國 專利CN 1283264C公開了一種金葡菌代謝產(chǎn)物中提取SEA、 SEB、 SEC1、 SEC2、 SEC3、 SED以及TSST—1用于制備口服制劑，應用于防治腫瘤、糖 尿病、乙肝、戒毒、抗病毒、抗艾滋病、提高免疫力。但上述從金葡菌發(fā)酵 代謝產(chǎn)物中提取腸毒素的方法存在一定不足，如制備工藝簡單，缺乏嚴格質(zhì) 量控制標準，批次之間不穩(wěn)定，容易引入其他蛋白雜質(zhì)等，從而影響最終產(chǎn) 品的純度、活性和質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素N 口服制劑，所述重 組金黃色葡萄球菌腸毒素N是利用基因工程方法制備獲得的超抗原蛋白，具有 SEQIDNO.l的氨基酸序列，表達重組金黃色葡萄球菌腸毒素N的是重組質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN，該質(zhì)粒由pGEX-4T-l和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重 組構(gòu)建而成，所述制劑形式是以重組金黃色葡萄球菌腸毒素N及其相關蛋白制 品為主要有效成分的口服制劑，該口服制劑還含有制劑允《午的藥物賦形劑或載 體。
本發(fā)明通過Caco-2單層細胞跨膜轉(zhuǎn)運試驗證實了該蛋白可以以完整分子 的形式透過小腸上皮細胞進入全身血液循環(huán)并能保持其促脾淋巴細胞增殖和 以及抑制腫瘤細胞生長的超抗原活性，可以應用于口服抗腫瘤制劑的制備。
本發(fā)明描述的口服制劑可以被稱為"口服的"、"口服給藥的"、"腸的"、"腸 給藥的"、"非腸胃外的"、"非腸胃外給藥的"等，以表明為沿消化道對個體進 行給藥的途徑或方式。這種"口月艮"或"腸"給藥途徑包括但不限于例如吞咽固體 (藥丸、片劑、膠囊)或液體(糖漿)化合物或組合物；舌下；鼻空腸管或 胃造口術管；十二指腸給藥；直腸給藥等，同時，可以采用一種或多種口服 或腸給藥途徑，其中優(yōu)選口服給藥。
"藥學上可接受的"是指不會在生物學、醫(yī)學、化學上或以任何其他方式與 身體化學和新陳代謝不相容的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明制備的口服抗腫瘤制劑中除含有的以重組金黃色葡萄球菌腸 毒素N及其相關蛋白制品作為主要有效成分以外，同時含有的組分和輔料包 括防止胃蛋白酶降解上述主要有效成分的組分、防止糜蛋白酶降解上述主要 有效成分的組分、防止腸胰蛋白酶降解上述主要有效成分的組分、吸收促進 劑以及其他生物制品及/或基因工程藥品中可以接受的輔料和組分中的一種或 多種，從而可以使得有效量的上述主要有效成分到達腸內(nèi)并最終被吸收到使 用個體的血液中。
本發(fā)明重組金黃色葡萄球菌腸毒素N通過以下步驟實現(xiàn)
(1) 設計分別帶有丑amH I和I酶切位點的用于克隆金黃色葡萄球菌 腸毒素N成熟肽序列的上下游引物-
SEQ ID N0.3: gga tcc gaa gta gac aaa aaa ga (劃線部分為5amH I酶切位
占)，
/"、 z ，
SEQ ID NO.4: etc gag ata ate ate aat cac tta (劃線部分為J^o I酶切位點)；
(2) 以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組為模板，采用PCR擴增獲得 編碼金葡菌腸毒素N蛋白成熟肽的基因片段，將其連入pGEM-T質(zhì)粒載體上 的多克隆位點，成功構(gòu)建pGEM-T-SEN重組質(zhì)粒。通過測序證實通過PCR擴 增獲得的編碼金葡菌腸毒素N蛋白成熟肽的基因片段序列(見SEQ ID NO.2)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列(1124486)完全一致；
(3 )以pGEM-T-SEN質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得兩端帶有酶切位點的 編碼金葡菌腸毒素N蛋白成熟肽的基因序列，將上述基因片段用內(nèi)切酶^^H I和J^oI進行酶切后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-l質(zhì)粒相連接，成功 構(gòu)建表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN;
(4)將pGEX-4T-l-SEN表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導表 達帶GST標簽的重組GST-SEN融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心收集上清， 依次采用親和層析、離子層析、凝膠層析獲得高純度(〉98%)的重組金葡菌 腸毒素N。將該純化產(chǎn)物經(jīng)過脫鹽、冷凍干燥即得重組金黃色葡萄球菌腸毒 素N凍干粉。
重組金葡菌腸毒素跨膜實驗建立單層Caco-2細胞跨膜轉(zhuǎn)運模型，檢測 重組腸毒素N的跨膜效應。證實了重組金葡菌腸毒素N可以以完整分子形式 透過小腸上皮細胞進入人體血液循環(huán)。
跨膜后的重組腸毒素分子的超抗原活性檢測采用MTT法，以有絲分裂 原ConA為陽性對照，建立合適的體外模型以觀察跨膜后的重組金葡菌腸毒素 N對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以及受其刺激增殖的小鼠脾淋巴細胞對腫瘤 細胞的殺傷作用，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (SEC2)進行比較，結(jié)果顯 示跨膜后的重組金葡菌腸毒素N蛋白分子仍然保持典型的超抗原活性，與 SEC2的作用相當。
本發(fā)明的以重組金葡菌腸毒素N及其相關蛋白制品為主要有效成分的口 服制劑的制備方法為
