專利名稱：人參皂甙Rg1對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠的干預(yù)作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥單體干預(yù)疾病的領(lǐng)域，具體的說(shuō)是應(yīng)用人參皂甙Rgl對(duì)自 身免疫性腦脊髓炎小鼠進(jìn)行干預(yù)，探討人參皂甙Rgl對(duì)多發(fā)性硬化的神經(jīng)免疫 機(jī)制的干預(yù)作用。
技術(shù)背景多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis, MS)是最常見(jiàn)的神經(jīng)免疫病之一，在 溫帶發(fā)病率可高達(dá)3%>。年輕人易患病，發(fā)病年齡大約在28歲；具有迀延、復(fù) 發(fā)并逐漸惡化的特點(diǎn)，50%患者在首次發(fā)病15年后需借助拐仗行走，致殘率高。 因此，本病危害性極大。由于MS發(fā)病機(jī)制迄今不清，目前尚無(wú)有效的治療方法。 MS的治療主要包括急性發(fā)作期的對(duì)證治療和慢性遷延期的預(yù)防復(fù)發(fā)治療。 目前臨床上應(yīng)用于對(duì)證治療的藥物主要為免疫抑制劑，如激素、硫唑嘌呤、環(huán) 磷酰胺和環(huán)孢素A等，副作用極大，可引起上消化道出血、無(wú)菌性骨壞死、誘 發(fā)和加重感染、肝、腎功能損害、白細(xì)胞下降并影響生f等。而預(yù)防復(fù)發(fā)的藥 物目前較公認(rèn)的是B-干擾素(利比)，緩解復(fù)發(fā)率為60%左右，但長(zhǎng)期療效及安 全性評(píng)價(jià)有待進(jìn)一歩隨訪研究，且價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)老百姓難以承受， 丙此該藥尚未在臨床上廣為應(yīng)用。為尋找一種能夠從減少?gòu)?fù)發(fā)，減輕發(fā)作嚴(yán)重 程度及延緩疾病惡化，并適合我國(guó)國(guó)情(價(jià)格適中)的治療藥物，研究人員已 更多地將目光投向傳統(tǒng)中藥制劑以尋求新的治療手段。我國(guó)傳統(tǒng)的中藥在治療免疫病中有其獨(dú)到的功效，如雷公藤自20世紀(jì)80 年代以來(lái)，便廣泛地應(yīng)用于多種免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及某些腎臟系統(tǒng) 免疫性疾病等。但因中藥方劑成份較復(fù)雜，導(dǎo)致作用機(jī)制難以明確、毒副作用 難以控制、藥物劑量難以規(guī)范化，極大限制了其在臨床上的推廣應(yīng)用。H前國(guó) 內(nèi)外已經(jīng)分離出許多中藥單體，其中部分單體在調(diào)節(jié)免疫方面功效確切，如雷公藤甲素(Triptolide，Tri)、人參皂甙Rgl在免疫調(diào)節(jié)、抗炎反應(yīng)等方面均有 獨(dú)到的作用。人參皂甙Rgl作為人參中有效的活性成份已進(jìn)行了較多的實(shí)驗(yàn)研 究。研究發(fā)現(xiàn)Rgl具有選擇性增強(qiáng)老年鼠的免疫功能，而對(duì)健康的青年鼠免疫 功能影響不明顯，因此認(rèn)為Rgl是一種免疫調(diào)節(jié)劑，而不是單純的免疫增強(qiáng)劑。 目前進(jìn)一歩的研究提示人參皂甙Rgl可增強(qiáng)CD4+ T細(xì)胞活性，抑制Thl特異性 細(xì)胞因子并上調(diào)Th2特異性細(xì)胞因子，拮抗Thl細(xì)胞作用并促進(jìn)Th2細(xì)胞增殖， 從而糾正Thl/Th2細(xì)胞的失衡狀態(tài)。但應(yīng)用Rgl干預(yù)MS的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用 研究目前國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是基于已經(jīng)分離出的人參皂甙Rgl中藥單體對(duì)免疫調(diào)節(jié)和抗 炎作用等方面的作用基礎(chǔ)上提出一種應(yīng)用人參皂甙Rgl干預(yù)自身免疫性腦脊髓 炎小鼠的制備方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是 一種應(yīng)用人參皂甙Rgl干預(yù)自身免疫性腦脊髓炎小鼠的制備方法的條件建立，其特征是1、 M0G35-55免疫誘^ C57B1/6小鼠，建立EAE模型。