專利名稱：一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明更具體涉及了一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物。
技術(shù)背景對(duì)于貧血的治療方法的選用需要根據(jù)貧血的病因來(lái)確定，對(duì)于急性失血性貧血可以采用最常見的輸血 來(lái)補(bǔ)血，但是，對(duì)于慢性貧血以及骨髓造血功能障礙所引起的貧血就不是簡(jiǎn)單的輸血就能夠解決的。骨髓移植是目前采用的補(bǔ)血方法之一， 一般用在再生障礙性貧血病人或者白血病病人的補(bǔ)血治療上， 但是因?yàn)橛糜诠撬枰浦驳脑煅杉?xì)胞需要配型，且來(lái)源及其有限，因此也限制了該種治療方法的應(yīng)用，干 細(xì)胞的來(lái)源是個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題，因此，期望著能夠自身克隆干細(xì)胞的方法的出現(xiàn)。除了輸血、骨髓移植等補(bǔ)血方法治療貧血外，用于補(bǔ)血的就是藥物補(bǔ)血。在我國(guó)有各種各樣的補(bǔ)血藥 物，而最常見最著名的補(bǔ)血藥物就是阿膠，阿膠不但有補(bǔ)血、止血還有造血的功能，其卓越的功效己經(jīng)被 千百年來(lái)的臨床應(yīng)用所證實(shí)。在國(guó)際上的補(bǔ)血類藥物有紅細(xì)胞生成素(EP0)、白介素(IL-ll)以及粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。 EPO主要是應(yīng)用在促進(jìn)紅系祖細(xì)胞向成熟的紅細(xì)胞分化，IL-11是用來(lái)提升血小板的數(shù)量，GM-CSF主要是 促進(jìn)祖細(xì)胞增殖的功效。該類藥物在臨床上用于治療骨髓造血機(jī)能的貧血，其生產(chǎn)方式大都是基因工程的 方法生產(chǎn)，蛋白質(zhì)的氨基酸組成大都超過(guò)100個(gè)氨基酸，分子量較大。多肽是以氨基酸為單位的一類涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì),且常經(jīng)過(guò)糖基化、磷酸化 或?；苌?具有安全、副作用小，用量小，功能多樣、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在細(xì)胞生理及代謝功能的調(diào)節(jié) 上具有重要的作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物，該類藥物具有治療多種骨 髓造血干祖細(xì)胞缺陷性疾病、先天性貧血和再生障礙性貧血，以及各種失血性貧血疾病，也應(yīng)用于白血病 病人的骨髓移植的治療等，該類藥物是一種可解決造血干細(xì)胞缺陷所引發(fā)的全血細(xì)胞減少癥的藥物，是可 以有效解決造血干細(xì)胞缺陷導(dǎo)致的疾病的有效藥物。本發(fā)明的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列〈1〉和編碼 短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1〉 J-Asn-A印-B-Gly-0-Lys其中，J代表氨基酸Phe或lie; B代表氨基酸Ala或Leu; 0代表氨基酸Leu或Glu; <2> GCA或GCG AAT GCA GTT GGC CTT AAA 所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì)應(yīng)的氨基酸。本發(fā)明的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽片段，其氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主 序列》70%的相同性，》90%的相似性，片段為把所述的7個(gè)氨基酸的序列從任意位置截取成3個(gè)或4個(gè) 或5個(gè)或6個(gè)氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發(fā)明的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽類似物具有與所述短肽相同的生物活性，所述 類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì) 而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽衍生物，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序 列》70%的相同性，》90%的相似性，該衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者幾個(gè)氨基 酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。本發(fā)明的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽變體，其氨基酸序列具有與短肽氨基酸主序列 》70%的相同性，》90%的相似性，該變體是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或 編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或 替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。