以重組金葡菌腸毒素N及其相關蛋白制品為主要有效成分，通過添加藥 學上可接受的組分和輔料制備口服抗腫瘤制劑。其制劑可以是片劑、微型片 劑、膠囊、微型膠囊、顆粒劑、粉劑、泡騰固體、可咀嚼固體片劑、軟凝劑、 囊片、水溶液、混懸劑、乳液、微乳液、糖漿或酏劑中的一種或幾種，但不 限于上述劑型。
本發(fā)明的又一個目的是提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素N在制備治療惡 性腫瘤以及其他嚴重并發(fā)癥藥物中的應用。
目前，還未見用非經(jīng)典金葡菌腸毒素制備口服制劑用于腫瘤治療的報導， 美國專利(PCT/US2005/02263)報道了用來源于腸毒素基因簇(egc，enterotoxin gene cluster)的金葡菌腸毒素(SEG、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO)具有良好的 抗腫瘤作用,并將其應用于惡性腫瘤及嚴重并發(fā)癥(胸水、腹水等)患者的治療和康復，取得了令人滿意的療效，但該專利申請亦未提出將上述腸毒素應
用于口服抗腫瘤制劑。我實驗室申請的中國專利(公開號CN1962692、 CN1900119、 CN101066993、 CN101037478、 CN101045924)涉及重組金葡菌 腸毒素SEE、 SEI、 SEM、 SEN、 SEO的制備以及在抗腫瘤藥物中的應用，也 未涉及口服制劑的應用。本發(fā)明通過基因工程的方法獲得高純度重組金葡菌 腸毒素N，同時證明通過上述方法制備得到的金葡菌腸毒素N可以以完整分 子形式通過小腸上皮細胞被人體吸收并繼續(xù)發(fā)揮超抗原作用，可以刺激小鼠 淋巴細胞增殖并增強淋巴細胞的腫瘤殺傷作用。因此，我們證明了重組金葡 菌腸毒素N可以通過人體胃腸道吸收，可以進入血液循環(huán)并產(chǎn)生有效的抗腫 瘤作用，具有良好的制備成為口服抗腫瘤制劑的應用前景。同時，獲得的高 純度重組腸毒素N蛋白不含金葡菌屬及其他革蘭氏陽性菌屬各類毒素蛋白， 可以有效降低臨床使用中各種毒副作用發(fā)生的可能性。因此可以應用于口服 制劑的制備，用于提高機體免疫力，治療惡性腫瘤以及其他嚴重并發(fā)癥。
本發(fā)明方法的特點是(1)提供了高純度的重組金葡菌腸毒素N蛋白的 制備方法，并證實該腸毒素蛋白可以以完整分子的形式透過小腸上皮細胞， 并且能保持其超抗原活性，可以應用于口服抗腫瘤制劑的制備(2)提供了一 種以重組金葡菌腸毒素N及其相關蛋白制品作為有效成分的口服抗腫瘤制 劑，可以應用于腫瘤患者的康復和治療(3)提供了含有編碼金黃色葡萄球菌 腸毒素N成熟肽基因(M")的重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN，該質(zhì)粒由 pGEX-4T-l和SEQ ID NO.2所示核苷酸融合構(gòu)建而成，可轉(zhuǎn)化入合適的表達 宿主，含有強啟動子，在誘導劑誘導下可高效表達帶有GST標簽的重組 GST-SEN融合蛋白(4)使用陰離子交換層析、凝膠過濾層析對通過親和純化 并經(jīng)過酶切的重組SEN蛋白進行精制純化，獲得了高純度的重組SEN蛋白(純 度>98°/。)。
本發(fā)明方法利用基因工程的方法獲得了高純度的重組金黃色葡萄球菌腸 毒素N。重組金葡菌腸毒素N的表達強度高，占全菌蛋白的10—20%左右， 且為可溶性表達。重組GST-SEN融合蛋白經(jīng)凝血酶酶切后，所得到的重組腸 毒素N與相應的天然腸毒素蛋白N成熟肽相比，只在N端多出2個氨基酸 (Gly-Ser)。本發(fā)明方法采用Caco-2單層細胞模型證實完整的重組金葡菌腸 毒素N分子可以透過小腸上皮細胞進入全身血液循環(huán)，并利用MTT法證明透 過Caco-2單層細胞的完整重組腸毒素N分子可以保持其超抗原特性。本發(fā)明 通過活性比較，證實了透過Caco-2單層細胞的重組金葡菌腸毒素N的超抗原活性與金葡菌腸毒素SEC2相當，由于在臨床獲得應用的金葡菌濾液制劑的主 要有效成分為SEC2，因而重組金葡菌腸毒素N可以應用于口服抗腫瘤制劑的 制備。同時，本發(fā)明方法提供的口服有效制劑中含有的組分和輔料包括防止 胃蛋白酶降解上述有效成分的組分、防止糜蛋白酶降解上述有效成分的組分、 防止腸胰蛋白酶降解上述有效成分的組分、吸收促進劑以及其他生物制品及/ 或基因工程藥品中可以接受的輔料和組分中的一種或多種，從而可以使得有 效量的上述主要有效成分通過口服、胃腸道、非胃腸道外等給藥方式到達腸 內(nèi)從而最終被吸收到使用個體的血液中。另一方面，根據(jù)鑒定實驗結(jié)果，現(xiàn) 有的三種市售金葡素注射制劑(高聚生、思復勝、恩格菲)中除了含有作為 主要有效成分的微量腸毒素C2之外，還含有大量不同種類的金葡菌屬蛋白及 多肽類物質(zhì)，其中絲氨酸蛋白酶(serine protease)、烯醇化酶(enolase)、 二 氫硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase)等三種酶含量超過了制 劑中總蛋白質(zhì)含量的95%以上。同時，三種制劑中也含有多種金葡菌屬外毒 素以及致病因子，其中包括a-溶血素、Y-溶血素、殺白細胞素、自溶素、纖 維連接素結(jié)合蛋白以及其他不同種類的脂酶、肽酶、核酶等。上述各種蛋白 酶類結(jié)構(gòu)及其功能明確，不具備刺激、增強機體免疫系統(tǒng)的超抗原活性，但 很有可能是導致臨床應用中普遍出現(xiàn)的各種毒副作用(發(fā)熱、低血壓、過敏、 局部疼痛等)的直接原因。通過本發(fā)明獲得的高純度重組腸毒素N不含有上 述各類金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子，在今后的臨床使用中造成相關副作 用的可能性大大降低。本發(fā)明通過基因工程的方法獲得高純度重組金葡菌腸 毒素N，同時證明通過上述方法制備得到的金葡菌腸毒素N可以以完整分子 形式通過小腸上皮細胞被人體吸收并繼續(xù)發(fā)揮超抗原作用，可以刺激小鼠淋 巴細胞增殖并增強淋巴細胞的腫瘤殺傷作用。因此，我們證明了重組金葡菌 腸毒素N可以通過人體胃腸道吸收，可以進入血液循環(huán)并產(chǎn)生有效的抗腫瘤 作用。同時，獲得的高純度重組腸毒素N蛋白不含金葡菌屬及其他革蘭氏陽 性菌屬各類毒素蛋白，可以有效降低臨床使用中各種毒副作用發(fā)生的可能性， 具有良好的臨床應用前景。鑒于此，本發(fā)明方法提供了以重組金葡菌腸毒素N 及其蛋白制品為主要有效成分的口服抗腫瘤制劑的制備，用于腫瘤患者的康 復與治療。