2、 應(yīng)用人參皂甙Rgl對(duì)EAE模型小鼠進(jìn)行干預(yù)。3、 對(duì)生理鹽水對(duì)照組和Rgl干預(yù)組小鼠進(jìn)行臨床表型的觀察。4、 對(duì)生理鹽水對(duì)照組和Rgl干預(yù)組小鼠進(jìn)行病理組織學(xué)分析。 本發(fā)明的人參皂甙Rgl干預(yù)EAE的制備方法1、 材料人工合成M0G35-55 (序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)肽鏈片 段(該片段是已知的)，不完全弗氏佐劑CFA，熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MT)， 百日咳毒素(pertussis toxin， PT)， 人參皂甙Rgl單體，10-12周的C57Bl/6小鼠。2、 步驟(1)乳化液的制備按照每只老鼠100微升乳化劑配制，其中含有MOG 35-55 300Pg， MT 500Pg。用1 XPBS溶解適量的MOG 35-55，將其由Eppendorf管轉(zhuǎn)移到5毫升的注射器內(nèi)，取等體積的CFA (將IFA按照10 M/W補(bǔ)充適量 的MT獲得CFA)轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)5毫升的注射器，注意排盡管內(nèi)的空氣，通過(guò) 細(xì)的連接管將兩管連接，先由抗原端推向CFA端，進(jìn)行乳化，乳化過(guò)程中連接 管置于冰上，反復(fù)抽推直至阻力明顯增大，取一滴乳化劑滴入水中，乳化劑呈 現(xiàn)球形而不分散則說(shuō)明乳化完全，如出現(xiàn)平展擴(kuò)散即為未乳化好，需要繼續(xù)抽 推進(jìn)一步乳化。(2) 小鼠麻醉水合氯醛，3W/g，小鼠腹腔注射。(3) 模型誘導(dǎo)100 !4/只乳化液，雙腋下皮下注射；PT 200ng/只，尾靜 脈注射。(4) Rgl干預(yù)組誘導(dǎo)當(dāng)日起,Rgl以10見(jiàn)g/Kg/日對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)(5) 生理鹽水對(duì)照組誘導(dǎo)當(dāng)日起,生理鹽水以與Rgl等體積的量，對(duì)EAE 小鼠進(jìn)行干預(yù)。(6) EAE模型臨床表型的觀察-臨床分級(jí)_臨床表現(xiàn)_0 無(wú)癥狀0.5 尾部部分無(wú)力1.0 尾部癱瘓2.0 共濟(jì)失調(diào)，后肢輕癱2.5 單側(cè)后肢的癱瘓3.0 雙后肢癱瘓3.5 后肢癱瘓，伴有前肢無(wú)力4.0 四肢癱瘓5.0 死亡(7) EAE發(fā)病高峰期，小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，取腦組織和頸膨大，腰膨 大，4%的多聚甲醛固定，脫水，浸臘，固定，石蠟包埋，切片，服染色。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明應(yīng)用人參皂甙Rgl干預(yù)自身免疫性腦脊 髓炎小鼠，故本發(fā)明的人參皂甙Rgl可以明顯降低多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型一E旭 小鼠的發(fā)病率。


圖1生理鹽水對(duì)照組和Rgl干預(yù)EAE組發(fā)病情況的比較，Rgl可以明顯降 低EAE的發(fā)病率。圖中上方曲線為生理鹽水對(duì)照組，下方曲線為Rgl治療組;T5 為分值，廣41為時(shí)間。圖2生理鹽水對(duì)照組小鼠脊髓腰膨大HE染色，可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)包 膜及白質(zhì)，20倍放大。圖'3生理鹽水對(duì)照組小鼠脊髓腰膨大HE染色，可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)包 膜及白質(zhì)，40倍放大。圖4Rgl干預(yù)組小鼠脊髓腰膨大HE染色，見(jiàn)少量的膠質(zhì)細(xì)胞增生，未見(jiàn)大 量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)包嫫及白質(zhì)，20倍放大。