專利名稱：仙人掌果及仙人掌果多糖在制備藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及仙人掌果及仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、 抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應(yīng)用，屬于天然植物資源的利用技術(shù)領(lǐng) 域。
(二)
背景技術(shù)：
廣西北海潿洲島是我國最大的死火山島，島上的熔巖給仙人掌生長提 供了充足的養(yǎng)分，加之適宜的熱帶氣候，形成了成片野生的仙人掌。而且 島上的仙人掌四季都可以結(jié)出數(shù)量可觀的仙人掌果。潿洲島產(chǎn)仙人掌果具 有特有的胭脂紅色，其中富含礦物質(zhì)(如硒)和硫磺酸。但迄今為止，潿 洲島盛產(chǎn)的仙人掌果除了極少量被當(dāng)?shù)鼐用窕蚵糜握呤秤猛?，絕大部分都 枯爛在地里，或被鳥、蛇等作為了腹中之餐，造成了資源的極大浪費(fèi)，嚴(yán) 重影響了仙人掌果的充分開發(fā)利用。
中草藥及其活性成分的藥用功能具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)， 成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的熱點(diǎn)，因此近年來天然植物在疾病預(yù)防和治療方面的 作用引起人們的廣泛關(guān)注和重視。仙人掌作為一種天然植物，具有良好的 觀賞價值、食用價值、保健價值和藥用價值，并且藥源豐富，無毒無異味， 開發(fā)產(chǎn)品安全方便。近年來，動物實(shí)驗(yàn)及人體試驗(yàn)證明，仙人掌具有提高 機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗菌、消炎等藥理作用。仙人掌 果(0puntia ficus-indica )為仙人掌屬(Opuntia)植物的果實(shí)，果肉含有
豐富的微量元素、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、多糖類、黃酮類和果膠等。 印第安人和墨西哥人將其作為食物和藥物使用已有幾千年的歷史。國內(nèi)外 對仙人掌根莖具有降血脂和降血糖等作用均有報道，但仙人掌果是否也具 有降血脂和降血糖等活性未見報道。鑒于仙人掌果資源充足，廣西北海潿
洲島產(chǎn)仙人掌果顏色鮮艷，口感甘甜，維生素和多糖的含量高，因此本申 請人對仙人掌果以及從其中分離出的有效部位仙人掌果多糖進(jìn)行了相關(guān) 的藥理試驗(yàn)研究和探索。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是根據(jù)仙人掌果所含的成分，將仙人掌 果及從其中提取分離出的仙人掌果多糖用于制備降血壓、降血脂、降血糖、 抗腫瘤作用的藥物或保健品中。
本發(fā)明是這樣構(gòu)成的仙人掌果(0puntia ficus-indica )在制備降 血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應(yīng)用。
仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或
保健品中的應(yīng)用。
所述仙人掌果多糖是從仙人掌果中提取出來的多糖類成分，其總糖含
量為70% 80%。
具體的仙人掌果多糖的制備方法為取仙人掌果，加4 10倍重量的 水超聲提取0.5 2.5小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調(diào)節(jié)濃縮 液的乙醇濃度至40 90%進(jìn)行沉淀，然后在1000 10000rpm轉(zhuǎn)速下離心 2 10min，離心沉淀物加水溶解，用體積比為1 5 : 2 10的無水乙醇和 乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃 縮，干燥，即得。
其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具體過程為用Sevage溶液(體積比 氯仿正丁醇=4 10 : 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水層液，調(diào)pH至5 7，向水溶液中加入1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保溫20 28h， 1000 10000rpm離心2 10min，去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白 液。
具體的說，仙人掌果、仙人掌果多糖的應(yīng)用方法為取仙人掌果或仙 人掌果多糖，加入或不加藥用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。
或者將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它藥用成分組合，并加入或不加 藥用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。
還可以取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法 制備成保健品。
或者將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它物質(zhì)組合，加入或不加輔料， 按照常規(guī)方法制備成保健品。
為了驗(yàn)證本發(fā)明的效果，下面將通過仙人掌果多糖的制備及對仙人掌 果原汁和仙人掌果多糖進(jìn)行的藥效試驗(yàn)研究來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
一、 仙人掌果多糖的提取純化
取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0.5 2.5小時，提取液 濃縮，加入40 95%的乙醇，調(diào)節(jié)濃縮液的乙醇濃度至40 90%進(jìn)行沉淀， 然后在1000 10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2 10min，離心沉淀物加水溶解，用 體積比為1 5 : 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取1 4次，水層 用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，干燥，即得仙人掌果多糖。
Sevage+木瓜蛋白酶法:用Sevage溶液(體積比氯仿正丁醇=4 10 : 1 5)萃取水溶液1 3次后，取水層液，調(diào)pH至5 7，向水溶液中加入 1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保溫20 28h, 1000 10000rpm離 心2 10min,去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。
經(jīng)測定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量達(dá)60 80%。
二、 仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血壓作用的試驗(yàn)研究
1.仙人掌果及仙人掌果多糖單次及連續(xù)9周給藥對原發(fā)性高血壓大鼠 (SHR)的收縮壓和心率(HR)影響1. 1實(shí)驗(yàn)動物
選擇16周(w)齡雄性SHR60只，收縮壓(SBP)》23. 94kPa (lkPa=7. 5mmHg)，體重(250土50)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司 提供，合格證號SCXK(滬)2003-0003;同齡雄性Wistar大鼠，由廣西醫(yī) 科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號桂動許字2000第001號。飼養(yǎng)在 配備空調(diào)的動物房內(nèi)，室溫(25士2)。C，自由飲水。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1分組及給藥
實(shí)驗(yàn)前馴化并行適應(yīng)性測壓訓(xùn)練2w，待適應(yīng)環(huán)境，隨機(jī)分為6組即 模型組(NC):給蒸餾水;CPFP高劑量組(HD)、中劑量組(MD)、低劑量組(LD): 分別給3. 06g kg-1 d—、 1. 58g kg-1 cT1， 0. 79g kgM d—1的CPFP;仙 人掌果原汁組(NJ):給3.15g，kg—"d—M山人掌果原汁(CPNJ);卡托普利 組(PC):給0.01g'kg—、d—i卡托普利；正常對照組(Wt): Wistar大鼠給 蒸餾水。每組10只，給藥途徑為灌胃。
1.2.2測壓方法
用小型電吹風(fēng)機(jī)對準(zhǔn)大鼠尾巴腹側(cè)烘熱，待大鼠尾巴皮膚變?yōu)槲⒓t 時，將血壓計的壓脈套套至大鼠尾部近心端處，高敏換能器置于尾巴中上 1/3處，換能器表面對準(zhǔn)尾部腹側(cè)，固定，松緊以換能器用手推不動為好。 待大鼠平靜之后，打開記錄系統(tǒng)，可見有脈搏波出現(xiàn)，用充氣囊使壓脈套 內(nèi)的壓力升高到脈搏波完全消失再加壓升高3. 99kPa，然后通過充氣囊閥 門緩慢放氣逐漸降低壓脈套內(nèi)壓力，從開始放氣到管道內(nèi)壓力為零一般維 持時間5 6秒。仔細(xì)觀察脈搏波從被阻斷到再次出現(xiàn)第一個波，這第一 個波出現(xiàn)時所對應(yīng)的壓力即為SBP。取連續(xù)3次測壓值的平均值作為應(yīng)測 SBP值，分別測定第一次用藥前、用藥后2小時(h)、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h及連續(xù)給藥9w期間每周S服的SBP和服。然后再根據(jù)脈搏波間接推 算出HR。
1. 2. 3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均 采用f士s表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方 差分析。
1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 3.1單次給藥對SHR的SBP和服影響
單次給予CPFP后2h即有明顯的降壓效應(yīng)，4h降壓效應(yīng)達(dá)到高峰。4h 時HD與治療前相比有顯著性差異(尸<0. 05) ，MD和LD降壓效應(yīng)較HD稍弱， 與治療前比較均無顯著性差異(尸".05)。 PC給予卡托普利后，2h血壓下 降達(dá)到高峰，與NC和治療前比較有顯著性差異(尸<0.05)，降壓幅度最大 值為0.80土8.03kPa,優(yōu)于HD降壓幅度最大值(O. 68±8. 02kPa)。從降壓 療效維持的時間來看，PC給藥8h后SBP恢復(fù)到治療前水平，CPFP各給藥 組給藥12h后恢復(fù)到治療前水平，其降壓穩(wěn)定性優(yōu)于PC;從降壓幅度來看CPFP降壓呈現(xiàn)明顯的量效和時效關(guān)系。上述各組給藥后24h內(nèi)HR無明顯 變化(/^X). 05)。
1. 3. 2連續(xù)9w給藥對SHR的SBP和HR影響
各給藥組在用藥2w后SBP下降幅度開始明顯，至8w SBP降幅減緩， 基本穩(wěn)定在一個較低的水平。PC、 HD和MD分別在4w、 5w和6w開始與治 療前相比有非常顯著性意義(尸<0.01)， LD和NJ自身前后比較也有差異 (尸<0.05)。 NC在實(shí)驗(yàn)期間血壓趨于升高，9w后SBP平均升高了 1.00kPa， 與治療前相比有非常顯著性差異(/M).01)。組間對比PC、 HD、 MD、 LD和 NJ分別在3w、 4w、 5w、 6w和5w降壓效果均顯著優(yōu)于NC(/M).01)，其降 壓的最大均值分別為2. 16±0. 18、 1.59±1.44、 1.42±0.16、 0.87±0.18 和0.82士0. 19kPa，從降壓幅度來看PC的降壓療效優(yōu)于CPFP給藥組，但 它們之間無顯著性差異(尸X).05)。另外，從降壓幅度來看CPFP連續(xù)給藥 9w降壓也呈現(xiàn)明顯的量效和時效關(guān)系。用藥各組對HR的影響較小，用藥 前后經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異(/lX). 05)。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(S服)血漿腎素(RA) 和血管緊張素II (AngII)的影響
2. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 2. 2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1分組及給藥同實(shí)驗(yàn)l，給藥時間為9w。 2. 2. 2實(shí)驗(yàn)步驟
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主動脈取血各2ml分別置于預(yù)冷的含乙二胺四乙 酸(EDTA) 、 二巰基丙醇和8-羥基喹啉試管中，混勻，4°C， 3000轉(zhuǎn)/分(rpm) 離心10min,分離血漿，-20。C密封保存待測。
血漿RA活性的測定，即測定血漿中血管緊張素I (AngI)產(chǎn)生的速 率。取雙份血漿， 一份讓其直接與抗體反應(yīng)，測其Angl的濃度，作為對 照管；另一份在37匸溫育30min后再讓其與抗體反應(yīng)，測其Angl的濃度 為測定管。測定管AngI的濃度減去對照管Angl的濃度并除以溫育時間， 則為單位時間內(nèi)Angl的產(chǎn)生速度，稱RA活性。
AngII水平的測定操作步驟嚴(yán)格按照分析藥盒使用說明書進(jìn)行，待加 樣操作結(jié)束后混勻，室溫放置15min， 3500rpm離心15 min，吸上清液測 定各管沉淀的放射性計數(shù)(cpm)，并由r計數(shù)器預(yù)先編制的程序直接給出 有關(guān)參數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品濃度。
2.2.3統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
2 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
HD和PC有降低血漿腎素活性的作用，與NC相比均有顯著性差異 (尸<0. 05)，但HD與PC之間無顯著性差異(PX). 05)。在降低血漿AngII方 面，PC最強(qiáng)，HD次之，與NC比較均有非常顯著性差異(尸<0.01)，但HD 與PC之間相比無統(tǒng)計學(xué)意義(/DO. 05); LD和NJ相對較差，與NC比無顯 著性差異(/^X). 05 )。從而提示HD有類似于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑的作 用機(jī)制。
3.仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿內(nèi)皮素 (ET)和一氧化氮(N0)的影響 3. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 3. 2實(shí)驗(yàn)方法
3.2. l分組及給藥同實(shí)驗(yàn)l，給藥時間為9w。 3. 2. 2實(shí)驗(yàn)步驟
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主動脈各取血2ml置于含10%EDTA30 P 1試管中， 混勻。4-C放置約2h后，3000rpm離心10min分離血漿，-20。C密封保存待 測。測試前復(fù)融，按照ET、 NO分析藥盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作。
3.2.3統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與NC相比較，HD和MD有明顯降低SHR血漿ET的作用(尸<0. 05)，但 與PC相比無顯著性差異(/^X). 05); PC、HD和MD能顯著增加NO含量(P<T. 01 或尸<0. 05)，但與PC相比均無顯著性差異(尸;O. 05)。4. 仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血漿NA和腎 上腺素(Adr)的影響
4. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 4. 2實(shí)驗(yàn)方法
4.2. l分組及給藥同實(shí)驗(yàn)l，給藥時間為9w。 4. 2. 2色譜條件
色譜柱為U色譜柱(250iranX4.0mm， 5um);柱溫為室溫；流動相為 甲醇-O. 15mol 1^磷酸二氫鉀緩沖液(1:9， pH6. 0);流速為lml min、 檢測波長為280mn。此條件下分別以NA和Adr計算理論塔板數(shù)不低于3000。
4. 2. 3實(shí)驗(yàn)步驟
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h,以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—1)，自腹主動脈取血1. 5ml置于含肝素試管中，混勻，4°C 條件下2000rpm離心15min，分離血漿；取血漿100ul，加0. 05mol L_1 高氯酸200 y 1, 10000rpm離心2min，倒入Millipore Ultra-free-Mc離 心管，lOOOOrpm離心3min后置-20。C冰箱待測。
4.2.4統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
4. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
血漿樣品的測定取"4.2.3"項(xiàng)處理好的血樣超濾液按上述色譜條 件分析，給藥9w后HD和PC與NC比較，NA顯著降低(尸。.05)。
5. 仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心臟重量及
其指數(shù)的影響
5. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 5. 2實(shí)驗(yàn)方法
5.2. l分組及給藥同實(shí)驗(yàn)l,給藥時間為9w。 5. 2. 2實(shí)驗(yàn)步驟
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹腔 麻醉(5ml kg—》，自腹主動脈取血后，快速取心，置預(yù)冷生理鹽水中洗凈， 剪去殘余組織，用濾紙吸干表面水分，分離左右心室并稱重，室間隔歸左 室。稱取左心室重量，計算表示左心室肥厚程度的左室重量指數(shù)(左心室 重與體重比)。
5.2.3統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
5. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與NC相比，各給藥組的左室重量、左室重量/右室重量和心室重量/ 體重有顯著性差異(尸<0. 05或尸<0. 01); CPFP纟合藥組與PC比較左室重量無 明顯差別(/^0. 05)。
6. 仙人掌果及仙人掌果多糖對原發(fā)性高血壓大鼠(SHR)主動脈和腎 動脈組織形態(tài)學(xué)的影響
6. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 6. 2實(shí)驗(yàn)方法
6.2. l分組及給藥同實(shí)驗(yàn)l，給藥時間為9w。 6. 2. 2實(shí)驗(yàn)步驟
6. 2. 2. 1主動脈HE染色病理形態(tài)觀察
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24h，以20%氨基甲酸乙酯腹 腔麻醉(5ml kg—D ,自腹主動脈取血后，迅速摘取胸主動脈，用福爾馬林 固定，石蠟包埋，HE染色。用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。
6. 2. 2. 2主動脈和腎動脈bFGF、 Ki-67的免疫組化檢測
連續(xù)給藥9w，末次給藥后禁食(不禁水)24小時，以20%氨基甲酸乙酯 腹腔麻醉(5ml *kg—》，自腹主動脈取血后，迅速摘取胸主動脈和腎動脈， 福爾馬林固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟， 梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。
酸性修復(fù)取配置好的檸檬酸緩沖液(pH二6.0士0. 1) 800 1500ml于 壓力鍋中，電爐加熱至沸騰。脫蠟水化后的鄉(xiāng)且織切片置于耐高溫塑料染色 架上，放入己沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣， 從噴氣開始記時，1.5min后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫。取出玻片，先 用自來水沖洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaC19.0g+Na2HP0y 12H20 6.0g +NaH2P04 2H20 0.4g+蒸餾水1000 ml)沖洗三次，每次間隔3min，除去 PBS液。每張切片加50ul 3%過氧化氫，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源 性過氧化物酶的活性。PBS沖洗三次，每次間隔3 min，除去PBS液。
每張切片加50u 1的bFGF-2(sc-79)或Ki-67(cloneSP6)兔抗大鼠多 克隆抗體(均按1:50稀釋)，在4t:下孵育過夜。PBS沖洗三次，每次間隔 3 min，除去PBS液，每張切片加50u 1即用型二步法(非生物素)PV6001 兔二步法檢測試劑盒，室溫下孵育15 min。 PBS沖洗三次，每次間隔3 min， 除去PBS液。
DAB顯色850ul蒸餾水與DAB試劑中A、 B、 C試劑各50 ti 1混勻， 配制成lmlDAB顯色液。每張切片加50ul新鮮配制的DAB溶液，自來水 沖洗，蘇木素復(fù)染30秒，自來水沖洗，返藍(lán)。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、 中性樹膠封固。
結(jié)果判定①bFGF染色結(jié)果判定參考Mattern方法，從以下兩方面 評分陽性染色深度(未見染色為O，輕度染色為l，中度染色為2，深度 染色為3)和陽性細(xì)胞的百分比(未見染色記為0，染色細(xì)胞〈25%為1， 25-50%為2， 〉50%為3)，將這兩方面得分相加。在未知病理診斷的條件下， 在高倍鏡下分別觀察10個視野后，平均得分、記錄。得分0-2分為陰性 表達(dá)，超過2分(3-6)為陽性表達(dá)，其中3-4分為弱陽性，5-6分為強(qiáng)陽性。
②Ki-67標(biāo)記指數(shù)判定參照文獻(xiàn)，以胞核染成均一棕黃色，胞漿及 胞膜不著色為陽性細(xì)胞，隨機(jī)計數(shù)5個以上高倍視野1000個細(xì)胞，平均 每100個細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞核數(shù)為Ki-67指數(shù)(Ki-671)。
6.2.3統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
6. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6. 3.1對SHR組織病理形態(tài)的影響
6. 3. 1. 1組織學(xué)檢査各組變化不明顯。
6. 3. 1. 2光鏡下檢査