圖1為PCR擴增所得含酶切位點的編碼SEN蛋白成熟肽基因的瓊脂糖 凝膠電泳圖。圖2為PCR擴增后所測編碼SEN成熟肽的基因序列測序結(jié)果圖。 圖3為重組pGEX-4T-l-SEN質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖。 圖4為重組SEN表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN示意圖，標示的"SEN"即為編 碼SEN蛋白成熟肽的基因序列插入位置。
圖5為重組SEN在BL21 (DE3)大腸桿菌中誘導表達電泳圖。 圖6為重組金葡菌腸毒素N純化電泳圖。
圖7為親和層析純化并酶切后的重組金葡菌腸毒素N的陰離子層析圖譜。 圖8為經(jīng)過陰離子交換層析純化后的重組金葡菌腸毒素N的凝膠層析圖譜。
圖9為重組金葡菌腸毒素N的Caco-2單層細胞轉(zhuǎn)運實驗的時間-質(zhì)量關 系圖(A側(cè)到B側(cè))。
圖10為重組金葡菌腸毒素N的Caco-2單層細胞轉(zhuǎn)運實驗的時間-質(zhì)量關 系圖(B側(cè)到A側(cè))。
圖ll分別為6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr 后(泳道4)透過Caco-2單層細胞(A側(cè)到B偵ij)的重組金葡菌腸毒素N的 Western Blot檢測結(jié)果圖。
圖12分別為6hr后(泳道l)、 12hr后(泳道2)、 18hr后(泳道3)、 24hr 后(泳道4)透過Caco-2單層細胞(B側(cè)到A側(cè))的重組金葡菌腸毒素N的 Western Blot檢測結(jié)果圖。
圖13為經(jīng)過24hr后，透過Caco-2單層細胞的重組SEN與重組金葡菌腸 毒素SEC2標準品對ICR小鼠脾淋巴細胞的增殖作用(48h)，其中與空白對 照組相比***:尸<0. 001; **:尸<0. 01。
圖14為分別經(jīng)透過Caco-2單層細胞的重組SEN與重組金葡菌腸毒素 SEC2標準品刺激的ICR小鼠脾淋巴細胞對耐阿霉素慢性髓原性白血病細胞 (K562-AD)的抑制作用(48h)，與空白對照組相比***:尸O.OOl。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。需指出的是，下列 各實施例并非是對本發(fā)明內(nèi)容的進一步限定，對本發(fā)明內(nèi)容技術所作出的等 效替換或者相應的改進，仍然屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
在本說明書上下文中，除非特別指明，否則所引用的任何技術術語具有 本領域普通技術人員在本領域中通常理解的含義，而未注明的實驗方法是按 照常規(guī)實驗方法進行或按照供應商所建議的操作說明進行。實施例1:含酶切位點的編碼SEN蛋白成熟肽基因序列的PCR擴增 設計如下引物序列
SEQ ID NO.3: gga tec gaa gta gac aaa aaa ga (劃線部分為Ba附H I酶切位
占)
"、、'
SEQ ID N0.4: etc gag ata ate ate aat cac tta (劃線部分為Wo I酶切位點) 以金黃色葡萄球菌(FRI 1230)基因組為模板，用于擴增金葡菌腸毒素
SEN成熟肽基因片段MW;
PCR擴增條件如下，擴增獲得編碼SEN成熟肽基因片段，其中各基因片 段5'端帶有S"mH I酶切位點，3'端終止子后帶有屈o I酶切位點。
PCR體系
H20: 60|iL
Buffer(lOx): 10pL
Mg2+(25mmol/L): 8pL
BSA(5mg/mL): IO4L
Primer-up(25nmol/L): 4|iL
Primer-down(25,ol/L): 4(oL
dNTP(20mmol/L): 2pL
Template(Genome of awre附，1 Ong/(xL): 1
KOD Plus Polymerase(5U/(xL): 1 [iL PCR程序
1、 95'C預變性3min
2、 95。C變性30s， 55。C退火60s， 72。C延伸1 min
3、 依步驟2循環(huán)34次 4、 72。C延伸10min
電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物純度以及產(chǎn)量均較高，擴增得到 的基因片段分子量位置正確，PCR結(jié)果瓊脂凝膠電泳圖見說明書附圖1，其中 泳道l:核酸Marker,泳道2:含酶切位點的編碼SEN蛋白成熟肽基因PCR 產(chǎn)物。
實施例2:含酶切位點的編碼腸毒素SEN蛋白成熟肽基因的重組質(zhì) 粒pGEM-T-SEN的構(gòu)建將PCR擴增所得的帶酶切位點的編碼SEN蛋白成熟肽的基因片段克隆入 pGEM-T質(zhì)粒，構(gòu)建pGEM-T-SEN重組質(zhì)粒，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌DH5a中進行擴增。提取上述重組pGEM-T-SEN質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定后送樣 測序，測序結(jié)果顯示上述獲得的帶酶切位點的編碼SEN蛋白成熟肽的基因序 列與GenBank上相應的基因序列除在5'增加一個酶切位點以外其余位點完全 一致，其對應的腸毒素N成熟肽的氨基酸序列與GenBank上相應蛋白成熟肽 序列相比只在N端多了兩個氨基酸(Gly-Ser)，其余氨基酸位點完全一致 (NP—374932)。基因序列測序結(jié)果見說明書附圖2。
實施例3:含有帶酶切位點的編碼SEN成熟肽基因的pGEX-4T-l-SEN重 組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
