專利名稱：：人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因的克隆、新型真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在血液系統(tǒng)疾病及腫瘤研究方面的應(yīng)用。具體地，涉及從人肝臟組織中克隆"甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶"基因，構(gòu)建含熒光蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其應(yīng)用于細(xì)胞的耐藥性研究。
背景技術(shù)：
：基因治療已成為腫瘤生物治療領(lǐng)域內(nèi)最引人矚目的研究熱點(diǎn)，是繼手術(shù)、放療、化療及免疫治療之后的又一種極有前景的治療模式。腫瘤的基因治療包括多種技術(shù)與方法，如反義核酸阻斷技術(shù)、自殺基因?qū)氲鹊?。一種較新的策略是將耐藥基因(DrugResistanceGene)通過(guò)合適的載體導(dǎo)入正常組織細(xì)胞，從而增強(qiáng)正常細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗藥性，借以擴(kuò)大化療藥物安全劑量范圍并盡可能減少化療帶來(lái)的毒副作用。近年國(guó)內(nèi)、外在腫瘤基因治療相關(guān)領(lǐng)域的研究結(jié)果顯示了基因治療的誘人前景。甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(06-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)是存在于生物體內(nèi)的一種特異性DNA修復(fù)酶，它能在DNA交聯(lián)形成前將烷化基團(tuán)轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，從而修復(fù)DNA分子上鳥嘌呤的損傷，同時(shí)MGMT在轉(zhuǎn)甲基后即發(fā)生不可逆地失活。目前的研究還未發(fā)現(xiàn)有其它蛋白質(zhì)參與此過(guò)程，因此MGMT是決定細(xì)胞對(duì)烷化劑類藥物耐受的分子基礎(chǔ)。人MGMT基因定位于10q26，cDNA全長(zhǎng)769bp，含有一個(gè)621bp的氨基酸編碼序列，表達(dá)含207個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物。MGMT的特點(diǎn)之一是在不需要任何輔助因子或蛋白質(zhì)的條件下執(zhí)行垸基轉(zhuǎn)移功能，這就賦與了MGMT作為耐藥基因用于基因治療研究的先天優(yōu)勢(shì)。MGMT對(duì)烷化劑損傷的修復(fù)使它在腫瘤化療中發(fā)揮雙重作用一方面保護(hù)正常細(xì)胞免受烷化劑的損傷；另一方面引起腫瘤組織對(duì)烷化劑類化療藥物的耐藥性。在MGMT與腫瘤發(fā)生相關(guān)性方面，國(guó)外近年的研究表明MGMT基因失活在諸多癌癥發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。正常情況下DNA修復(fù)酶對(duì)細(xì)胞具有抑制突變的保護(hù)作用。若各種原因造成MGMT表達(dá)降低或者出現(xiàn)基因沉默即不表達(dá)，則使細(xì)胞失去了DNA修復(fù)酶的保護(hù)作用，隨之惡性突變的發(fā)生機(jī)率明顯升高。若MGMT在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，會(huì)使腫瘤對(duì)垸化劑類化療藥物產(chǎn)生耐藥性進(jìn)而使化療失敗。另一方面，正常組織細(xì)胞中若MGMT高表達(dá)，則表現(xiàn)為有益的保護(hù)作用。因此目前如何調(diào)控MGMT的表達(dá)而達(dá)到最佳化療效果己成為腫瘤治療中倍受關(guān)注的問(wèn)題。在基因治療研究中表達(dá)載體的選擇很重要。必須選擇合適、有效而且對(duì)人體無(wú)危害的基因表達(dá)載體。目前常用的有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、質(zhì)粒及共軛DNA分子等。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以整合入宿主DNA，持久表達(dá)目的基因，但隨機(jī)整合可能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生插入突變和惡性變，且此種載體只能在細(xì)胞分裂期進(jìn)行轉(zhuǎn)染，大大限制了其應(yīng)用。腺病毒載體能定位于細(xì)胞核DNA并高水平表達(dá)外源DNA，但具免疫原性的特點(diǎn)限制了其應(yīng)用。腺相關(guān)病毒載體具有先天缺陷，其可插入片段較小并有插入性突變的危險(xiǎn)，大劑量使用時(shí)亦可引起宿主免疫反應(yīng)。與之相比質(zhì)粒載體具有穩(wěn)妥可靠和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，是目前基因轉(zhuǎn)染研究中較為常用的方法，且隨著細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的進(jìn)步其應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。目前已有含MGMT基因的腺病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病載體構(gòu)建成功并應(yīng)于相關(guān)領(lǐng)域的研究。但如上所述，兩種載體都存在自身載體所具有的先天缺陷，且構(gòu)建過(guò)程要求實(shí)驗(yàn)條件較高，程序復(fù)雜，構(gòu)建及轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功率不高。兩種含有MGMT基因的載體亦不適于細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明中采用了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP作為載體。其本質(zhì)是雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)質(zhì)粒，進(jìn)入多克隆位點(diǎn)內(nèi)的外源基因與EGFP基因共同轉(zhuǎn)錄和翻譯，而翻譯出的EGFP與目的蛋白各具有獨(dú)自的空間結(jié)構(gòu)和生理活性而不會(huì)形成融合蛋白。因?yàn)槟康幕蚺c標(biāo)記基因(EGFP)共用一個(gè)啟動(dòng)子，故所有表達(dá)標(biāo)記蛋白EGFP的轉(zhuǎn)染細(xì)胞必然也同時(shí)表達(dá)目的蛋白MGMT。EGFP所編碼的增強(qiáng)熒光蛋白使得基因轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)變得簡(jiǎn)便而高效。