Wt:主動脈大部分接近正常，個別內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，中膜未見明顯增厚 (6-8層)，外膜結(jié)締組織未見沉積物。NC:主動脈動脈壁厚薄不一，內(nèi)膜 增生，呈現(xiàn)小的高低起伏狀，內(nèi)皮下間隙可見少量沉積物，內(nèi)皮細(xì)胞不完 整，內(nèi)膜表面可見紅細(xì)胞附壁，部分中膜平滑肌細(xì)胞增生，管壁中膜明顯 增厚(達(dá)11-13層)，外膜結(jié)締組織未見沉積物。HD:主動脈內(nèi)膜輕度增生, 部分增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分中膜輕度增厚(8-IO層)，外膜結(jié)締組織未 見沉積物。MD:主動脈內(nèi)膜輕度增生，可見小的突起。內(nèi)皮細(xì)胞不完整， 部分中膜增厚(10-ll層)，外膜結(jié)締組織未見沉積物。LD:主動脈內(nèi)膜輕 度增生，呈現(xiàn)小的高低起伏狀，內(nèi)皮下間隙可見少量沉積物，內(nèi)皮細(xì)胞不 完整，內(nèi)膜表面可見紅細(xì)胞附壁，部分中膜平滑肌細(xì)胞增生，中膜明顯增 厚(10-12層)，外膜結(jié)締組織未見沉積物。NJ:主動脈內(nèi)膜輕度增生，可 見小的突起。內(nèi)皮細(xì)胞不完整，部分中膜增厚(9-ll層)，外膜結(jié)締組織未
見沉積物。PC:主動脈內(nèi)膜輕度增生，部分增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分中
膜輕度增厚(8-10層)，外膜結(jié)締組織未見沉積物。
6. 3. 2對SHR主動脈和腎動脈平滑肌細(xì)胞(VSMC)bFGF和Ki-67的影響 6. 3. 2. 1對各組主動脈和腎動脈VSMC bFGF含量的影響 bFGF陽性染色主要彌漫性分布于動脈中膜VSMC胞漿中，在高倍視野 下觀察呈顆粒狀；細(xì)胞核幾乎不著色。與NC相比，Wt主動脈和腎動脈VSMC bFGF含量明顯降低(ZM). 01 ) ， HD和MD主動脈VSMC bFGF含量顯著下降 (尸<0. 01或尸<0. 05) ， HD的腎動脈VSMC bFGF的含量也明顯下降(尸<0. 05); 與PC相比，HD、 MD和NJ的VSMC bFGF含量均無明顯差異(尸X). 05)。 6. 3. 2. 2對各組主動脈和腎動脈VSMC Ki-67I的影響 Ki-67陽性反應(yīng)均分布于主動脈中膜VSMC的細(xì)胞核中，胞漿無染色。 與NC相比，Wt、 HD和PC的主動脈和腎動脈VSMC Ki-671明顯減少(/M). 01 或/M). 05) ， NJ的腎動脈VSMC Ki-671也明顯降低(踏05);與PC相比， HD、 MD和NJ的VSMC Ki-671均無明顯差異(/^X). 05)。
降壓實(shí)驗(yàn)研究表明單次給予仙人掌果多糖后2h即有明顯的降壓效 應(yīng)，4h降壓效應(yīng)達(dá)到高峰，降壓幅度最大值為0.68士8.02kPa。 4h時HD 與治療前相比有顯著性差異(尸<0.05)。從降壓療效維持的時間來看，仙人 掌果多糖各給藥組給藥12h后SBP恢復(fù)到治療前水平。從降壓幅度來看仙 人掌果多糖降壓呈現(xiàn)明顯的量效和時效關(guān)系。在連續(xù)9w給藥過程中，仙 人掌果多糖對SHR顯示持續(xù)的降壓作用，各劑量組之間呈現(xiàn)量效和時效依 賴趨勢，其作用特點(diǎn)是平緩、穩(wěn)定。HD和MD與治療前和NC相比有顯著性 差異(尸<0. 01); LD和NJ與NC相比也有顯著性差異(尸<0. 01)，但自身前后 比較不是非常明顯，但也有差異(尸。.05) 。 HD、 MD、 LD和NJ降壓的最大 均值分別為2.16±0.18、 1.59±1.44、 1.42±0.16、 0.87±0.18和 0.82±0. 19kPa。由此說明仙人掌果多糖具有良好的降血壓的作用。
因此，仙人掌果多糖可明顯降低SHR的收縮壓，并呈明顯的時效和 量效關(guān)系；能明顯降低SHR血漿RA、 AngII 、 ET 、去甲腎上腺素(NE) 和升高NO的含量；保護(hù)SHR主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)平滑肌細(xì)胞增殖， 在某種程度上具有逆轉(zhuǎn)SHR耙器官損害的作用。
三、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血脂作用的試驗(yàn)研究 l.仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(HLP)大鼠血脂及肝臟形態(tài) 學(xué)的影響
1.1實(shí)驗(yàn)動物
SD大鼠60只，雄性，體重160土10g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 提供，合格證號為SCXK桂2003-0003;動物飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動 物中心生產(chǎn)(標(biāo)準(zhǔn)飼料)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食、飲水、通風(fēng)和自然采光。
1. 2實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1模型建立及實(shí)驗(yàn)分組
取大鼠60只，隨機(jī)分成為空白組(KB) 10只和高脂造模型組(ZM) 50只。 常規(guī)飼養(yǎng)l周(w)后，禁食不禁水12小時(h)，采血，檢測基礎(chǔ)血脂。參 照文獻(xiàn)方法制備高脂詞料，即由87. 3%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、2%膽固醇、0. 5% 豬膽鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶配制而成。ZM大鼠以高脂飼料喂飼3w后，禁 食(不禁水)12h，采血，檢測血脂。與造模前的血脂比較以確定HLP模型 是否建成。HLP模型造成后，將HLP大鼠按血清總膽固醇(TC)水平分為 5組CPFP高劑量組(HD) 、 CPFP低劑量組(LD)、仙人掌果原汁組(NJ)、陽 性對照組(LF)及HLP模型組(HL)，每組10只。 1.2.2給藥方法
大鼠造模結(jié)束各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃。HD和LD分別給3.06 g kg-1 d1口 0. 79g kg—1 cTCPFP， NJ給3. 15 g kg— d'仙人掌果原 汁；LF給3. 0mg kg—1 d—'洛伐他汀，空白組(KB)及HL以10ml kg^生理 鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)3w。各組均自由飲水。
1. 2. 3攝食量和體重
每日同一時間記錄進(jìn)食量，每w同一時間記錄各組大鼠體重，以便調(diào) 整給藥劑量。
1.2.4TC、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度 脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白AI (apoAI)和載脂蛋白B (apoB)的 測定
給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥lh后，取血，裝入抗凝或不抗 凝試管中，在4。C下3000轉(zhuǎn)/分(rpm)離心10min，分別取血清或血漿，在 全自動生化分析儀上分別測定TC、 TG、 HDL-C、 LDL-C、 apoAI和apoB的
1.2.5 LDL-C/HDL-C、 TG/HDL-C比值和動脈硬化指數(shù)(AI)的計算 根據(jù)單項(xiàng)的血脂測定結(jié)果(TC、 TG、 HDL-C和LDL-C含量)分別計算血
脂綜合指數(shù)(LDL-C/HDL-C、 TG/HDL-C比值以及AI)，其中AI根據(jù)
Frieldwald公式計算AI= (TC - HDL-C) /HDL-C。 1.2.6肝重和肝臟系數(shù)
各組大鼠處死后，迅速摘取肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗再用濾紙吸干 表面水分后，稱重。根據(jù)肝重計算肝臟系數(shù)肝臟系數(shù):肝臟重量(g)/體
重(g)xiooy。。
1. 2. 7肝組織病理學(xué)觀察
取肝組織，切成4-5mm3小塊，10%中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水 75%乙醇90min 959&乙醇90min 100y。乙醇90minX3次 100%二甲苯 60minX2次，62。C浸石蠟2hX2次，包埋后切片6ym，貼于普通載玻片 上。經(jīng)HE染，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。
1. 2. 8統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均 采用3f土s表示，兩組間計量資料比較采用^檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方 差分析。
1. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.3.1造模期間大鼠攝食量和體重變化
造模期間大鼠平均日攝食量和體重均有不同程度的增加。ZM大鼠平均 日攝食量均低于KB，其中第lw有顯著性差異(尸。.05)，可能由于初食高 脂飼料不適應(yīng)有關(guān)；第2、 3w均無顯著性差異(Z^0.05); ZM大鼠體重均 高于KB，但無顯著性差異05)。
1.3.2大鼠HLP模型的建立
喂飼高脂飼料的ZM大鼠3w后測血脂。與造模前相比，血清TC、TG、LDL-C 水平顯著升高(尸<0.01)， HDL-C水平明顯下降(尸<0.05)。說明ZM大鼠存 在著血脂代謝紊亂，HLP模型復(fù)制成功。
1.3.3對大鼠攝食量和體重的影響
給藥期間，各組大鼠生長良好，活動正常。給藥前各組大鼠攝食量和 體重均無明顯差別(尸X).05)。給藥3w后，大鼠平均日攝食量和體重均穩(wěn) 步增加，與KB、 HL相比，各給藥組大鼠平均日攝食量和體重?zé)o顯著性差 異(/IX). 05)，說明CPFP對大鼠攝食量和體重變化無不良影響。
1. 3. 4對HLP大鼠TC、 TG和LDL-C的影響
給藥前，各HLP模型組間大鼠的血清TC、 TG和LDL-C水平相互比較 無顯著性差異(尸X).05)，但都明顯高于KB (尸<0.01)。
給藥3w后，各組與給藥前比較，KB大鼠血清TC、 TG和LDL-C分別升 高1. 84%、 6. 06%和7.14%，均無顯著性差異(/^X). 05); HL大鼠血清TC、 TG和LDL-C分別升高23. 84%、27. 27%和31. 82%，均有顯著性差異(尸<0. 05); HD、 LD、 NJ及LF血脂分別降低:TC(23. 10%、 18.29%、 19. 60%和31. 64%)、 TG(34. 37%、 27. 27%、 24. 64%和35. 48%)和LDL-C(26. 70%、 24. 76%、 19. 29% 和38.42%)，各組TC、 TG和LDL-C均顯著降低(尸<0. 01或尸<0. 05)。
與HL比較，各給藥組大鼠血清TC、 TG和LDL-C水平均非常明顯下降 (尸<0. 01);與LF比較，HD大鼠血清TC、 TG和LDL-C水平均無顯著性差異 (/IX). 05)，說明CPFP能顯著降低HLP大鼠血清TC、 TG和LDL-C， HD和LF
效果均較好。
1. 3. 5對HLP大鼠HDL-C的影響
給藥前，各HLP模型組間大鼠血清HDL-C水平相互比較無顯著性差異 (/^0.05),但都明顯低于KB (尸<0.01)。
給藥3w后，與給藥前比較，KB大鼠血清HDL-(:水平升高0.85%,但 無顯著性差異(尸X). 05); HL降低8.7(m，無顯著性差異0^0. 05); HD、 LD、 NJ和LF分別升高19. 78%、 8. 51%、 8. 60%和13. 83%, HD大鼠血清HDL-C 升高有顯著性差異(尸<0. 05)，其余給藥組均無顯著性差異(/IX). 05)。
與HL比較，各給藥組大鼠血清HDL-C水平均有所升高，HD和LF有顯 著性差異(尸<0. 05)，說明CPFP能升高HLP大鼠血清HDL-C。
1. 3. 6對HLP大鼠apoAI和apoB的影響
給藥3w后，與HL比較，HD、LD、NJ和LF血清apoAI分別升高33. 49%、 5.58%、 3. 49%和21.16%,但均無顯著性差異(/^0. 05); HD、 LD、 NJ和LF 血清apoB分別降低49.269L 40.16%、 47. 18%和50. 15%,均有非常顯著性 差異(AO. 01)。各給藥組間apoAI和apoB水平均無顯著性差異(/^X). 05)。