用BamHI和^zo1分別酶切由實施例2中得到的含酶切位點的編碼SEN 蛋白成熟肽的基因片段的pGEM-T-SEN重組質(zhì)粒和pGEX-4T-l質(zhì)粒。分別回 收酶切后的含酶切位點的編碼SEN成熟肽的基因片段以及pGEX-4T-l質(zhì)粒酶 切產(chǎn)物的大片段，并連接，構(gòu)建了表達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN。將上述重組表 達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a擴增并提取質(zhì)粒，經(jīng)過SamH I和屈o I酶切鑒定， 結(jié)果表明目的基因片段已插入載體質(zhì)粒，電泳結(jié)果見附圖3，圖中泳道l:核 酸Marker,泳道2:未經(jīng)過酶切的重組pGEX-4T-l-SEN質(zhì)粒，泳道3:重組 pGEX-4T-l-SEN質(zhì)粒BawH I與J^o I雙酶切產(chǎn)物。pGEX-4T-l-SEN重組表達 質(zhì)粒示意圖見附圖4。目的基因在pGEX-4T-l-SEN質(zhì)粒上的詳細序列見SEQ IDNO.2
實施例4:重組GST-SEN融合蛋白表達菌株的構(gòu)建
從含pGEX-4T-l-SEN重組表達質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a中提取該質(zhì)粒，轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，獲得可 以大量表達GST-SEN融合蛋白的工程菌菌株。
實施例5:重組GST-SEN融合蛋白的表達
將含pGEX-4T-l-SEN重組表達質(zhì)粒的工程菌液劃氨芐青霉素篩選平板， 37'C靜置培養(yǎng)16-20hr后挑取單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基 中，37'C振搖培養(yǎng)6hr，作為種子液。將該種子液以1-5%的接種量接種于含 氨芐青霉素的2xYT培養(yǎng)基中，37。C振搖培養(yǎng)4hr，按0.01%-0.1%的體積比加入O.lmol/L IPTG誘導表達5 — 8hr。
實施例6:重組GST-SEN融合蛋白的親和層析樣品預處理 樣品的預處理取由實施例5中經(jīng)IPTG誘導的菌液于4。C， 10000rpm離 心，棄上清后收集沉淀。用原菌液1/10體積的PBS重懸沉淀，將混懸液置 FRENCH細胞破碎儀中，于700—900psi破碎，懸液呈粘稠狀。后用超聲破碎 儀繼續(xù)超聲破碎5-10min使核酸降解，菌體裂解液粘度降低。超聲后向菌體裂 解液中加入甘油至終濃度為2%，振蕩混勻，冰浴靜置30min。靜置后將菌體 裂解液于4t:， 12000rpm離心30min，取上清液低溫保存待用。上清液取樣進 行SDS-PAGE檢測，在分子量50kD處有明顯的條帶，此即為誘導表達的重 組GST-SEN融合蛋白。Quantity One圖像分析軟件顯示融合蛋白條帶大約占 全菌總蛋白含量的10-20%。經(jīng)誘導后菌體裂解液蛋白電泳結(jié)果見說明書附圖 5，圖中泳道l:蛋白質(zhì)Marker,泳道2:經(jīng)過誘導表達的菌體總蛋白。
實施例7:重組GST-SEN融合蛋白的親和層析
取由實施例6中經(jīng)預處理的GST-SEN融合蛋白溶液，經(jīng)0.45jam膜過濾 后加入至預平衡的Glutathione Sepharose 4 Fast Flow親和柱中，輕輕混勻， 結(jié)合30min后流盡液體。用PBS沖洗柱子3-5次，流盡液體。向柱中加入一 定體積的還原型谷胱甘肽洗脫液，輕輕混勻。充分反應20min后收集洗脫溶 液，用紫外分光光度計測蛋白濃度。重復上步的洗脫步驟直至蛋白濃度低于 O.lmg/mL停止收集。將收集的洗脫溶液組分用SDS—PAGE檢驗純度與濃度， 結(jié)果顯示初步純化得到的GST-SEN融合蛋白分子量約50kD，電泳結(jié)果見說 明書附圖6，圖中泳道1:蛋白質(zhì)Marker，泳道2:經(jīng)過親和純化后的GST-SEN 融合蛋白溶液樣品，泳道3: GST-SEN融合蛋白經(jīng)過凝血酶酶切后的GST 和重組SEN蛋白混合蛋白溶液樣品，泳道4:經(jīng)過陰離子層析純化得到的重 組SEN溶液樣品，泳道5:陰離子層析后再經(jīng)凝膠層析得到的含高純度重組 SEN的溶液樣品。
實施例8:重組GST-SEN融合蛋白的酶切
將上述由實施例10中經(jīng)過親和純化獲得的重組GST-SEN融合蛋白的收 集組分合并，脫鹽除去溶液中的谷胱甘肽并將蛋白所在溶液置換成含 0.05mol/LTris， 1.5mol/LNaCl， 2.5mmol/LCaCl2 (pH7.4)的凝血酶緩沖溶液。每lmL蛋白溶液加入20mg/mL凝血酶2^L， 25""C反應24h，取樣電泳，檢測 酶切反應程度。SDS-PAGE結(jié)果顯示酶切反應基本完全，GST標簽已與重組 SEN分離，酶切電泳結(jié)果見說明書附圖6。
實施例9:重組SEN的精制純化
將按實施例11中酶切得到的混合蛋白溶液(包括重組SEN、 GST蛋白標 簽、凝血酶以及其他少量雜質(zhì)蛋白)脫鹽置換成0.05mol/L Tris (pH8.35)緩 沖溶液后進行陰離子交換層析，離子交換填料選用QSepharoseTMHP，待溶液 中蛋白與陰離子層析柱充分結(jié)合后，采用線性梯度洗脫的方式，逐漸提高鹽 離子強度洗脫，洗脫液為0.05mol/L Tris， lmol/LNaCl (pH8.35)，收集第一 個洗脫峰，即為較高純度的重組SEN蛋白(純度>95%)。將經(jīng)離子層析得 到的重組SEN溶液組分濃縮，利用Sephacryl-200凝膠層析柱對重組SEN蛋 白進行精制純化，流速0.75ml/min，收集紫外吸收最高峰對應溶液組分，即為 高純度重組SEN (純度>98%)。層析圖譜見說明書附圖7、 8,圖7中實線為 紫外吸收值，虛線為電導值，其中第一個洗脫峰即為重組SEN。圖8中實線 為紫外吸收值，該峰即為高純度的重組SEN。