EGFP是從生物發(fā)光水母體內(nèi)提取的一種特殊熒光蛋白，由于其能在活細(xì)胞中直觀地觀察到，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性且能維持較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性，因此可以把EGFP作為標(biāo)記基因用于陽(yáng)性轉(zhuǎn)染克隆的篩選。pIRES2-EGFP另一特點(diǎn)是含新霉素抗性基因(Neo，)，其編碼產(chǎn)物是一種新毒素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neomycinphosphotransferase)，可以使G418失活。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP陽(yáng)性的細(xì)胞由于neo基因的存在故對(duì)G418具有抗性，可在含G418的培養(yǎng)基中存活，據(jù)此原理即可利用G418加壓篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。這也是利用MGMT基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建K562/MGMT細(xì)胞株的理論基礎(chǔ)。目前化療仍是臨床治療腫瘤最主要手段之一。在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)化療藥物對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞亦產(chǎn)生不同程度的毒性作用，這在很大程度上限制了化療藥物在臨床上的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因治療在腫瘤研究領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用愈來(lái)愈廣泛。目前主要的研究方法是在基因水平改變各種與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子或蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到治療或協(xié)助治療腫瘤的目的，這也是本發(fā)明產(chǎn)生的初衷和所要達(dá)到的目的。本發(fā)明構(gòu)建了含人肝臟組織MGMT基因的pIRES-MGMT-EGFP真核表達(dá)載體，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了K562/MGMT細(xì)胞株。通過(guò)白血病K562細(xì)胞和人外周血單個(gè)核細(xì)胞的耐藥實(shí)驗(yàn)，闡述了該質(zhì)粒載體在血液系統(tǒng)惡性疾病及腫瘤的基因治療方面的應(yīng)用，為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了新的技術(shù)資源和手段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能表達(dá)出人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。一種上述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)MGMT基因的克隆自行設(shè)計(jì)上游引物I:5，-GMTTCATGGACAAGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，從人肝臟組織中獲得MGMT的cDNA并擴(kuò)增。PCR優(yōu)化條件如下預(yù)變性94""C5min，變性94°C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30個(gè)循環(huán)，終未延伸72。C5min。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構(gòu)建RT-PCR電泳結(jié)果出現(xiàn)的MGMT目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-T載體按說(shuō)明書連接，常規(guī)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆，大腸桿菌擴(kuò)增后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT克隆載體。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定，確定克隆的正確性。(3)真核表達(dá)載體pIRES-MGMT-EGFP的構(gòu)建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達(dá)載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質(zhì)量比利用T4DNA連接酶4-C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，含卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增、提取質(zhì)粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進(jìn)行PCR鑒定，證明構(gòu)建成功。應(yīng)用上述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建出K562/MGMT細(xì)胞系K562是人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞株，具有很強(qiáng)的增殖功能。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒按l:l質(zhì)量比對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12小時(shí)后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后換用含G418濃度為400ug/ml的1640培養(yǎng)基篩選，以lxl06/ml密度接種6孔板。每三天更換含G418的培養(yǎng)基，篩選約三周，至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細(xì)胞系。K562/MGMT的特征是K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染了權(quán)力要求1中所述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并處于加壓篩選后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染狀態(tài)，高豐度表達(dá)MGMT，適用于MGMT及腫瘤相關(guān)的研究。