1. 3. 7對HLP大鼠血脂綜合指數(shù)(LDL-C/ HDL-C、TG/ HDL-C比值和AI) 的影響
給藥3w后，與HL比較，HD、 LD、 NJ和LF血脂綜合指數(shù)分別降低 LDL-C/HDL-C(57. 68%、 52.66%、 49. 84%和62. 38%) 、 TG/HDL-C (63.89%、 57. 41%、 52. 78%和66. 67%) 、 AI (62. 23%、 53. 68%、 51. 54%和65. 80%)，均 有非常顯著性差異(At). 01)。與LF比較，HD無顯著性差異(/^X). 05), LD 和NJ大鼠血清LDL-C/HDL-C和AI比值有顯著性差異(尸<0. 01或尸<0. 05)。
1.3.8對HLP大鼠肝重和肝臟系數(shù)的影響
給藥3w后，與HL比較，HD、 LD、 NJ和LF大鼠的肝重和肝臟系數(shù)都 有不同程度的降低，肝重依次降低15. 16%、 10.15%、 11. 25%和16.99%, HD和LF降低有顯著性差異(尸<0. 05);肝臟系數(shù)依次降低12. 10%、 9. 80%、 10. 09%和13. 26%， HD、 LD、 NJ和LF降低有顯著性差異(風(fēng)01或尸<0. 05)。
與lf比較，各給藥組肝重和肝臟系數(shù)均無顯著性差異(尸;o. 05)。
1. 3. 9對HLP大鼠肝臟脂肪變性的影響
1. 3. 9. 1組織學(xué)檢查
KB:肝臟無異常變化，肝臟表面光滑，有光澤，未見充血、水腫等現(xiàn) 象；HL:肝臟體積增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，切面油膩，無光澤，呈奶 黃色，可見針頭大的細(xì)小顆粒，屬典型肝細(xì)胞脂肪變性；各給藥組肝臟
色澤、質(zhì)地、體積均有明顯改善。
1.3. 9.2光鏡觀察
KB:肝組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列呈條索
狀，以中央靜脈為中心放射狀走行，未見肝細(xì)胞濁腫、脂變和壞死，匯管
區(qū)可見小葉間小血管和毛細(xì)膽管，未見炎細(xì)胞浸潤和淤膽形成等改變，10
只大鼠肝細(xì)胞均未見脂肪變性(0/10);
hl:肝小葉結(jié)構(gòu)欠清晰，io只大鼠均出現(xiàn)了中度至重度的肝細(xì)胞脂肪 變性(10/10)，胞漿中出現(xiàn)大小不等的脂肪空泡，肝細(xì)胞體積普遍變大變
圓，細(xì)胞核被擠在一邊，肝竇明顯變窄或消失，肝細(xì)胞著色較正常細(xì)胞為 淺，胞漿淡染，腺泡內(nèi)多見點(diǎn)狀或灶狀壞死，匯管區(qū)伴有輕-中度炎癥細(xì)
胞浸潤，未見明顯肝纖維化，大部分肝小葉中央靜脈周顯現(xiàn)膽固醇結(jié)晶； 各給藥組肝組織均有不同程度的改善，尤其是HD和LF肝組織有較
大程度改善。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(hlp)大鼠血液流變學(xué)的影
響
2. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。
2. 2實(shí)驗(yàn)方法
2. 2. 1血液流變學(xué)的測定
給藥3w，末次給藥前禁食12h,給藥lh后，取血3.5ml，用血清洗 旋轉(zhuǎn)式粘度計，測全血粘度(高、中、低切)，血漿粘度和紅細(xì)胞壓積值等 血液流變學(xué)指標(biāo)。
2.2.2統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
2. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對HLP大鼠血液流變學(xué)的影響
給藥3w后，與HL比較，HD、 LD、 NJ和LF全血粘度(高切、中切、低 切)、血漿粘度、紅細(xì)胞(RBC)壓積值均有顯著性降低(尸CO. 01或AO. 05); 與LF比較，HD的RBC壓積值、全血粘度(高切)和血漿粘度均顯著性降低 01或尸<0. 05),效果優(yōu)于LF; LD和NJ的RBC壓積值也顯著降低 (尸<0. 05)，說明CPFP對HLP大鼠的血液流變學(xué)異常具有明顯改善作用。
3. 仙人掌果及仙人掌果多糖對高脂血癥(HLP)大鼠抗氧化作用的影
響
3. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 3. 2實(shí)驗(yàn)方法 3. 2. 1樣本處理
給藥3w，末次給藥前禁食12h，給藥lh后，取血，裝入不抗凝試管 中，在4。C下3000rpm離心10min，取血清，分裝，-20。C保存。
3.2.2血清超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定
測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng) 系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作 用下呈紫紅色。嚴(yán)格按照SOD測試盒說明書操作，在550mn處測定SOD的 吸光度(0D)，根據(jù)下列公式計算血清SOD活性
血清SOD活性(U/ml)=(對照管0D值-測定管0D值)+對照管0D值+ 5(mx樣品測試前稀釋倍數(shù)。注每lml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對 應(yīng)的S0D量為一個SOD活力單位(U)。
3. 2. 3血清丙二醛(MDA)含量的測定
測定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MM 可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物。嚴(yán)格按照S0D測試盒說明書操作，在532mn 處測定MDA的0D值，根據(jù)下列公式計算血清MDA含量
MDA含量(mnol/mlh(測定管0D值-測定空白管0D值)+ (標(biāo)準(zhǔn)管0D 值-標(biāo)準(zhǔn)空白管0D值)X標(biāo)準(zhǔn)品濃度X樣品測試前稀釋倍數(shù)。
3.2.4統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對HLP大鼠抗氧化作用的影響
給藥3w后，HD、 LD、 NJ和LF血清S0D活性分別升高50. 06%、 40. 64%、 37. 24%和34. 33%;與HL比較，HD、 LD和NJ有非常顯著性差異(尸<0. 01)， LF有顯著性差異(尸。.05)。血清MDA含量分別降低36， 33%、 32. 72%、 27. 78%
和28.66%，各給藥組均有非常顯著性差異(At).Ol)。另外，各給藥組組間 S0D和MM均無顯著性差異(PX). 05)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論l.仙人掌果多糖具有降脂及調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的作用能降 低高脂血癥大鼠血中的TC、 TG、 LDL-C和apoB水平，升高HDL-C和apoAI 水平；并保護(hù)肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的改變，增強(qiáng)其對脂質(zhì)代謝的作用。
2. 仙人掌果多糖能改善血液粘度和流變性，直接改善血液成分能降 低高脂血癥大鼠的全血粘度(高、中和低)、血漿粘度、RBC壓積，而改善 血液流變性。通過改善血液濃、粘、聚狀態(tài)，促進(jìn)脂類物質(zhì)的代謝。
3. 仙人掌果多糖能清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生可以有效 降低高脂血癥大鼠血清中MDA含量，升高血清中SOD活性，提示仙人掌果 多糖可能通過提高自由基清除酶的活性，維護(hù)體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)與平衡，增 加LDL的抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而發(fā)揮防治高脂血癥 和動脈粥樣硬化的作用。
因此，仙人掌果多糖具有降脂及調(diào)節(jié)脂蛋白代謝的作用，能改善血液 粘度和流變性，直接改善血液成分，清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn) 生，從而發(fā)揮防治高脂血癥和動脈粥樣硬化的作用。
四、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)降血糖作用的試驗(yàn)研究
1.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠糖代謝和一般體征的
影響
1. 1實(shí)驗(yàn)動物
SD大鼠，雌雄各半，體重(200土10)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中 心提供，合格證號為SCXK桂2003-0003;動物飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動物中心生產(chǎn)(標(biāo)準(zhǔn)飼糾。DM模型鼠自由攝食、飲水，通風(fēng)，自然采光。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1 DM大鼠模型建立及指標(biāo)測定 1. 2. 1.1 DM大鼠模型建立及分組
SD大鼠禁食12小時(h)，以60mg kg—'鏈脲霉素(STZ)腹腔注射(STZ 溶解于0. lmol L—\ pH4. 2的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液中，現(xiàn)配現(xiàn)用， 置于冰上)。正常對照組(Sd)大鼠腹腔注射等量上述緩沖液。72h后(大 鼠采血前禁食12h)用血糖(BG)測定儀測定空腹血糖(FBG)值，凡FBG》 13mmol L—4見為DM大鼠模型。
將成模DM大鼠按BG濃度由高到低排序進(jìn)行物理編號，隨機(jī)將DM大 鼠分為DM模型對照組(NC)、胰島素組(IN)、原汁組(NJ)、 CPFP中劑量組 (MD)和CPFP高劑量組(HD)。
1.2.1.2給藥劑量與方法
IN給鳳kg-1 d—1夷島素(Ins)，NJ給仙人掌果原汁3.15g kg—1 cf1， MD和HD分別給1. 58g kg-1 (Tl, 3. 06g kg-1 cf1。每天上午空腹給藥1 次，連續(xù)灌胃8周(w)。
1.2. 1.3 —般體征觀察
觀察大鼠的精神活動、毛發(fā)改變、飲水量、進(jìn)食量和大小便等一般狀 況，并記錄體重變化情況。 1.2.1.4血糖的測定
給藥第4w和第8w，用BG測定儀測定各組FBG，計算并統(tǒng)計分析藥物 對DM大鼠BG水平的影響。
1.2.1.5糖化血紅蛋白(GHB)的測定
給藥8w末，拔大鼠眼球采血2-4ml置于離心管中，以500 1000轉(zhuǎn)/ 分(rpm)，離心5 10分鐘(min)，棄上清留沉淀的紅細(xì)胞，然后用生理鹽 水洗滌2 3次。用GHB測定試劑盒測定GHB含量，具體操作詳見試劑盒 說明書，計算并統(tǒng)計分析藥物對DM大鼠GHB水平的影響。計算公式每 10g GHB吸光度(0D)=測定管0D/2ml血液中GHB克數(shù)X2X 10g
1. 2. 2統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均 采用3f土s表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方 差分析。
1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.3.1對STZ所致DM大鼠的一般狀況的影響 1. 3. 1. 1 —般狀態(tài)觀察
Sd大鼠精神振奮，活動頻繁，毛發(fā)純白有光澤，墊料干燥；NC大鼠 精神萎靡，活動度低，尾巴濕冷，毛發(fā)枯黃、無色澤、脫落，豎毛弓背， 墊料極潮，下腹部及外陰部毛浸濕，大便稀澹，出現(xiàn)"三多一少"的癥狀； 給予CPFP和Ins后，DM大鼠精神逐漸好轉(zhuǎn)，活動增多，皮毛光澤漸好， 墊料比較干燥，大便稀塘減少，"三多一少"的癥狀減輕。
1.3.1.2對DM大鼠體重的影響
在實(shí)驗(yàn)中Sd和IN大鼠體重呈持續(xù)增長趨勢；NC大鼠體重逐步下降， 說明DM大鼠體內(nèi)產(chǎn)生代償，代謝紊亂；給予CPFP后，DM大鼠體重8w時 顯著高于NC同期體重(尸<0. 05)。