利用SDS-PAGE檢測，顯示重組金葡菌腸毒素N為約28kD位置的單一 條帶，純化結(jié)果見說明書附圖6。
實施例10:高純度重組金葡菌腸毒素N的保存
將上述實施例9中獲得的高純度重組腸毒素N溶液置換成甲酸銨溶液后， 冷凍抽干，即制備成重組腸毒素N凍干粉，-20°<:保存
實施例11:重組金葡菌腸毒素N的跨膜測定
取一定量實驗室制備保存的高純度重組SEN以及作為陰性對照的HRP (辣根過氧化物酶)粉末，溶于HBSS，利用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進 行準確定量，制備重組SEN以及HRP儲備液。用HBSS按一定比例將兩種儲 備液稀釋并混合均勻，使重組SEN和HRP終濃度分別為7.5 pg/mL和10 pg/mL，使用前0.22pm濾膜過濾除菌。
將Caco-2細胞培養(yǎng)于TmnswellTM小室中，培養(yǎng)18—25天，待分化充分
15后，吸棄原有培養(yǎng)液，加入37t:預熱的HBSS溶液，37°C， 5%002條件下靜 置20min，吸棄，再加入預熱至37。C的HBSS溶液，37°C， 5%(302條件下靜 置20min，吸棄。將含重組SEN(7.5 pg/mL)和HRP(IO嗎/mL)的混合蛋白溶液 分別加入TranswellTM小室的頂側(cè)(Apical， A頓!J)或者底側(cè)(Basolateral， B 側(cè))，其中A側(cè)加入500iiL， B側(cè)加入1.5 mL，相應側(cè)加入HBSS溶液，其 中A側(cè)加入50(^L， B側(cè)加入1.5mL，于37 。C搖床低速振搖(35-55r.p.m) 孵育6、 12、 18、 24hr后，根據(jù)混合蛋白溶液加入位置收集另一側(cè)溶液，后 利用BA-ELISA以及顯色法分別測定透過Caco-2單層細胞的重組SEN蛋白和 HRP的含量。
(1) BA-ELISA法測定SEN濃度 將96孔酶標板用小鼠抗SEN單抗包被過夜后，棄去包被液，用含IO %
FCS的PBS37匸封閉2hr。棄去封閉液，用PBS洗板后加入樣品溶液以及重 組SEN系列濃度標準溶液，37T孵育2hr。棄去上述液體，用PBS洗板后加 入抗SEN兔多克隆抗體，37"C孵育2hr。棄去多克隆抗體溶液，PBS洗板后 加入生物素化山羊抗兔IgG， 37 'C孵育0.5 hr。棄去生物素化山羊抗兔IgG 溶液，PBS洗板后加入HRP標鏈親和素，37"C孵育0.5hr。棄去HRP標鏈親 和素溶液，PBS洗板后加入現(xiàn)配ELISA顯色液，37 "C孵育1 5 min后加入現(xiàn) 配中止液中止反應。用酶標儀讀取OD45o值，根據(jù)重組SEN系列濃度標準曲 線計算樣品中重組SEN含量，其中每個樣品各三個復孔。
(2) 顯色法測定HRP濃度
將樣品溶液以及HRP系列濃度標準溶液加入96孔培養(yǎng)板中，加入TMB 作為顯色底物，37 'C孵育1 5min后加入中止液中止反應，用酶標儀讀取 OD45o值，根據(jù)HRP系列濃度標準曲線計算樣品中HRP濃度，其中每個樣品 各三個復孔。
實驗結(jié)果顯示，與陰性對照HRP相比，重組SEN的Caco-2細胞雙側(cè)轉(zhuǎn) 運(A—B， B—A)效率均顯著高于HRP，并且在24hr內(nèi)轉(zhuǎn)運的量隨時間變 化呈現(xiàn)遞增趨勢。重組SEN的Caco-2單層細胞轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果見說明書附圖9、 10。圖9中實線為重組SEN，虛線為陰性對照HRP，橫標為時間，縱標為轉(zhuǎn) 運/透過Caco-2單層細胞的重組SEN的質(zhì)量。圖10中實線為重組SEN，虛線 為陰性對照HRP，橫標為時間，縱標為轉(zhuǎn)運/透過Caco-2單層細胞的重組SEN 的質(zhì)量。實施例12:透過Caco-2單層細胞的重組金葡菌腸毒素N的完整性檢測 利用Western Blot法檢測透過Caco-2單層細胞后的重組SEN蛋白的完整 性。取實施例ll中的各時間點樣品溶液，常規(guī)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，將膜用含 10X無脂奶粉的PBS溶液封閉過夜。棄去封閉液，PBS洗膜后將膜置于兔抗 SEN多克隆抗體溶液中，于37'C緩慢振搖孵育2hr。棄去一抗溶液，PBS洗 膜后將膜置于HRP酶標羊抗兔IgG溶液中，于37'C緩慢振搖孵育2hr。 PBS 洗膜后取Lumi-Light Western Blotting Substrate溶液1 、 2各0.5mL混勻，滴 于膜上，暗處放置2min，保鮮膜封膜，固定于暗盒內(nèi)，壓片，分別壓20sec、 1 min和5 min后，自動洗片機洗片。
結(jié)果顯示透過Caco-2單層細胞的重組SEN無論是從A側(cè)到B側(cè)還是從 B側(cè)到A側(cè)均能保持其完整性，即重組SEN蛋白可以以完整分子形式透過 Caco-2單層細胞，證實重組SEN蛋白可以以完整分子形式被人體小腸上皮細 胞吸收進入血液循環(huán)。WesternBlot實驗結(jié)果見說明書附圖11、 12。
實施例13: MTT法測定透過單層Caco-2細胞的重組腸毒素SEN的體外 抑瘤活性
采用MTT法，以有絲分裂原ConA為陽性對照，觀察跨膜后的重組金葡 菌腸毒素N對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用以及受其刺激增殖的小鼠脾淋巴細 胞對腫瘤細胞的殺傷作用，并與金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (SEC2)標準品進 行比較。