圖5 Rgl干預(yù)組小鼠脊髓腰膨大HE染色，見(jiàn)少量的膠質(zhì)細(xì)胞增生，未見(jiàn)大 量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)包膜及白質(zhì)，40倍放大。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例h人參皂甙Rgl對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠進(jìn)行干預(yù)的條件建立1、 M0G35-55 (300Pg/只〉免疫誘導(dǎo)10-12周齡的C57B1/6小鼠，建立EAE模型。2、 誘導(dǎo)當(dāng)日起，應(yīng)用人參皂甙Rgi (iOmg/Kg/日)對(duì)EAE模型小鼠進(jìn)行干預(yù)。3、 根據(jù)臨床分級(jí)表，對(duì)生理鹽水對(duì)照組和Rgl干預(yù)組小鼠進(jìn)行臨床表型的 觀察。4、 EAE發(fā)病高峰期，取生理鹽水對(duì)照組和Rgl干預(yù)組小鼠的腦組織、頸膨大和腰膨大，進(jìn)行病理組織學(xué)分析。
本實(shí)施例的人參皂甙Rgl干預(yù)EAE的制備方法
1、 材料人工合成MOG35-55 (序列為MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)肽鏈片
段，不完全弗氏佐劑CFA,熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MT),百日咳毒素(pertussis toxin，PT)，人參皂武Rgl單體，10-12周的C57B1/6 小鼠。
2、 步驟
(1) 乳化液的制備按照每只老鼠100微升乳化劑配制，其中含有MOG 35-55 30()Hg, MT 500Pg。用1XPBS溶解適量的MOG 35-55，將其由Eppendorf 管轉(zhuǎn)移到5毫升的注射器內(nèi)，取等體積的CFA (將IFA按照10 tig/W補(bǔ)充適量 的MT獲得CFA)轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)5毫升的注射器，注意排盡管內(nèi)的空氣，通過(guò) 細(xì)的連接管將兩管連接，先由抗原端推向CFA端，進(jìn)行乳化，乳化過(guò)程中連接 管置于冰上，反復(fù)抽推直至阻力明顯增大，取一滴乳化劑滴入水中，乳化劑呈 現(xiàn)球形而不分散則說(shuō)明乳化完全，如出現(xiàn)平展擴(kuò)散即為未乳化好，需要繼續(xù)抽 推進(jìn)一步乳化。
(2) 小鼠麻醉水合氯醛，3W/g，小鼠腹腔注射。
(3) 模型誘導(dǎo)100 W/只乳化液，雙腋下皮下注射；PT 200ng/只，尾靜 脈注射。
(4) Rgl干預(yù)組誘導(dǎo)當(dāng)日起，Rgl以10mg/Kg/日對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)
(5) 生理鹽水對(duì)照組誘導(dǎo)當(dāng)日起,生理鹽水以與Rgl等體積的量，對(duì)EAE
小鼠進(jìn)行干預(yù)。
(6) EAE模型臨床表型的觀察
_臨床分級(jí)_臨床表現(xiàn)_
0 無(wú)癥狀
0.5 尾部部分無(wú)力L 0 尾部癱瘓
2.0 共濟(jì)失調(diào)，后肢輕癱
2.5 單倒后肢的癱瘓
3.0 雙后肢癱瘓
3.5 后肢癱瘓，伴有前肢無(wú)力
4.0 四肢癱瘓
5.0 死亡
(7) EAE發(fā)病高峰期，小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，取腦組織和頸膨大，腰膨 大，4%的多聚甲醛固定，脫7jc，浸臘，園定，石蠟包埋，切片，服染色。
權(quán)利要求
1、一種應(yīng)用人參皂甙Rg1干預(yù)自身免疫性腦脊髓炎小鼠的制備方法的條件建立，其特征是1)MOG35-55免疫誘導(dǎo)C57B1/6小鼠，建立EAE模型；2)應(yīng)用人參皂甙Rg1對(duì)EAE模型小鼠進(jìn)行干預(yù)；3)對(duì)生理鹽水對(duì)照組和Rg1干預(yù)組小鼠進(jìn)行臨床表型的觀察；4)對(duì)生理鹽水對(duì)照組和Rg1干預(yù)組小鼠進(jìn)行病理組織學(xué)分析。