1. 3. 2藥物對STZ所致MD大鼠FBG的影響
給藥4w和8w后，各組FBG均有不同程度的降低。與同期NC比較HD、 MD和NJ均有顯著降血糖作用(尸<0. 01)，降糖效果呈現(xiàn)一定的量效和時效 關(guān)系。HD、 MD和NJ之間均無顯著差異(/IX).05)。
1. 3. 3藥物對STZ所致DM大鼠GHB的影響
結(jié)果顯示與NC相比，HD、 MD和NJ的GHB含量顯著降低(尸<0. 01或 尸<0. 05)，但HD、 MD和NJ之間無顯著差異(尸力.05)。提示HD、 MD、 NJ均 能較穩(wěn)定地降低血糖。
2. 仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠脂代謝的影響 2. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。
2. 2實(shí)驗(yàn)方法
2.2. l血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、 LDL-C和高密度脂蛋白 -膽固醇(HDL-C)的測定
給藥8w末，取血，4°C， 3500rpm離心10min，在全自動生化分析儀 上測定血清TC、 TG、 LDL-C和HDL-C含量，并根據(jù)Frieldwald公式計算 動脈硬化指數(shù)(AI): AI二 (TC - HDL-C) /HDL-C。
2.2.2統(tǒng)計學(xué)處理同實(shí)驗(yàn)l。
2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與Sd相比，NC大鼠TC、 TG和LDL-C顯著升高(尸①.01), HDL-C含量 顯著下降(尸<0.05);給藥8w后，與NC相比，HD和IN的TC和TG含量顯 著下降(At). 05) ， LDL-C含量也有所減少，其中HD的LDL-C含量降低效果 顯著(AD.05);同時，HD和IN的HDL-C含量顯著升高(/M).05)。
3.仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影
響
3. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 3. 2實(shí)驗(yàn)方法
3. 2. 1胰腺組織HE染色形態(tài)觀察
給藥8w末，取血后，迅速取胰腺，用福爾馬林固定，石蠟包埋，HE 染色。光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化并拍照。
3. 2. 2胰腺組織a細(xì)胞和e細(xì)胞的免疫組化檢測
給藥8w末，剖腹取胰腺，福爾馬林固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、 切片。組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后，浸泡于水中待用。
酸性修復(fù)取配置好的檸檬酸緩沖液(pt^ 6.0±0. 1) 800-1500ml于 壓力鍋中，電爐加熱至沸騰。脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料染色 架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣， 從噴氣開始記時，1. 5 miri后壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫。取出玻片， 先用自來水沖洗后，置放于卵育盒中。PBS(NaCl 9. 0g+Na2HP04 12H20 6.0g +化1^04*2仏0 0.4§+蒸餾水1000 1111)沖洗三次，每次間隔3min，除去 PBS液。
每張切片加50nl3y。過氧化氫，室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過 氧化物酶的活性。PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。每張切片 加50u 1的Glucagon Ab-1或Insulin Ab-5 (均按1:50稀釋)，在4。C下 孵育過夜。PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液，每張切片加50 u 1 即用型快捷免疫組化Maxvision"抗兔-HRP檢測試劑盒，室溫下孵育15 min。 PBS沖洗三次，每次間隔3min，除去PBS液。
DAB顯色850 u 1蒸餾水與DAB試劑中A、 B、 C試劑各50 u 1混勻， 配制成lmlDAB顯色液。每張切片加50P1新鮮配制的DAB溶液。自來水 沖洗，蘇木素復(fù)染30秒，自來水沖洗，返藍(lán)。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥、 中性樹膠封固。
鏡下觀察各組免疫組化片進(jìn)行綜合評分。1、表達(dá)面積①陽性表達(dá) 細(xì)胞數(shù)為0計為0分。②陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)《2596計為1分；③陽性表達(dá)細(xì) 胞數(shù)為26 50%計為2分；④陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)占51 75%計為3分；⑤陽 性表達(dá)細(xì)胞數(shù)>75%計為4分。2.表達(dá)強(qiáng)度①陽性信號強(qiáng)烈，呈棕褐色，
小塊狀，計為3分，②陽性信號中等，呈棕色，粗顆粒狀，計為2分；③
陽性信號較弱，呈淡棕色，細(xì)顆粒狀，計為l分；④無陽性信號，計為0 分。兩項(xiàng)相加，0分為陰性(-)，2-3分為弱陽性(+) ，4-5分為中度陽性(++)， 6-7分為強(qiáng)陽性(+++)。計數(shù)采用雙盲法。 3. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3. 3. 1對DM大鼠組織病理形態(tài)的影響
Sd胰腺中胰島數(shù)量較多，體積較大，胰島呈圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán)， 邊界清晰，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較多，排列整齊，胞漿豐滿，核多為圓形；NC 胰島數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)破壞，輪廓消失，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì) 胞排列不規(guī)則，邊界不清，部分細(xì)胞腫脹或皺縮壞死，胰島內(nèi)出現(xiàn)空泡； IN胰島數(shù)量明顯增多，輪廓完整，分布規(guī)則，細(xì)胞邊界清晰；HD和MD與 NC相比胰腺病變較輕，胰島輪廓完整，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增多，分布規(guī)則，
胞漿疏松，淡染，細(xì)胞邊界較清晰。
3.3.2藥物對STZ所致MD大鼠胰島P細(xì)胞和a細(xì)胞的影響 3.3.2.1胰島P細(xì)胞Ins表達(dá)情況
結(jié)果顯示:與NC相比較，各給藥組Ins表達(dá)陽性率顯著升高(尸<0. 05)， 表明各給藥組對STZ所致胰島P細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。免疫組 化染色顯示各組表達(dá)Ins程度:NC胰島中央部分著色程度較正常組明顯變 淺，面積縮??；各給藥組中胰島P細(xì)胞著色加深且面積增大。
3. 3. 2. 2胰島a細(xì)胞胰高血糖素表達(dá)情況
結(jié)果顯示與NC相比，各給藥組胰高血糖素表達(dá)無顯著差異 (尸;0.05)。免疫組化染色顯示各組表達(dá)胰高血糖素程度與NC相比，Sd 和各給藥組a細(xì)胞胰高血糖素表達(dá)無顯著差異(/lX).05)。
4. 仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠抗氧化作用的影響 4. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。
4. 2實(shí)驗(yàn)方法
4. 2. 1心肌中丙二醛(MDA)和超氧化歧化酶(SOD)測定 給藥8w末，取血后，取心臟，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，稱重 后，用生理鹽水配成10%心肌勻漿，于冷凍離心機(jī)3000rpm離心15min， 取上清液，按要求用生理鹽水稀釋成一定倍數(shù)后用于心肌MDA和SOD測定。 4. 2. 1. 1血清MDA含量的測定
測定原理采用硫代巴比妥酸(TBA)法。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA 可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收。嚴(yán)格按照SOD測 試盒說明書操作，在532nm處測定MDA的0D值，根據(jù)下列公式計算血清MDA含量
MDA含量(nmol/ml)-(測定管0D值-測定空白管0D值)+ (標(biāo)準(zhǔn)管0D 值_標(biāo)準(zhǔn)空白管0D值)X標(biāo)準(zhǔn)品濃度X樣品測試前稀釋倍數(shù)。 4.2.1.2血清SOD活性的測定
測定原理以黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng) 系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作 用下呈紫紅色。嚴(yán)格按照SOD測試盒說明書操作，在550nm處測定S0D的 吸光度(0D)，根據(jù)下列公式計算血清SOD活性
血清SOD活性(U/ml)=(對照管0D值-測定管0D值)+對照管0D值+ 5(mx樣品測試前稀釋倍數(shù)。注每lml反應(yīng)液中S0D抑制率達(dá)50%時所對 應(yīng)的S0D量為一個SOD活力單位(U)。
4. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
4. 3. 1藥物對DM大鼠心肌MDA和SOD的影響
鏈脲霉素(STZ)所致NC大鼠心肌MDA含量較Sd有顯著增高，SOD 活性則顯著降低，顯示DM大鼠心肌抗氧化能力下降。用藥8w后，與NC 比較，HD、 MD和NJ心肌MDA值均顯著降低(尸⑦.01)，相應(yīng)SOD活性明顯 增高(尸<0.01)，但與IN相比均有顯著差異(/M).01)。
5. 仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響 5.1實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。
5. 2實(shí)驗(yàn)方法
給藥8w后，取血后，摘取心臟，迅速放入預(yù)冷的2.5%戊二醛(用磷 酸緩沖液配制，pH7.2)固定，之后用PBS(pH7.2)漂洗10min三次，放入 1%鋨酸(四氧化鋨)，固定2h， PBS漂洗10min三次，50% 90%乙醇逐級脫 水，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，38°C、 45°C、 6(TC依次聚合36h, LKB-V 超薄切片機(jī)切片，約70nm，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，在H-500型透射電 子顯微鏡下觀察心肌線粒體和心肌纖維等超微結(jié)構(gòu)的變化并拍照。
5. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
電鏡下觀察Sd心肌纖維未見異常，心肌肌節(jié)對位整齊，無肌原纖維
溶解，線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴排列規(guī)則，清晰可見。NC可見心肌肌節(jié)對位錯
亂，呈過度收縮，部分肌原纖維溶解，線粒體腫脹，線粒體邊界不清，部
分嵴斷裂溶解，形成線粒體內(nèi)小空泡，表明鏈脲霉素STZ所致DM大鼠心 肌有一定損傷。各給藥組大鼠心肌肌節(jié)對位基本整齊，僅見少部分錯位， 肌原纖維溶解較少，線粒體稍見腫脹和空泡。