一種上述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒在耐藥基因研究中的應(yīng)用。一種上述K562/MGMT細(xì)胞系在惡性血液病及腫瘤相關(guān)基因治療研究中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是(1)本發(fā)明采用自行設(shè)計(jì)的引物，通優(yōu)化的RT-PCR條件，克隆了人肝臟MGMT基因，為進(jìn)一步有關(guān)MGMT基因的研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(2)本發(fā)明在基因克隆中所用的克隆載體pGEM-T和構(gòu)建真核表達(dá)載體中所用的質(zhì)粒載體pIRES2-EGFP，具有其他載體所不具備的優(yōu)勢(shì)。尤其是pIRES2-EGFP載體，除了具有普通質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)外，能在轉(zhuǎn)染后表達(dá)"增強(qiáng)熒光蛋白"，使得轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)變得簡(jiǎn)單快捷，高效準(zhǔn)確。(3)本發(fā)明中采用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，達(dá)到了高效轉(zhuǎn)染。所用技術(shù)和轉(zhuǎn)染試劑為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所廣泛采用，故使本發(fā)明具有易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。(4)本發(fā)明應(yīng)用所構(gòu)建的pIRES-MGMT-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞株K562后，檢測(cè)到MGMT蛋白大量表達(dá)，應(yīng)用加壓篩選后形成了K562/MGMT細(xì)胞株，為相關(guān)的血液系統(tǒng)惡性疾病的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)資源。(5)本發(fā)明應(yīng)用pIRES-MGMT-EGFP載體對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行了正常細(xì)胞的抗藥性實(shí)驗(yàn)。在MGMT表達(dá)水平提高以后，相應(yīng)地細(xì)胞對(duì)烷化劑的抗藥性有所提高，預(yù)示了該載體在人類疾病基因治療領(lǐng)域中良好的應(yīng)用前景。(6)本發(fā)明各步所用方法使用常規(guī)分子物學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備即可完成，所構(gòu)建的含人肝臟MGMT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒具有穩(wěn)定的理化性質(zhì)，轉(zhuǎn)染后具有高效表達(dá)的特點(diǎn)，適用于血液系統(tǒng)疾病、腫瘤治療以及基因治療等領(lǐng)域推廣應(yīng)用。圖1是真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖2是真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-MGMT-EGFP的酶切鑒定圖，圖中M為Marker,1為酶切，2為未酶切；圖3是K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-MGMT-EGFP48h時(shí)熒光蛋白(呈現(xiàn)綠色熒光)表達(dá)情況狀態(tài)圖4是轉(zhuǎn)染后三組K562細(xì)胞MGMT在mRNA水平的表達(dá)情況電泳圖，圖中M為Marker,1為未轉(zhuǎn)染組，2為轉(zhuǎn)染目的基因組，3為轉(zhuǎn)染空載體組；圖5是轉(zhuǎn)染后三組K562細(xì)胞MGMT蛋白的表達(dá)情況電泳圖；圖中1為轉(zhuǎn)染MGMT基因組，2為轉(zhuǎn)空載體組，3為對(duì)照組具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供含人MGMT基因及增強(qiáng)熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，同時(shí)提供了該質(zhì)粒在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的具體實(shí)驗(yàn)方法。質(zhì)粒pIRES-MGMT-EGFP的構(gòu)建可在常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成，具有構(gòu)建便捷、易于轉(zhuǎn)染細(xì)胞、易于檢測(cè)蛋白表達(dá)的特點(diǎn)。故具有可推廣性。具體構(gòu)建及應(yīng)用主要過(guò)程如下1.MGMT基因的克隆(1)總RNA的提取及RT-PCR:根據(jù)GeneBank公布的MGMTcDNA序列，自行設(shè)計(jì)上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，其中引物I的5'端含有EcoRI酶切位點(diǎn)，引物II的5'端含有KpnI酶切位點(diǎn)。產(chǎn)物長(zhǎng)度693bp。取新鮮肝臟組織利用Trizol提取總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按條件20°CxlOmin—37°Cx45min—95°Cx5min—4°Cx5min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR優(yōu)化條件如下預(yù)變性94'C5min，變性94。C30s，退火58。C90s，延伸72。C50s，共30個(gè)循環(huán)，終未延伸72°C5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MGMT目的片段，MGMT片段具有序列表SEQIDNo.1所示的基因序列。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構(gòu)建電泳結(jié)果出現(xiàn)MGMT目的條帶，凝膠回收試劑盒回收后與pGEM-T載體按說(shuō)明書連接，利用常規(guī)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆，JM109大腸桿菌擴(kuò)增后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GeneBank公布的序列(NM002412)完全一致，證明克隆成功。2.