設調(diào)零孔(僅含培養(yǎng)基)、腫瘤細胞對照孔(培養(yǎng)基+腫瘤細胞)、淋 巴細胞本底釋放孔[含空白孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞)、陰性對照孔 (培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+重組GST蛋白)、陽性對照孔(培養(yǎng)基十 ICR小鼠脾淋巴細胞+Con A) 、 SEC2標準品孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴 細胞+ SEC2標準品)和實驗孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+透過單層 Caco-2細胞的重組腸毒素SEN)]以及抑瘤作用孔[含空白孔(培養(yǎng)基+ICR小 鼠脾淋巴細胞+腫瘤細胞)、陰性對照孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+月中 瘤細胞+重組GST蛋白)、陽性對照孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+腫瘤 細胞+ConA) 、 SEC2標準品孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+腫瘤細胞十 SEC2標準品)和實驗孔(培養(yǎng)基+ICR小鼠脾淋巴細胞+腫瘤細胞+透過單 層Caco-2細胞的重組腸毒素SEN)]，每種設三個復孔。其中，ConA終濃度 為10嗎/mL， GST終濃度為10嗎/mL， SEC2標準品終濃度為100ng/mL，透過單層Caco-2細胞SEN終濃度為90 150ng/mL (根據(jù)實際透過量)，本底 釋放孔中5xl()S個/mL ICR小鼠脾淋巴細胞以100nL/孔加入，腫瘤作用孔中 5xl(^個/mLICR小鼠脾淋巴細胞和2.5xl()S個/mL耐阿霉素慢性髓原性白血病 細胞(K562—AD)的混合懸液以100pL/孔加入到實驗孔中，透過單層Caco-2 細胞SEN樣品溶液50pL/孔加入各孔，并小心吹打混勻。
鋪板后44hr在待測孔中加入15nL/孔的MTT溶液，小心吹打混勻后，培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4hr后，小心吸除上清，按120pL/孔的加入DMSO，吹打助 溶后37'C培養(yǎng)箱中放置10min，酶標儀雙波長法(570nm為測定波長，630nm
為參考波長)測定各孔OD57o皿-OD63tom值，以僅含培養(yǎng)基的調(diào)零孔調(diào)零。按
下式計算抑瘤率抑瘤率(％) =100-[(抑瘤作用孔-淋巴細胞本底釋放孔)/月中 瘤細胞對照孔]xl00，作圖分析受透過Caco-2單層細胞的完整重組腸毒素SEN 分子激活的ICR小鼠脾淋巴細胞對腫瘤細胞生長的抑制作用，并用student f 檢驗做統(tǒng)計分析。
利用MTT法測定透過單層Caco-2單層細胞的完整重組腸毒素SEN體外 抑瘤活性結(jié)果顯示，以ICR小鼠脾淋巴細胞為作用細胞，以K562-AD為靶細 胞，與抑瘤陰性對照孔相比，陽性對照Con A和透過Caco-2單層細胞的完整 分子形式的重組腸毒素SEN (90 150ng/mL)作用48hr后小鼠脾淋巴細胞抑 瘤率均有顯著增高。按相同實驗方案檢測重組腸毒素SEC2標準品激活的ICR 小鼠脾淋巴細胞對K562-AD細胞的殺傷作用，經(jīng)比較，由透過Caco-2單層細 胞的完整重組腸毒素SEN分子激活的ICR小鼠脾淋巴細胞對K562-AD細胞 的殺傷作用與重組腸毒素SEC2標準品激活的ICR小鼠脾淋巴細胞殺傷作用 相當。實驗結(jié)果見說明書附圖13、 14。圖13、 14中與空白對照組相比***: 戶<0.001; 戶<0.01。
實施例14:市售金葡菌注射制劑成分分析
將市售三種金葡素注射液利用超濾管超濾濃縮40倍后進行電泳。電泳完 畢后使用Colloidal Coomassie Blue染色液染色，根據(jù)凝膠上各樣品中不同蛋白 條帶顏色深淺以及位置將凝膠分割成若干部分，分別進行膠內(nèi)酶切和肽段提 取。將提取獲得的肽段用LC上樣液(2%乙腈，0.5%甲酸)20uL溶解，振 蕩數(shù)秒后10000r.p.m離心10min， 3(TC水浴超聲10min， 10000rpm離心10min， 取上清液進行LC/MS/MS分析。
根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，三種金葡菌注射制劑(高聚生、思復勝、恩格菲)中共鑒定獲得約250種來源于不同菌屬蛋白質(zhì)，其中約有IOO種金葡菌屬蛋白，
包括了金葡菌腸毒素C2以及多種金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子，如a-溶血
素、Y-溶血素、殺白細胞素、自溶素、纖維連接素結(jié)合蛋白以及其他不同種
類的脂酶、肽酶、核酶等。上述各類蛋白以及金葡菌毒素蛋白結(jié)構(gòu)功能明確，
不具備刺激、增強機體免疫系統(tǒng)的超抗原活性，而是多種臨床疾病的直接致病
因子。如Dinges等指出，ci-溶血素能引起皮膚壞死，引起血管收縮，造成局部
缺血壞死，并最終可能導致肺水腫、呼吸窘迫綜合征以及各器官的化膿性感染；
Y-溶血素可引起炎癥因子的產(chǎn)生，導致多種炎癥反應(Martin M. Dinges W a/.
Exotoxins of /SA3/ /^/ococcws C7z'" i ev. 2000; Vol. 13, No.
1:16-34)。 Iwatsuki等指出，殺白細胞素能引起皮膚以及皮下組織壞死，亦能引
起兒童以及青年壞死性月巿炎(Keiji Iwatsuki C Staphylococcal cutaneous
infections: Invasion, evasion, and aggression. JZ)ermflto/ 5b/. 2006 Jun; Vol. 42, No.
3:203-214)。 Menzies指出，纖維連接素蛋白則是引起感染性心內(nèi)膜炎的重要因
子(Menzies BE. The role of fibronectin binding proteins in the pathogenesis of
S啤/z盧cocciw m^ews infections. CWr/"yfe" D/s. 2003 Jun; Vol. 16, No.