6. 仙人掌果及仙人掌果多糖對糖尿病(DM)大鼠肝和骨骼肌胰島素受 體(InsR)及骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 (GLuT4) mRNA表達(dá)的影響
6. l實(shí)驗(yàn)動物同實(shí)驗(yàn)l。 6. 2實(shí)驗(yàn)方法 6. 2. 1 RNA抽提
6. 2. 2 RNA純度和完整性分析
6. 2. 3總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA
6.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(RT-PCR)
6. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6. 3. 1藥物對鏈脲霉素(STZ)所致DM大鼠肝臟和骨骼肌InsR的影響 結(jié)果顯示各給藥組DM大鼠肝臟和骨骼肌InsR的數(shù)量較NC均有增
加(踏Ol)。
6. 3. 2藥物對STZ所致DM大鼠骨骼肌GLuT4的影響
結(jié)果顯示各給藥組大鼠骨骼肌GLuT4的數(shù)量較NC均有增加
(尸<0. 01) 0
實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過觀察仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠糖代謝、脂 代謝及抗氧化作用的影響，并從組織學(xué)上研究了仙人掌果多糖對胰腺及糖 尿病心肌病的影響。然后從基因水平探討了仙人掌果多糖降糖作用的可能 機(jī)制。提示
1. 本研究采用60mg kg-'—次腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，以 適宜劑量給糖尿病大鼠灌胃仙人掌果多糖后，結(jié)果顯示仙人掌果多糖 能改善糖尿病"三多一少"的癥狀，顯著降低BG和GHB。同時，也降低糖 尿病大鼠的TC、 TG、 LDL-C和AI，升高HDL-C的含量，這表明仙人掌果多 糖促進(jìn)了糖和脂肪的利用，減輕了糖毒性和脂毒性對機(jī)體的損傷，有利于 糖尿病的恢復(fù)和防止并發(fā)癥的產(chǎn)生。
2. 組織形態(tài)學(xué)觀察顯示仙人掌果多糖在降糖和降脂的同時，改善了 STZ所致糖尿病大鼠胰腺的損傷程度，增加胰島e細(xì)胞和胰島素的分泌， 因此促進(jìn)胰島P細(xì)胞修復(fù)，增加胰島素分泌可能是仙人掌果多糖作用機(jī)制 之一。
3. 糖尿病降低了大鼠抗氧化功能，使MDA水平升高，SOD活性降低。 給予仙人掌果多糖后降低了MDA水平，升高S0D活性，這表明仙人掌果多
糖能提高機(jī)體的抗氧化功能，減輕過氧化損傷。
4. 電鏡觀察顯示仙人掌果多糖對STZ所致糖尿病大鼠心肌肌節(jié)對位 錯亂、肌原纖維溶解和線粒體腫脹有不同程度的改善，表明其能減輕糖尿 病導(dǎo)致的心肌損害。
5. 通過RT-PCR對肝臟和骨骼肌InsR、骨骼肌GLuT4分析可知，仙人 掌果多糖能提高InsR和GLuT4的含量，說明其降糖機(jī)制可能是通過增加 InsR和GLuT4含量而產(chǎn)生降糖作用的。
因此，仙人掌果多糖能降低血糖、糖化血紅蛋白和血脂，改善糖代謝 和脂代謝紊亂，提高機(jī)體的抗氧化能力，延緩并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，改善機(jī) 體的狀況，這與其修復(fù)受損的胰島I3細(xì)胞、促進(jìn)胰島素分泌、增加InR和 GLuT4含量有關(guān)。
五、仙人掌果及仙人掌果多糖(CPFP)抗腫瘤作用的試驗(yàn)研究
(一)體外抗腫瘤作用的研究
1. 實(shí)驗(yàn)材料
l.l細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HEPG-2、人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、人胃癌 細(xì)胞株SGC7901由醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞室提供；人肝癌細(xì)胞株HCOLM3、 人肝正常細(xì)胞株L02等由第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤所提供。
2. 實(shí)驗(yàn)方法
2. 1細(xì)胞的培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇
本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌、胃癌、卵巢癌4種細(xì)胞株，于37t)、 5%0)2的培 養(yǎng)箱中，10%新生牛血清以及青鏈霉素各100U/ ml的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
凍存時，取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化、離心、去上清。加入凍存液，使 細(xì)胞密度約為lX10Vml分裝于凍存管中，先置于4aC60分鐘，再置于 -20。C60分鐘，再置-8(TC超低溫冰箱中保存。
復(fù)蘇時，將超低溫冰箱中的腫瘤細(xì)胞凍存管迅速轉(zhuǎn)入37'C水中，保持 凍存管管口部位于水面之上，攪拌加速解凍，待完全解凍后，用75%酒精 棉球擦拭凍存管壁。將解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，加入約6倍凍存液量 的培養(yǎng)基1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)此步一次。再加入培養(yǎng)液， 混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
2.2噻唑藍(lán)(MTT)法確定仙人掌果多糖提取物對腫瘤細(xì)胞的抑制作
用
本實(shí)驗(yàn)選擇胃癌7901、肝癌HEPG-2 、 LM3卵巢癌SK0V3、人正常肝 細(xì)胞L02細(xì)胞株，采用MTT法研究仙人掌果多糖的抗癌效果。取對數(shù)生長 期的腫瘤細(xì)胞株，濃度為5Xl(^個/ml，加入到96孔板，每孔加含細(xì)胞 的培養(yǎng)液100ul，置37。C, 59&C02培養(yǎng)箱孵育48h后，分別加入不同濃度 的仙人掌果多糖，用PBS溶液調(diào)整每孔細(xì)胞總體積為200 u 1， 48h后加入 20ixlMTT(2mg/ml)， 37°C, 5% 0)2培養(yǎng)箱孵育4h后，棄上清，每孔加入 DMS0 200ul，放入酶標(biāo)儀，中速振蕩5分鐘后，于490nm波長處測定吸 光度(0D值)，每個濃度平行測定3孔。以PBS溶液為空白對照，按下列 公式求出生長抑制率(IR)。
實(shí)驗(yàn)組平均0D值
抑制率(IR， ％) = (1— - ) X100%
空白對照平均OD值
2. 3 Annexin V-FITC染色觀察細(xì)胞凋亡
(1) 將LM3細(xì)胞于6孔板內(nèi)生長，處于對數(shù)生長期內(nèi)加入 CPFP(2. 500mg/ml)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組；
(2) 用PBS洗滌細(xì)胞兩次；
(3) 在500u l的Binding Buffer中加入2y 1 Annexin V-FITC， 5u 1 Propidium Iodide， 混勻；
(4) 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使長有細(xì)胞的蓋玻片表面均勻霜生.
(5) 避光、室溫反應(yīng)5分鐘。將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微 鏡下、雙色濾光片(FITC和羅丹明)觀察，Annexin V-FITC熒光信號呈綠 色，PI熒光信號呈紅色。
2.4流式細(xì)胞術(shù)定量檢測細(xì)胞凋亡率
取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)各濃度CPFP作用后，收集細(xì)胞，用結(jié)合 緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為lX107ml，取100n l懸液，加5y 1 Annexin-v/FITC 和10ul碘化丙錠溶液，常溫避光孵育15分鐘，力卩400ul PBS混勻，流式 細(xì)胞儀分析。
2. 5 RT-PCR檢測P53基因mRNA的表達(dá)
2.6蛋白質(zhì)印跡檢測P53相關(guān)蛋白表達(dá)
2. 7統(tǒng)計學(xué)分析
應(yīng)用SPSS13. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均采用^S表示，兩 組間計量資料比較采用t檢驗(yàn)，兩組率的比較采用X2檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較 采用方差分析。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 CPFP對腫瘤細(xì)胞的抑制作用
結(jié)果表明，CPFP不同劑量及5-FU的常用劑量對人體卵巢癌SKOV-3、胃 癌7901、肝癌HEPG-2、肝癌LM3細(xì)胞的增殖有不同的抑制作用。CPFP與5-FU 比較，抑制能力較弱。相同濃度下，CPFP對LM3細(xì)胞的抑制作用較其他株 細(xì)胞明顯，但考慮到藥物濃度較大，總體來說一定劑量仙人掌果多糖對腫 瘤細(xì)胞的抑制作用不大。在比較對同一種腫瘤細(xì)胞抑制率相近的條件下， CPFP對人正常肝細(xì)胞L02的抑制作用很小而陽性對照藥物5-FU對人正常肝 細(xì)胞L02抑制作用明顯。
3. 2 CPFP對細(xì)胞凋亡的影響
CPFP(2. 500mg/ml)作用LM3細(xì)胞48小時后，Annexin V-FITC染色可 以觀察熒光顯微鏡下的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測CPFP作用下LM3細(xì)胞 凋亡率可知，NS組的凋亡率為9.76%; CPFP(0.625mg/ml)組凋亡率為 19. 77%; CPFP(2. 500mg/ml)組凋亡率為34. 12%,由此推測CPFP可能具有
誘導(dǎo)凋亡的作用。
3. 3 CPFP對P53表達(dá)的影響
結(jié)果表明，隨CPFP劑量增加，LM3細(xì)胞中P53基因mRNA的表達(dá)有一 定下調(diào)趨勢。蛋白質(zhì)檢測的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢。
4. 結(jié)論
(1)仙人掌果多糖對腫瘤細(xì)胞的抑制作用本實(shí)驗(yàn)研究表明仙人掌 果多糖不同劑量對人正常肝細(xì)胞L02的抑制作用很小，但陽性對照抗腫瘤 藥物5-FU的常用劑量對L02的抑制作用明顯。仙人掌果多糖不同劑量和
陽性對照抗腫瘤藥物5-FU的常用劑量對人體卵巢癌SKOV-3、胃癌7901 、 肝癌HEPG-2 、肝癌LM3細(xì)胞的增殖均有不同的抑制作用。仙人掌果多糖 的抑制作用與5-FU比較，抑制能力較弱，且用藥濃度較大。即仙人掌果 多糖的細(xì)胞毒性較小，直接殺傷細(xì)胞的能力較弱。推測仙人掌果多糖對腫 瘤的抑制可能通過其他途徑發(fā)揮作用。
(2) 仙人掌果多糖對細(xì)胞凋亡的作用本實(shí)驗(yàn)研究表明仙人掌果多 糖作用LM3細(xì)胞48小時后，Annexin V-FITC染色可以觀察熒光顯微鏡下 的生長活躍的腫瘤細(xì)胞和藥物誘導(dǎo)下已凋亡的腫瘤細(xì)胞?？梢杂^察到正常 LM3細(xì)胞，其輪廓清晰；其中的凋亡細(xì)胞皺縮、顏色發(fā)白，形狀較周邊正 常細(xì)胞均有所改變，呈綠色熒光。根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)檢測LM3細(xì)胞調(diào)亡率可 知，NS組的凋亡率為9.76%;仙人掌果多糖(0.625mg/ml)組凋亡率為 19. 77%;仙人掌果多糖(2. 500mg/ml)組凋亡率為34. 12%，由此可以推測