真核表達(dá)載體pIRES-MGMT-EGFP的構(gòu)建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達(dá)載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質(zhì)量比利用T4DNA連接酶4'C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，含卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增、提取質(zhì)粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進(jìn)行PCR鑒定，證明構(gòu)建成功。3.真核表達(dá)載體pIRES-MGMT-EGFP在真核細(xì)胞的表達(dá)(1)在K562細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與表達(dá)K562是人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞株，具有很強(qiáng)的增殖功能。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，脂質(zhì)體與質(zhì)粒按l:l(經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方案)質(zhì)量比進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12小時(shí)后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達(dá)，24-48小時(shí)達(dá)到明亮狀態(tài)。利用RT-PCR及常規(guī)WesternBlot檢測(cè)48h時(shí)MGMT基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(2)K562/MGMT細(xì)胞系的構(gòu)建瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后換用含G418(篩選濃度400ug/ml)的1640培養(yǎng)基，以lxl0Vml密度接種6孔板。每三天更換含G418(篩選濃度400yg/ml)的培養(yǎng)基，篩選約三周至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細(xì)胞系。經(jīng)篩選的K562/MGMT可直接用于相關(guān)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)或保存于液氮中備用。4.pIRES-MGMT-EGFP相關(guān)的耐藥基因研究(l)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后的耐藥性改變以硝卡芥作為實(shí)驗(yàn)用藥。取K562/MGMT細(xì)胞、轉(zhuǎn)空載體(細(xì)胞株的構(gòu)建步驟同K562/MGMT)細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞分為三組，分別加入不同濃度硝卡芥(1000ug/ml、100Pg/ml、10ixg/ml、lug/ml、0.1ug/ml、0.01ug/ml、0.001ug/ml)，培養(yǎng)72小時(shí)利用MTT法測(cè)定細(xì)胞的IC50值及耐藥指數(shù)(RF值)。(2)轉(zhuǎn)染人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)后的保護(hù)作用以硝卡芥作為實(shí)驗(yàn)用藥。原代培養(yǎng)PBMC并常規(guī)激活，進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，分為轉(zhuǎn)目的基因組(pIRES-MGMT-EGFP)、轉(zhuǎn)空載體組(pIRES2-EGFP)及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，分別加入不同濃度硝卡芥(秦0pg/ml、細(xì)ug/ml、10iig/ml、lug/ml、0.liig/ml、0.01ug/ml、0.001yg/ml),培養(yǎng)72小時(shí)利用MTT法測(cè)定細(xì)胞的IG。值及耐藥指數(shù)(RF值)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>K562細(xì)胞及PBMC細(xì)胞耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果如上表所示。兩者RF顯示其對(duì)烷化劑的耐藥性均有不同程度的增高，且以K562細(xì)胞明增。K562細(xì)胞體現(xiàn)了轉(zhuǎn)染后對(duì)化療藥物耐藥性的增強(qiáng)。PBMC體現(xiàn)了MGMT基因?qū)φ＜?xì)胞免受烷化劑損傷的保護(hù)作用。本發(fā)明從人肝臟中克隆了耐藥基因MGMT的cDNA并重組構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-MGMT-EGFP。含人MGMT基因的病毒載體國(guó)外有個(gè)別報(bào)道，同時(shí)含有增強(qiáng)熒光蛋白的質(zhì)粒真核表達(dá)載體的構(gòu)建國(guó)內(nèi)、外均無(wú)先例。在質(zhì)粒構(gòu)建成功后又利用該質(zhì)粒構(gòu)建了K563/MGMT細(xì)胞株，并檢測(cè)了真核細(xì)胞在轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后的耐藥性改變，為血液病及腫瘤領(lǐng)域的研究提供了新的研究手段。上面的陳述己將本發(fā)明中主要內(nèi)容和關(guān)鍵點(diǎn)闡明，相信能使從事生命科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究的科研人員最大限度的認(rèn)識(shí)和了解本發(fā)明。序列表<110>浙江大學(xué)〈120〉人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與應(yīng)用〈160〉1〈170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉693<212〉麗<213〉人體肝臟〈400>1gaattcatggacaaggattgtgaaatgaei3cgceicc3C3ctggacagccctttggggaag60ctggagctgtctggttgtgagcagggtctgC3cgaaataaagctcctgggca鄉(xiāng)ggacg120tctgcagctgatgccgtggaggtcccagcccccgctgcggttctcggaggtccggagccc180ctgatgcagtgC3C3gCCtggctgaatgcctatttccaccagcccgaggctatcgaagag240ttccccgtgccggctcttcaccatcccgttttccagcaag3gtcgttcaccagacaggtg300ttatggaagctgctgaaggttgtgaaattcgg6lg犯gtg3tttcttaccagcaattagca360gccctggcaggc肪cccca3agccgcgcgagC3gtggg3ggagcaatgagaggcaatcct420gtccccatcctcatcccgtgccacagagtggtctgcagcagcggagccgtgggcaactac480tccggaggactggccgtgaaggaatggcttctggcccatgaaggccaccggttggggaag540ccaggcttgggagggagctcaggtctggcaggggcctggctcaagggagcgggagctacc600tcgggctccccgcctgctggccgaaactgagtatgtgcagt鄉(xiāng)eitggatgtttgagcga660cacacacgtgtaacactgcatcggatgggt3CC69權(quán)利要求1.