本發(fā)明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療人髓系各 類造血細(xì)胞所引起的貧血癥、診斷與檢測(cè)貧血的發(fā)生以及貧血發(fā)生程度藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的短肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進(jìn)劑或者親和試劑的藥物或者檢測(cè)試 劑的應(yīng)用。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的短肽來(lái)自于運(yùn)用生物信息學(xué)的方法把國(guó)際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白進(jìn)行序 列比對(duì)，篩選出來(lái)的一種新型的具有活性功能的生物活性肽，運(yùn)用本發(fā)明的短肽促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無(wú)副作用。本發(fā)明的肽類藥物具有治療多種骨髓造血干祖細(xì)胞缺陷性疾病、先天性貧血和 再生障礙性貧血，以及各種失血性貧血疾病，也應(yīng)用于白血病病人的骨髓移植的治療等，該類藥物是一種 可解決造血干細(xì)胞缺陷所引發(fā)的全血細(xì)胞減少癥的藥物，是可以有效解決造血干細(xì)胞缺陷導(dǎo)致的疾病的有 效藥物。


圖1是本發(fā)明涉及的短肽促進(jìn)再生障礙性貧血病人骨髓有核細(xì)胞增殖的試驗(yàn)結(jié)果。其中增殖率的i十算 是試驗(yàn)組和對(duì)照組的比值，圖中，橫坐標(biāo)表示本發(fā)明涉及的肽的濃度，縱坐標(biāo)表示該肽促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì) 胞的增殖率。
具體實(shí)施方式
短肽的制備方法采用化學(xué)合成的方法，即本領(lǐng)域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法，既可以采用 Boc方法也可以采用Fmoc方法。具體做法就是將被保護(hù)的氨基酸逐個(gè)偶聯(lián)到惰性固相載體上去，然后利用 強(qiáng)酸將肽鏈從載體上裂解下來(lái)，同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)。短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì)應(yīng)的氨基酸，例如，在 J位置的氨基酸有2種Phe或Ile;，此2種氨基酸都可以單一地安放在〈1〉中J的位置上，不管選擇其中 任何一種，該短肽仍具有其原有的生物活性，即一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖，同樣地B和O所代表的位置 的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制備；編碼短肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；(c) 與(a)或(b)中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；該核苷酸基本由編碼具有〈1〉氨基酸序列短肽的核苷酸組成，本發(fā)明的核苷酸序列包括〈2〉中的核苷酸 序列，其形式為DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的也可以是雙鏈的。編碼短肽的編 碼區(qū)序列可以和〈2〉中的核苷酸相同，也可以不同，稱為變異體,.其中變異體是指具有編碼〈1〉中的氨基酸 序列的編碼，但可以和〈2〉中的核苷酸不同。變異體可以是一個(gè)或幾個(gè)核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸 序列，但不會(huì)改變編碼〈1〉中氨基酸序列的短肽的活性功能。該短肽或核苷酸的"變體"是指一種具有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列。改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替換。變體可具有"保守性"改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，也可以有"非保守性"改變，其中替換的氨基酸不具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷 酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸的缺失；"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中間任意位置插入一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；"添加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸；"替 換"是指用不同的氨基酸或核苷酸替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸。該短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療包括但不限于下 述疾病的藥物的用途促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的造血類短肽藥物。例如治療多種骨髓造血干祖細(xì)胞缺陷性疾病、先天性貧 血和再生障礙性貧血，以及各種失血性貧血和血小板減少癥疾病，也應(yīng)用于白血病病人的骨髓移植的治療 等，也就是本發(fā)明涉及的肽類藥物是一種可解決造血干細(xì)胞缺陷所引發(fā)的全血細(xì)胞減少癥的藥物。