仙人掌果多糖可能具有一定的促凋亡作用。
(3) 仙人掌果多糖作用下的P53的表達(dá)分析本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果研 究表明，不同劑量仙人掌果多糖作用下LM3細(xì)胞P53基因mRNA的表達(dá)強(qiáng) 度變化具有一定趨勢，隨仙人掌果多糖劑量的增加，P53基因mRNA的表達(dá) 下調(diào)。根據(jù)Western blot結(jié)果可以看出，不同劑量仙人掌果多糖作用下 LM3細(xì)胞P53基因蛋白的表達(dá)強(qiáng)度不同，其變化具有一定趨勢，隨仙人掌 果多糖劑量的增加，P53基因蛋白的表達(dá)有所減弱。由此推測仙人掌果多 糖降低突變型P53在分子及蛋白水平的表達(dá)可能是其抗腫瘤機(jī)制之一。
(二)體內(nèi)抗腫瘤作用的研究
1. 實(shí)驗(yàn)材料
l.l實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠，雌雄各半，18 20g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動物中心提供(試驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證SCXKG桂2006-0003，試驗(yàn)動物使 用許可證SYKG桂2003-0005) 。 S180荷瘤小鼠種源，由上海細(xì)胞所提供。
2. 實(shí)驗(yàn)方法
2. l動物急性毒性試驗(yàn)
因受仙人掌果多糖(CPFP)濃度和體積的影響， 一次給藥無法測出其 LD50，故依據(jù)動物能耐受的最大濃度、最大體積的藥量，每隔12h給藥l次， 共給藥2次，測定CPFP最大給藥量。按急性毒性試驗(yàn)常規(guī)方法分劑量分組 灌胃。
2.2 S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制實(shí)驗(yàn)
2.2.1 S180荷瘤小鼠瘤株保種、傳代及移植瘤模型制備
(1) S180瘤株的保種
取體重20g的昆明小鼠4 5只，腹腔接種S180瘤株，定期7 9天傳一
代，腹腔保種。
(2) S180腋下移植瘤模型的建立 取腹腔傳代7天且生長良好的S180肉瘤小鼠，脫頸椎處死，75%乙醇消
毒動物皮膚，無菌條件下操作，小心剪開小鼠腹腔，吸取生長良好的動物 腹水，注意觀察腹水顏色，腹水為乳白色無絮狀沉淀物者為佳，血性腹水
則不可用。臺盼藍(lán)染色證明活細(xì)胞數(shù)〉98%，腹水用生理鹽水按l : 2比例稀 釋，吹打混勻，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2X106個活細(xì)胞/ml。取 昆明種小鼠50只，右側(cè)腋部皮膚常規(guī)酒精消毒，持lml注射器予小鼠腋下 皮下注射O. 2 ml瘤細(xì)胞懸液，制成局灶性腫瘤模型。操作過程中注意緊貼 皮下進(jìn)針，勿將瘤細(xì)胞懸液漏出。在造模后第4天和第6天觀察S180腋下移 植瘤模型的成瘤情況。
2. 2. 2實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥
接種24h后，小鼠按性別、體重隨機(jī)分成五組，每組10只，連續(xù)給藥 IO天生理鹽水組(NS):生理鹽水0.2 ml 10g- 1 d- 1， po; CTX組 CTX 0. 02 g kg- 1 d- 1， ip; CPFP高中低劑量組:1. 97 g kg- 1 d-1、 0.99 g kg- 1 d- 1、 0. 49 g kg- 1 d- 1， po。
質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)為具有下列一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)資料作廢
(1) 生理鹽水組小鼠腫瘤平均瘤重小于lg或20Q/。小鼠的瘤重小于0.4 g，表示腫瘤生長不良。
(2) 給藥組小鼠死亡超過20%，或去瘤后平均體重下降超過15%，表示 藥物的不良反應(yīng)。
2. 2. 3計算抑瘤率
第ll天稱體重并處死動物，剪開小鼠右腋下皮下組織，剝離腫瘤、胸 腺、脾臟，稱重，按下列公式計算抑瘤率，胸腺指數(shù)，脾指數(shù)。
他傷宇"、—生理鹽水組瘤重一實(shí)驗(yàn)組瘤重y翻《y
抑瘤率(%)--生理鹽水組瘤重-X100 %
2.3 CPFP對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響 2.3.1 S180荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的測定 胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg) /體重(g) 脾指數(shù)=脾臟重量(mg) /體重(g) 2.3.2脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能測定
(1) 實(shí)驗(yàn)方法植物血凝素誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT法)
(2) 原理當(dāng)T細(xì)胞受植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白(Con A)等致
分裂原或特異性抗原刺激后發(fā)生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞特別是增殖細(xì)胞通過 線粒體水解酶將MTT (四甲基偶氮唑鹽)分解為藍(lán)紫色formazan結(jié)晶而顯
色，其光密度值能夠反映細(xì)胞的增殖情況。
(3) 脾淋巴細(xì)胞懸液的制備用藥結(jié)束后脫頸椎處死小鼠，于超凈 臺中無菌取出脾臟，用眼科剪反復(fù)剪碎，PBS沖洗，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾至 離心管中，沿離心管側(cè)壁加入淋巴細(xì)胞分離液l ml，離心1500轉(zhuǎn)/分鐘， 10分鐘，吸取中間層細(xì)胞，用含109&小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì) 胞濃度為5 X 106/ml單個脾細(xì)胞懸液。(4)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的測定將制備好的小鼠脾細(xì)胞懸液加入96 孔培養(yǎng)板中，100ul細(xì)胞懸液/孔。每只鼠設(shè)對照孔3復(fù)孔，每孔加IOO Ull640培養(yǎng)液；ConA刺激孔3復(fù)孔，每孔加100 pi Con A (10 mg/L) 溶液。于37。C、 5呢C02培養(yǎng)箱中孵育40h后，取出每孔加入IO u 1 MTT (5 mg/ml)溶液，繼續(xù)孵育4h。取出后，小心吸去上清，每孔加入DMS0150 Ul，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀上選擇570 mn處的 波長，測OD值，計算刺激指數(shù)(SI)。
SI =刺激孔(加Con A孔)OD值/對照孔OD
2. 4 CPFP對S180荷瘤小鼠血清自由基的作用
S180荷瘤小鼠造模、分組，給藥10天后，第ll天眼球取血處死小鼠。 血漿2000 r/分鐘離心10分鐘，收集上層無溶血的血清于EP管中，-20°C 冰箱中備用， 一周內(nèi)測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、 一氧化 氮(則。
2. 5透射電鏡觀察CPFP對S180荷瘤小鼠瘤組織超微結(jié)構(gòu)的影響 2.6CPFP對S180荷瘤小鼠瘤組織病理學(xué)形態(tài)及P53、 Bax、 VEGF蛋白表 達(dá)水平的影響
S180荷瘤小鼠造模、分組，給藥10天后，第ll天眼球取血，脫頸椎處 死小鼠，剝離瘤組織，10%中性福爾馬林固定，24h內(nèi)制成蠟塊備用。
2. 6. 1觀察瘤組織病理學(xué)形態(tài)
結(jié)果判定低倍鏡下(X100)觀察壞死面積，按壞死面積大小分級 判斷為灶狀壞死(+ ),小片狀壞死(++)，大片狀壞死(+++)。
2.6.2免疫組化法檢測P53、 Bax、 VEGF蛋白表達(dá)
結(jié)果判定P53陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞核。細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕 褐色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞。Bax陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn) 棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞。VEGF陽性染色定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)。 細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)細(xì)胞。每張切片高倍鏡下隨機(jī) 觀察5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞百分率或陽性組織相對灰度值。
2.7數(shù)據(jù)處理 —
應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料均采用i+S表示，兩組 間計量資料比較采用t檢驗(yàn)，兩組率的比較采用X2檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采
用方差分析。
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1動物急性毒性試驗(yàn)
在試驗(yàn)中觀察到，小鼠灌服藥物2星期內(nèi)，CPFP各劑量組和生理鹽水 對照組動物無異常差別，藥后14d，處死小鼠，解剖，肉眼觀察心、肝、 脾、肺、腎、腦、小腸，均無異常發(fā)現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明小鼠24h內(nèi)共灌 胃給予CPFP4. 746g kg-l，最大耐受量達(dá)4. 746g kg-1。
3.2 CPFP對S180荷瘤小鼠腋下移植瘤的抑制實(shí)驗(yàn) 3.2.1腫瘤造模情況觀察及各實(shí)驗(yàn)組瘤塊比較
小鼠接種2天內(nèi)，外觀無明顯變化，活動、飲食正常；接種瘤細(xì)胞后 第3 4天，部分小鼠可觸及皮下米粒大小腫塊；接種后第4 6天腫塊逐漸 明顯，各組成瘤率均約為80%。仙人掌果多糖高、中、低劑量組及CTX組腫 瘤生長較生理鹽水組緩慢。但CTX組小鼠飲食減少，體重減輕明顯，皮毛 無光澤，豎毛現(xiàn)象明顯，活動明顯減少，常擁擠在一起；而仙人掌果多糖 高、中、低劑量組小鼠明顯比CTX組和生理鹽水組小鼠活潑，體重減輕不 明顯，皮毛有光澤，豎毛現(xiàn)象不明顯。給藥結(jié)束后處死各組小鼠，取瘤塊 分析比較.生理鹽水組與仙人掌果多糖中、低劑量組瘤塊大小均約為 (0. 8—1.1 cm) X (0. 8—1. 0cm)，仙人掌果多糖高劑量組瘤塊大小約為 0. 4cmX 0. 6cm， CTX組瘤塊大小約O. 3cm-0. 45cm。
3.2.2 CPFP對S180小鼠腋下移植瘤抑瘤作用
仙人掌果多糖高、中劑量、CTX組的瘤重明顯低于生理鹽水組，而仙 人掌果多糖低劑量組其瘤重則與生理鹽水組相近。表明仙人掌果多糖的 高、中劑量組及CTX組對腫瘤均有明顯的抑制率，其中以高劑量組和CTX組
的效果最好。
3.3 CPFP對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響 3. 3. 1 CPFP對胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響
與生理鹽水組比較，CPFP各劑量組胸腺指數(shù)較生理鹽水組有所增高， 其中高、中劑量具有顯著差異(P〈0. 05)，脾臟指數(shù)無顯著性差異(P〉0. 05); 環(huán)磷酰胺組胸腺指數(shù)明顯降低，與生理鹽水組相比有顯著差異(P<0.05)， 脾臟指數(shù)無明顯差異(P>0.05)。提示CPFP能促使胸腺發(fā)育，改善荷瘤小 鼠所引起的胸腺抑制作用，對脾臟的發(fā)育無明顯促進(jìn)作用；CTX可顯著抑 制荷瘤小鼠的胸腺，對脾臟無明顯抑制作用。