3:225-229)。上述各種金葡菌致病因子的存在極有可能是導致現(xiàn)有三種市售金
葡素注射制劑在臨床應用中產(chǎn)生多種副作用(發(fā)熱、低血壓、過敏、局部疼痛
等)的直接原因，因此在今后同類藥物的開發(fā)、研制以及生產(chǎn)過程中必須嚴格
控制并盡量去除。三種針劑(高聚生、恩格菲、思復勝)中獲得鑒定的金葡菌
屬重要毒素蛋白見表l。其中首列為GenBank蛋白序列號，第二列為獲得鑒定
的毒素蛋白質(zhì)名稱，第三列為蛋白質(zhì)種屬名稱。
表1金葡素注射制劑中獲得鑒定的金葡菌屬重要毒素蛋白 蛋白序列號
gi|294575 gi|9931632 gi|9931634 gi| 19879322 gi|21203559 gi|21284073
gi|49483762
gil49484059
gi|76009542 gi|82750663 gi|82752016
蛋白名稱 Chain Q> Alpha-Hemolysin serine protease-like exoprotein A serine protease-like exoprotein E lipase set26
gamma-hemolysin component B putative peptidase
serine protease
enterotoxin C2 precursor Autolysin gamma-hemolysin component C
種 屬 [Staphylococcus aureus] [Staphylococcus aureus] [Staphylococcus aureus] [Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2] [Staphylococcus aureus subsp, aureus MW2] [Staphylococcus aureus RF122] [Staphylococcus aureus RF122][Staphylococcus aureus] [Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300] [Staphylococcus aureus subsp. aureus USA300] [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9] [Staphylococcus aureus subsp. aureus JH9]
上述一系列實驗證實，通過基因工程方法獲得的高純度重組金葡菌腸毒素
SEN可以通過小腸上皮細胞吸收進入血液循環(huán)，同時，吸收后的重組腸毒素N 仍然保持其超抗原活性，可以刺激小鼠T淋巴細胞顯著增殖，增殖的T淋巴細 胞對腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用。同時，與現(xiàn)有金葡素注射制劑相比，制備 獲得的重組腸毒素N不含有各種金葡菌屬毒素蛋白以及致病因子。綜上所述， 本發(fā)明提供的重組腸毒素N可以用于口服抗腫瘤制劑的制備。
gi|83681617 gi|87160772 gi|87162036
gi|87162123 gi,85272 gi,85564
gi降85851
fibronectm binding protein B V8 protease leukotoxin LukE
1 -phosphatidylinositol phosphodiesterase Sulfatase
Peptidase SI and S6, chymotrypsin/Hap
Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase本發(fā)明涉及的序列 <110>浙江大學
〈120重組金黃色葡萄球菌腸毒素N 口服制劑及應用 <160>4
<210>1
<211>687
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> CDS
<222>(1)...(687)
<223>含部分凝血酶酶切位點序列的重組金黃色葡萄球菌腸毒素N <440>1
gga tcc gaa gta gac aaa aaa gat tta aag aaa aaa tct gat cta
Gly Ser Glu Val Asp Lys Lys Asp Leu Lys Lys Lys Ser Asp Leu
1 5 10 15
gat agt agt aag tta ttt aat tta aca age tat tat act gat ata
Asp Ser Ser Lys Leu Phe Asn Leu Thr Ser Tyr Tyr Thr Asp lie
16 20 25 30
acg tgg caa tta gac gag tea aat aaa att agt aca gat caa cta
Thr Tip Gin Leu Asp Glu Ser Asn Lys lie Ser Thr Asp Gin Leu
31 35 40 45
ctg aat aat act ata ata tta aaa aat att gat ata tcc gta ctt
Leu Asn Asn Thr lie lie Leu Lys Asn lie Asp lie Ser Val Leu
46 50 55 60
aaa act tct agt ttg aaa gtt gag ttt aac tea tea gat tta gca
Lys Thr Ser Ser Leu Lys Val Glu Phe Asn Ser Ser Asp Leu Ala
61 65 70 75
aat caa ttt aaa gga aaa aat ata gat att tat gga ctg tat ttt
Asn Gin Phe Lys Gly Lys Asn lie Asp He Tyr Gly Leu Tyr Phe
76 80 85 卯
gga aat aaa tgt gta ggc tta act gaa gaa aaa aca tea tgc tta
Gly Asn Lys Cys Val Gly Leu Thr Glu Glu Lys Thr Ser Cys Leu
91 95 100 105
tac gga gga gtt acg ata cat gat gga aat caa tta gat gaa gag
Tyr Gly Gly Val Thr He His Asp Gly Asn Gin Leu Asp Glu Glu
106 110 115 120
aaa gtt ata ggc gtt aat gta ttt aaa gat ggt gtc caa caa gaa
Lys Val He Gly Val Asn Val Phe Lys Asp Gly Val Gin Gin Glu
121 125 130 135
ggt ttt gtt ata aaa acc aaa aag get aaa gta aca gta caa gaa
Gly Phe Val lie Lys Thr Lys Lys Ala Lys Val Thr Val Gin Glu
136 140 145 150
45
卯
135
180
225
270
315
360
405
450tta gac act aaa gtt cga ttt aaa tta gaa aat tta tat aaa ata
Leu Asp Thr Lys Val Arg Phe Lys Leu Glu Asn Leu Tyr Lys lie
151 155 160 165
tac aat aaa gat acc ggt aac ata caa aaa gga tgc att ttc ttt
Tyr Asn Lys Asp Thr Gly Asn He Gin Lys Gly Cys He Phe Phe
166 170 175 180
cat tct cat aat cat caa gat caa tea ttt tat tat gat tta tat
His Ser His Asn His Gin Asp Gin Ser Phe Tyr Tyr Asp Leu Tyr
181 185 190 195
aac gta aaa ggt tea gtg gga gca gag ttt ttt caa ttt tat agt
Asn Val Lys Gly Ser Val Gly Ala Glu Phe Phe Gin Phe Tyr Ser
196 200 205 210
gat aat aga aca gtt age tea tct aat tat cat att gat gta ttt
Asp Asn Arg Thr Val Ser Ser Ser Asn Tyr His lie Asp Val Phe
211 215 220 225
tta tat aaa gat
Leu Tyr Lys Asp
226 229
495
540
585
630
675
687
<210>2
<211>681
<212>DNA
<213>金黃色葡萄球菌(Stap/zy/ococcus )
<220>
<221> CDS
<222>(1).,.(681)
<223>克隆所得金黃色葡萄球菌腸毒素N <440>2
gaa gta gac aaa aaa gat tta aag aaa aaa tct gat eta gat agt 45 Glu Val Asp Lys Lys Asp Leu Lys Lys Lys Ser Asp Leu Asp Ser
15 10 15