在計(jì)算短肽片段、短肽衍生物和短肽變體的氨基酸主序列具有與短肽氨基酸主序列的相同性和相似性 時(shí)，"相同性百分率"是指兩種或多種氨基酸或核酸序列比較中序列相同的百分率。根據(jù)Cluster法 (Higging D.G. & Sharp P.M. ，Gene 1988， 73:234-237 )通過(guò)檢査所有配對(duì)之間的距離將各組序列排列 成簇，然后將各簇以成對(duì)或成組分配。兩個(gè)氨基酸序列如序列A和序列B之間的相同性百分率通過(guò)下式計(jì)算_序列A與序列B之間匹配的殘基個(gè)數(shù)X 100%_序列A的殘基個(gè)數(shù)-序列A中間隔的殘基個(gè)數(shù)-序列B中間隔的殘基個(gè)數(shù) "相似性"是指在確定兩條氨基酸序列比對(duì)中相同氨基酸序列位置確定后，在相同氨基酸之間排列的 對(duì)應(yīng)的氨基酸的保守性取代程度。根據(jù)生物信息技術(shù)領(lǐng)域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff' M. Schwartz, R. M. and Orcutt， B. C. Atlas of Protein Structure 1978， 345-352; DeLisi， C. and Kanehisa, M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85; Schwartz, R. M. and Dayhoff, M. O. Atlas of Protein Structure, 1979.353-358)，當(dāng)相對(duì)應(yīng)的不同氨基酸比較得分》0時(shí)，該兩個(gè)氨基酸相似；當(dāng)不同氨基酸得分 <0時(shí)，兩個(gè)氨基酸不相似。兩個(gè)氮基酸序列如序列C和序列D之間的相似性百分率通過(guò)下式計(jì)算(序列C與序列D之間匹配的殘基個(gè)數(shù)+序列C與序列D之間相似的殘基個(gè)數(shù))X 100%序列C的殘基個(gè)數(shù)_序列C中間隔的殘基個(gè)數(shù)-序列D中間隔的殘基個(gè)數(shù) 其中，序列C中間隔的殘基個(gè)數(shù)和序列D中間隔的殘基個(gè)數(shù)都不包括相似氨基酸的個(gè)數(shù)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施舉例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。 下列所有列舉實(shí)施例所涉及的所有合成短肽都具有本發(fā)明涉及的藥物功能而不限于所列舉功能。 實(shí)施例1促進(jìn)再生障礙性貧血病人骨髓有核細(xì)胞增殖(Ile-Asn-Asp-Leu-Gly-Leu-Lys)人再生障礙性貧血病人骨髓細(xì)胞，經(jīng)過(guò)淋巴細(xì)胞分離液分離出來(lái)單個(gè)核細(xì)胞，種植入96孔細(xì)胞板， 細(xì)胞的培養(yǎng)是用含有10%胎牛血清的D肥M培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，以105/孔的細(xì)胞密度種植，同時(shí)把本發(fā)明涉及 的短肽按照不同的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以等體積的PBS為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該骨髓有核細(xì)胞在 短肽藥物的作用下，3天的促增殖率達(dá)到175%。 實(shí)施例2促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞增殖后的形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)(合成本發(fā)明涉及的短肽片段，在序列中截取4個(gè)或者5個(gè)氨基酸: Asn-Asp-Leu-Gly-或Asp-Leu-Gly-Leu-Lys)骨髓有核細(xì)胞的培養(yǎng)是用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)，以IOV孔的細(xì)胞密度種植入24孔 細(xì)胞板后，立刻把本發(fā)明涉及的短肽按照不同的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以等體積的PBS為對(duì)照組，24 小時(shí)后，把細(xì)胞離心后去上清，用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛前固定細(xì)胞顆粒1天(4'C)以后，1%鋨酸 -1.5%亞鐵氰化鉀后固定1.5h， PBS漂洗；70%酒精飽和醋酸鈾染液塊染，酒精-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹 脂618包埋劑包埋。超薄切片80訓(xùn)，醋酸鈾、檸檬酸鉛各染色5min;在日立Hu-12A型或飛利浦EM 208 型透射電鏡下觀察,細(xì)胞的形態(tài)和對(duì)照組沒有區(qū)別，形態(tài)正常，屬于正常造血。序列表<110>福州大學(xué)<120>—種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物<160><210>3<211>7<212> PRT<213>人工序列<220><223> J代表氨基酸Phe或lie; B代表氨基酸Ala或Leu; O代表氨基酸Leu或Glu <400> 1J-Asn-Asp-B-Gly-O-Lys<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400> 2gca aatgcagttggcctt aaa<210> 3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400> 3gcg aatgcagttggcctt aaa