2、 本發(fā)明的人參皂甙Rgl干預(yù)EAE的制備方法1) 材料人工合成MOG35-55肽鏈片段，不完全弗氏佐劑CFA，熱滅活的結(jié) 核分枝桿菌，百日咳毒素，人參皂甙Rgl單體，10-12周的C57Bl/6小鼠；2) 步驟(1) 乳化液的制備按照每只老鼠100微升乳化劑配制，其中含有MOG 35-55 300Hg， MT 500Pg;用1 XPBS溶解適量的MOG 35-55，將其由Eppendorf 管轉(zhuǎn)移到5毫升的注射器內(nèi)，取體積的CFA轉(zhuǎn)移至另外一個(gè)5毫升的注射器， 先由抗原端推向CFA端，進(jìn)行乳化；(2) 小鼠麻醉水合氯醛，3W/g，小鼠腹腔注射；(3) 模型誘導(dǎo)100 W/只乳化液，雙腋下皮下注射；PT 200ng/只，尾靜 脈注射；(4) Rgl干預(yù)組誘導(dǎo)當(dāng)日起，Rgl以10mg/Kg/日對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)；(5) 生理鹽水對(duì)照組誘導(dǎo)當(dāng)日起，生理鹽水以與Rgl等體積的量，對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)；(6) EAE模型臨床表型的觀察:臨床分級(jí)臨床表現(xiàn)0無(wú)癥狀0. 5尾部部分無(wú)力1. 0尾部癱瘓2.0共濟(jì)失調(diào)，后肢輕癱2. 5單側(cè)后肢的癱瘓3.0雙后肢癱瘓3. 5后肢癱瘓，伴有前肢無(wú)力4.0四肢癱瘓5. 0死亡(7)EAE發(fā)病高峰期，小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后，取腦組織和頸膨大，腰膨 大，4%的多聚甲醛固定，脫水，浸臘，固定，石蠟包埋，切片，HE染色。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的等體積的CFA是將IFA按照10 一l補(bǔ)充MT獲得CFA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是所述的乳化過(guò)程中是連接 管置于冰上，反復(fù)抽推直至阻力明顯增大，取一滴乳化劑滴入水中，乳化劑呈 現(xiàn)球形而不分散則說(shuō)明乳化完全；出現(xiàn)平展擴(kuò)散即為未乳化好，需要繼續(xù)抽推 進(jìn)一步乳化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人參皂甙Rg1對(duì)自身免疫性腦脊髓炎小鼠的干預(yù)作用，屬中藥單體干預(yù)疾病的領(lǐng)域。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽MOG_35-55免疫C57BL/6小鼠自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型，是國(guó)際公認(rèn)的多發(fā)性硬化的小鼠動(dòng)物模型，建立該模型，并在誘導(dǎo)同時(shí)，應(yīng)用人參皂甙Rg1進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)觀察人參皂甙Rg1對(duì)EAE模型的表型的影響和病理組織學(xué)的影響，得到人參皂甙Rg1可以明顯降低自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病率。因此，人參皂甙Rg1有一定的干預(yù)多發(fā)性硬化的作用。本發(fā)明的人參皂甙Rg1可以明顯降低多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型—EAE小鼠的發(fā)病率。
文檔編號(hào)A61P37/00GK101244280SQ20081007069
公開(kāi)日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者吳志英, 檸 王 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院;福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院