agt aag tta ttt aat tta aca age tat tat act gat ata acg tgg 90 Ser Lys Leu Phe Asn Leu Thr Ser Tyr Tyr Thr Asp lie Thr Trp
16 20 25 30
caa tta gac gag tea aat aaa att agt aca gat caa eta ctg aat ■ 135 Gin Leu Asp Glu Ser Asn Lys lie Ser Thr Asp Gin Leu Leu Asn 31 35 40 45
aat act ata ata tta aaa aat att gat ata tec gta ctt aaa act 180
Asn Thr lie lie Leu Lys Asn He Asp lie Ser Val Leu Lys Thr 46 50 55 60
tct agt ttg aaa gtt gag ttt aac tea tea gat tta gca aat caa 225 Ser Ser Leu Lys Val Glu Phe Asn Ser Ser Asp Leu Ala Asn Gin 61 65 70 75
ttt aaa gga aaa aat ata gat att tat gga ctg tat ttt gga aat 270 Phe Lys Gly Lys Asn lie Asp lie Tyr Gly Leu Tyr Phe Gly Asn76 80 85 90
aaa tgt gta ggc tta act gaa gaa aaa aca tea tgc tta tac gga
Lys Cys Val Gly Leu Thr Glu Glu Lys Thr Ser Cys Leu Tyr Gly
91 95 100 105
gga gtt acg ata cat gat gga aat caa tta gat gaa gag aaa gtt
Gly Val Thr lie His Asp Gly Asn Gin Leu Asp Glu Glu Lys Val
106 110 115 120
ata ggc gtt aat gta ttt aaa gat ggt gtc caa caa gaa ggt ttt
He Gly Val Asn Val Phe Lys Asp Gly Val Gin Gin Glu Gly Phe
121 125 130 135
gtt ata aaa acc aaa aag get aaa gta aca gta caa gaa tta gac
Val lie Lys Thr Lys Lys Ala Lys Val Thr Val Gin Glu Leu Asp
136 140 145 150
act aaa gtt cga ttt aaa tta gaa aat tta tat aaa ata tac aat
Thr Lys Val Arg Phe Lys Leu Glu Asn Leu Tyr Lys lie Tyr Asn
151 155 160 165
aaa gat acc ggt aac ata caa aaa gga tgc att ttc ttt cat tct
Lys Asp Thr Gly Asn He Gin Lys Gly Cys lie Phe Phe His Ser
166 170 175 180
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His Asn His Gin Asp Gin Ser Phe Tyr T^r Asp Leu Tyr Asn Val
181 185 190 195
aaa ggt tea gtg gga gca gag ttt ttt caa ttt tat agt gat aat
Lys Gly Ser Val Gly Ala Glu Phe Phe Gin Phe Tyr Ser Asp Asn
196 200 205 210
aga aca gtt age tea tct aat tat cat att gat gta ttt tta tat
Arg Thr Val Ser Ser Ser Asn Tyr His lie Asp Val Phe Leu Tyr
211 215 220 225
aaa gat
Lys Asp
226 227
315
360
405
450
495
540
585
630
675
681
<210> 3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素N基因所用的上游引物 <440>3
gga tec gaa gta gac aaa aaa ga
<210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列<220>
<223>從金黃色葡萄球菌基因組中擴增含酶切位點的金黃色葡萄球菌腸毒素N基因所用的下游引物 <440>4
etc gag ata ate ate aat cac tta
權利要求
1.一種重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑，所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素N屬于超抗原蛋白，其特征是SEQ ID NO.1是該重組金黃色葡萄球菌腸毒素N的氨基酸序列，表達該重組金黃色葡萄球菌腸毒素N的是重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SEN，該質(zhì)粒由pGEX-4T-1和SEQ ID NO.2的核苷酸序列經(jīng)過重組構(gòu)建而成，該口服制劑還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑，其特 征是所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素N通過以下步驟獲得(1) 設計分別帶有S"mH I和I酶切位點的用于克隆金黃色葡萄球菌 腸毒素N成熟肽序列的上下游引物SEQ ID NO.3: gca gga tcc gat agg aaa aat g，劃線部分為5amH I酶切位點， SEQ ID NO.4: cgc etc gag cta cag aac caa a，劃線部分為屈o I酶切位點，(2) 以金黃色葡萄球菌基因組為模板，采用PCR擴增獲得編碼金葡菌腸 毒素N蛋白成熟肽的基因片段，分別將其連入pGEN-T質(zhì)粒載體上的多克隆位 點，構(gòu)建pGEM-T-SEN重組質(zhì)粒，通過測序證實具有SEQ ID NO.2的序列的 基因片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中的編碼相同蛋白質(zhì)的基因序列完全一致；(3) 以pGEM-T-SEN質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得兩端帶有酶切位點的編 碼金葡菌腸毒素N蛋白成熟肽的基因序列，將上述基因片段用內(nèi)切酶5amH I 和^2oI進行酶切后與用相同內(nèi)切酶處理后的pGEX-4T-l質(zhì)粒相連接，構(gòu)建表 達質(zhì)粒pGEX-4T-l-SEN;(4) 將pGEX-4T-l-SEN表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，誘導表達帶GST 標簽的重組GST-SEN融合蛋白。收獲菌體并破碎后離心收集上清，依次采用 親和層析、離子層析、凝膠層析獲得高純度的重組金葡菌腸毒素N。
3. 根據(jù)權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑，其特 征是所述藥物的給藥方式選用口服給藥、胃腸道給藥或非胃腸道外給藥。
4. 根據(jù)權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑，其特征是該口服制劑含有的藥物賦形劑或載體包括防止或抑制腸糜蛋白酶蛋白水 解活性的成分、防止或抑制腸胰蛋白酶蛋白水解活性的成分、防止或抑制胃蛋 白酶蛋白水解活性的成分、吸收促進劑和生物制品中可接受的組分和輔料。
5. 根據(jù)權利要求1所述的重組金黃色葡萄球菌腸毒素N 口服制劑在制備 治療惡性腫瘤以及其他嚴重并發(fā)癥藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供重組金黃色葡萄球菌腸毒素N口服制劑，所述重組金黃色葡萄球菌腸毒素N具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列，該口服制劑還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。本發(fā)明通過Caco-2單層細胞跨膜轉(zhuǎn)運試驗證實了該蛋白可以以完整分子的形式透過小腸上皮細胞進入全身血液循環(huán)并能保持其促脾淋巴細胞增殖以及抑制腫瘤細胞生長的超抗原活性，在制備治療惡性腫瘤以及其他嚴重并發(fā)癥藥物中的應用。
文檔編號A61P37/00GK101293096SQ20081006247
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月12日 優(yōu)先權日2008年6月12日
發(fā)明者丁 丁, 陳樞青 申請人:浙江大學