權(quán)利要求
1.一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽，其特征在于組成短肽的氨基酸主序列<1>和編碼短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Asn-Asp-B-Gly-O-Lys其中，J代表氨基酸Phe或Ile；B代表氨基酸Ala或Leu；O代表氨基酸Leu或Glu；<2>GCA或GCG AAT GCA GTT GGC CTT AAA所述短肽的氨基酸主序列為氨基酸位置固定的主序列，其間隔的位置選擇排列相對(duì)應(yīng)的氨基酸。
2. —種如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽片段，其特征在于短肽片段的氨 基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述片段為把所述的7個(gè) 氨基酸的序列從任意位置截取成4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)氨基酸組成的與所述短肽具有同樣生物活性的短肽。
3. —種如權(quán)利要求l所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽類似物，其特征在于所述短l太類 似物具有與所述短肽相同的生物活性，所述類似物是指在用所述短肽和另一種化合物融合或者用所述 短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽衍生物，其特征在于所述短肽衍 生物的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述衍生物是 指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸的某個(gè)基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后與所述短 肽具有同樣生物活性的短肽。
5. —種如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽變體，其特征在于所述短肽'變體 的氨基酸主序列具有與所述短肽氨基酸主序列》70%的相同性，》90%的相似性，所述變體是指一種具 有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列 或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基 酸或核苷酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 4或5所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物，其特征在于所述編碼短 肽的核苷酸包含下組中的一種(a) 編碼具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷酸；(b) 與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；(C) 與(3)或0))中所述核苷酸有》75%相同性的核苷酸；所述核苷酸采用人工合成方法制備。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽，其特征在于所述的短肽采用化學(xué) 合成方法制備；所述核苷酸采用人工合成方法制備。
8. —種如權(quán)利要求1、 2、 3、 4或5所述的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽的應(yīng)用，其特征在于所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療人髓系各類造血細(xì)胞所引起的貧血癥、診斷與檢測(cè)貧血的發(fā)生以及貧血發(fā)生程度藥物的應(yīng)用。
9. 一種如權(quán)利要求6所述的促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽的應(yīng)用，其特征在于所述核苷酸用于制備具有治療人髓系各類造血細(xì)胞所引起的貧血癥、診斷與檢測(cè)貧血癥的發(fā)生以及貧血發(fā)生的程度藥物的應(yīng)用。
10. —種如權(quán)利要求6所述的一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物的短肽的應(yīng)用，其特征在于所述短 肽或核苷酸用于制備具有作為蛋白酶抑制劑或者促進(jìn)劑或者親和試劑的藥物或者檢測(cè)試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞增殖的肽類藥物。該短肽的短肽片段、類似物、衍生物、變體的氨基酸主序列具有與該短肽氨基酸主序列≥70％的相同性，≥90％的相似性；短肽、核苷酸、短肽片段、短肽類似物、短肽衍生物和短肽變體用于制備具有治療多種骨髓造血干祖細(xì)胞缺陷性疾病、先天性貧血和再生障礙性貧血，以及各種失血性貧血疾病，也應(yīng)用于白血病病人的骨髓移植的治療等，也就是本發(fā)明涉及的肽類藥物是一種可解決造血干細(xì)胞缺陷所引發(fā)的全血細(xì)胞減少癥的藥物。
文檔編號(hào)A61K38/08GK101270151SQ20081007103
公開日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者昊 李, 饒平凡 申請(qǐng)人:福州大學(xué)