一種人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能表達(dá)出人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于它具有SEQIDNO.1的核苷酸序列。2.—種權(quán)利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)MGMT基因的克隆自行設(shè)計(jì)上游引物I:5，-GAATTCATGGACMGGATTGT-3，及下游引物II:5，-GGTACCCATCCGATGCAGTGT-3，。利用RT-PCR，從人肝臟組織中獲得MGMT的cDNA并擴(kuò)增。PCR優(yōu)化條件如下預(yù)變性94。C5min，變性94°C30s，退火58。C90s,延伸72。C50s，共30個(gè)循環(huán)，終未延伸72°C5min。(2)克隆載體pGEM-T-MGMT的構(gòu)建RT-PCR電泳結(jié)果出現(xiàn)的MGMT目的條帶用凝膠回收試劑盒回收，與pGEM-T載體按說(shuō)明書連接，常規(guī)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆，大腸桿菌擴(kuò)增后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取pGEM-T-MGMT克隆載體。利用EcoRI和SalI雙酶切鑒定后進(jìn)^1序列測(cè)定，確定克隆的正確性。(3)真核表達(dá)載體pIRES-MGMT-EGFP的構(gòu)建利用EcoRI和SalI分別酶切克隆載體pGEM-T-MGMT和表達(dá)載體pIRES2-EGFP，回收含MGMT片段和pIRES2-EGFP大分子線性片段，前者與后者按2:1的質(zhì)量比利用T4DNA連接酶4'C過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌，含卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增、提取質(zhì)粒。EcoRI和NotI雙酶切鑒定并利用引物I及II進(jìn)行PCR鑒定，證明構(gòu)建成功。3.—種應(yīng)用權(quán)利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建出的K562/MGMT細(xì)胞系，其特征在于，由以下方法實(shí)現(xiàn)K562是人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞株，具有很強(qiáng)的增殖功能。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染12小時(shí)后熒光顯微鏡下可見熒光蛋白表達(dá)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h后換用含G418濃度為400ug/ml的1640培養(yǎng)基篩選，以lx106/ml密度接種6孔板。每三天更換含G418的培養(yǎng)基，篩選約三周，至抗性克隆形成，即為K562/MGMT細(xì)胞系。K562/MGMT的特征是K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染了權(quán)力要求1中所述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并處于加壓篩選后的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染狀態(tài)，高豐度表達(dá)MGMT，適用于MGMT及腫瘤相關(guān)的研究。4.一種權(quán)利要求1所述人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒在耐藥基因研究中的應(yīng)用。5.—種權(quán)力要求3所述的K562/MGMT細(xì)胞系在惡性血液病及腫瘤相關(guān)基因治療研究中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種含人甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其在耐藥基因研究中的應(yīng)用。具本包含了利用RT-PCR從人肝臟組織中獲得MGMT基因的cDNA，克隆入T載體。與含增強(qiáng)熒光蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒酶切重組，構(gòu)建含人MGMT基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞加壓篩選構(gòu)建K562/MGMT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。本發(fā)明還包括了該質(zhì)粒在改變腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞耐藥性方面的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的質(zhì)粒構(gòu)建方法基于常規(guī)的細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)條件，無(wú)需大型和復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)施。操作簡(jiǎn)便，安全高效。所構(gòu)建的質(zhì)粒具有良好的理化穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后易于檢測(cè)，高豐度表達(dá)。本發(fā)明為MGMT相關(guān)的耐藥基因研究以及腫瘤的基因治療研究提供了新的實(shí)驗(yàn)資源與手段，具有較好的推廣與應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61K48/00GK101386869SQ200810063050公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2008年7月8日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者李棟博,王季石,胡申江申請(qǐng)人:浙江大學(xué)