3.3.2 CPFP對脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響
與生理鹽水組比較，CPFP高、中劑量組均有顯著差異(P〈0.01)， CTX 組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力明顯低于生理鹽水組(P〈O.OD，提示CPFP能明顯 提高荷瘤小鼠的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，環(huán)磷酰胺組荷瘤小鼠的脾淋巴細(xì)胞 轉(zhuǎn)化功能明顯低于生理鹽水組。
3.4仙人掌果多糖對Sw。荷瘤小鼠SOD、 MDA、 NO的影響
與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖高、中劑量組均能提高SOD含量 (代0.05或代0.01)，仙人掌果多糖高、中、低劑量組均能降低MDA、 NO 含量(代0.05或代0.01)。
3. 5仙人掌果多糖對瘤組織超微結(jié)構(gòu)的影響
生理鹽水組瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間有連接，絨毛豐富。細(xì)胞器 結(jié)構(gòu)較清晰核形態(tài)不規(guī)則，核漿比例大，核異形性強(qiáng)，核內(nèi)異染色質(zhì)多， 核仁明顯。仙人掌果多糖1.97g kg—'組可見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞間間隙增大， 細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集，核仁濃縮或碎裂，并可見類圓形凋亡小體，胞質(zhì)內(nèi)
線粒體空泡變性，線粒體嵴融合，呈早期凋亡跡象。CTX組可見有核異 型，細(xì)胞漿出現(xiàn)大片空泡區(qū)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核糖體脫落，核膜消失， 核碎裂，呈晚期凋亡跡象。
3. 6 S咖荷瘤小鼠瘤組織病理學(xué)形態(tài)及Bax等蛋白表達(dá)水平觀察
3. 6. 1 CPFP對于Sw。瘤組織病理學(xué)形態(tài)改變的影響 低倍鏡下觀察，生理鹽水組和CPFP低劑量組可見腫瘤細(xì)胞生長活躍，
有部分壞死灶，CPFP高劑量、中劑量組和CTX陽性對照組對腫瘤的破壞力 大于生理鹽水組和CPFP低劑量，觀察可見瘤內(nèi)有大片狀壞死，壞死面積較 大及程度較為嚴(yán)重，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，各組壞死無明顯差異。
3.6.2 CPFP對于瘤組織Bax蛋白表達(dá)的影響
與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中Bax蛋白表達(dá)數(shù)值均有所提高， 與生理鹽水組相比，高、中劑量組P〈0.05。
3.6.3 CPFP對瘤組織P53蛋白表達(dá)的影響
與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中P53蛋白表達(dá)明顯降低，高劑量 組P〈0.01， CTX、中、低劑量組P〈0.05。
3.6.4 CPFP對于瘤組織VEGF蛋白表達(dá)的影響
與生理鹽水組比較，CPFP組瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)均降低，高劑量 組P〈0.01,中劑量組P〈0.05，低劑量無顯著意義。
4. 結(jié)論
(1) 仙人掌果多糖對S自荷瘤小鼠的抑瘤作用
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖高、中組抑制腫瘤 有顯著性差異(P〈0.01或P〈0.05)， CTX組抑瘤率抑制腫瘤有顯著性差異 (P〈0.(U)。 CTX為臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，系氮芥與磷酰胺基結(jié)合 而成的化合物，可直接破壞DNA并阻止其復(fù)制。CTX在體經(jīng)肝細(xì)胞色素P45。 氧化，裂環(huán)生成中間產(chǎn)物醛磷酸酰胺，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)分解出強(qiáng)有效的磷 酰胺氯芥，可與DNA發(fā)生烷化，形成交叉聯(lián)結(jié)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖， 從而發(fā)揮抗癌作用，為周期非特異性藥物，療效確切。本實(shí)驗(yàn)中，CTX組 抑瘤率達(dá)60%以上，對S自肉瘤有良好的抑制作用。仙人掌果多糖高劑量、 中劑量組抑瘤率高于30%,實(shí)驗(yàn)復(fù)重三次，結(jié)果基本一致。 一般認(rèn)為中藥 的抑瘤率超過30%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，連續(xù)數(shù)次療效穩(wěn)定，且有統(tǒng)計學(xué)意義， 可評定藥物有一定療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明仙人掌果多糖對S自小鼠腋下 移植瘤有明顯的抑制作用。
(2) 仙人掌果多糖對S目荷瘤小鼠抗腫瘤免疫作用 本研究結(jié)果顯示，仙人掌果多糖能提高胸腺指數(shù)，對脾臟指數(shù)無明顯
影響，說明其主要促進(jìn)胸腺細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)細(xì)胞免疫功能，從一定程 度上改善荷瘤小鼠免疫器官狀況，對因荷瘤而損傷的免疫系統(tǒng)功能有一定 的保護(hù)和促進(jìn)恢復(fù)作用。在本實(shí)驗(yàn)研究中，仙人掌果多糖組對Sw。荷瘤小 鼠T淋巴細(xì)胞增殖活性有較大程度提高，提示仙人掌果多糖可增強(qiáng)T淋巴
細(xì)胞的增殖活性和提高免疫應(yīng)答能力，是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。
(3) 仙人掌果多糖對Sw。荷瘤小鼠體內(nèi)自由基的作用 清除自由基是一條有效的抗癌、抑癌手段。SOD的活力反映了機(jī)體清
除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)主要測定了Sw。荷瘤小鼠血漿MDA和SOD含量，顯 示仙人掌果多糖能降低Sw。荷瘤小鼠血漿MDA，升高SOD含量。仙人掌果多糖 高劑量、中劑量與生理鹽水組比較有顯著性差異(P〈0.05或P〈0.01)。提 示仙人掌果多糖抗腫瘤機(jī)制可能與清除自由基有一定關(guān)系。
(4) 仙人掌果多糖對Sw。荷瘤小鼠瘤組織病理學(xué)形態(tài)的影響 低倍鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組瘤內(nèi)壞死面積，生理鹽水組和仙人掌果多糖低
劑量組可見腫瘤細(xì)胞生長活躍，有部分壞死灶，可能是由于腫瘤組織生長 過快，局部缺血形成的小壞死灶，仙人掌果多糖高劑量、中劑量組瘤體普 遍小于生理鹽水組，可見瘤內(nèi)有大片狀壞死，壞死面積較大及程度較為嚴(yán) 重。經(jīng)秩和檢驗(yàn)各組間無明顯差異，可能與各組腫瘤均有壞死有關(guān)。
(5) 免疫組織化學(xué)法及仙人掌果多糖對Sw。荷瘤小鼠Bax、 P53蛋白表 達(dá)的影響
Bax和P53是兩種常見的癌基因或抑癌基因，其蛋白表達(dá)在各種惡性 腫瘤治療的研究中，可作為一種預(yù)后標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中與生理鹽水組比 較，仙人掌果多糖組瘤組織中Bax蛋白表達(dá)數(shù)值均有所提高，高、中劑量 組P〈0.05，低劑量組無顯著意義。與生理鹽水組比較，仙人掌果多糖組瘤 組織中P53蛋白表達(dá)明顯降低，高劑量組P〈0. 01， CTX、中、低劑量組P〈0. 05。 表明仙人掌果多糖能提高Bax基因蛋白表達(dá)；降低P53基因的突變，這可能
是其抗腫瘤的重要機(jī)理之一。
(6) 仙人掌果多糖對S哪荷瘤小鼠VEGF蛋白表達(dá)及NO含量的影響 本研究表明，仙人掌果多糖組瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)及NO含量降低，
提示抑制腫瘤血管生長有可能也是仙人掌果多糖抗腫瘤的機(jī)制之一。
因此，仙人掌果多糖對腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，對正常細(xì)胞的抑 制作用不明顯；具有一定抑制腫瘤生長的作用；能提高胸腺指數(shù)、脾指數(shù)， 提高淋巴細(xì)胞增殖功能，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)研究得知仙人掌果中所含的仙人掌果多糖可通過調(diào) 節(jié)內(nèi)皮功能、抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)及逆轉(zhuǎn)平滑肌細(xì)胞增殖三方面起到 控制高血壓的發(fā)生發(fā)展；有明顯的降血脂、抗氧化、改善血液流變學(xué)及肝 臟脂肪變性作用，對防治高脂血癥和肝脂肪變性的發(fā)生發(fā)展有積極意義； 能改善糖代謝和脂代謝，增加胰島卩細(xì)胞、胰島素受體InsR和Glu4，提 高機(jī)體的抗氧化能力、修復(fù)受損心肌細(xì)胞，對防治糖尿病及其并發(fā)癥有良 好的潛在應(yīng)用價值；并具有一定的抗腫瘤作用。因此本發(fā)明為開發(fā)天然無 毒的防治高血壓、高血脂、糖尿病及抗腫瘤的藥物或保健品奠定了基礎(chǔ)， 有效促進(jìn)了仙人掌果資源的充分利用。
由于天然藥物在高血壓病的治療過程中，對心、腦、腎等多個臟器及
系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，同時可以較好地改善患者的生活質(zhì)量；治療高 血糖時能從整體調(diào)節(jié)出發(fā)，扶正固本，改善調(diào)節(jié)胰島p細(xì)胞及受體的功能， 減少抗體的拮抗，作用溫和持久；在降壓和降糖的同時能達(dá)到降脂；天然 藥物及其活性成分抗腫瘤具有多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)的特點(diǎn)；且中草藥 具有價格相對低廉，副作用相對較少，辨證論治，靈活加減，非常適宜于 慢性疾病的治療；因此仙人掌果及仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、 降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品方面將具有良好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的實(shí)施例l:仙人掌果多糖的制備
取仙人掌果，加10倍重量的水超聲提取1. 5小時，提取液濃縮，加 入95%的乙醇，調(diào)節(jié)濃縮液的乙醇濃度至70%進(jìn)行沉淀，然后在5000rpm 轉(zhuǎn)速下離心10min，離心沉淀物加水溶解，用體積比為1 : 2的無水乙醇和 乙酸乙酯混合液萃取2次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮， 干燥，即得仙人掌果多糖。
其中Sevage+木瓜蛋白酶法的具體過程為用Sevage溶液(體積比 氯仿正丁醇=4: 1)萃取水溶液2次后，取水層液，調(diào)pH至5 7，向水溶 液中加入2u/100ml的木瓜蛋白酶，65。C保溫26h， 10000rpm離心5min， 去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。
經(jīng)測定，所提取的仙人掌果多糖中多糖含量達(dá)71.1%。
本發(fā)明的實(shí)施例2:取仙人掌果打漿(成糊狀)，過濾(去渣、去籽)， 加1 20倍重量的水至500 1000ml，再加入0 20%重量的市售涼粉或海 洋膠、0 20%重量的蜜糖或木糖醇，攪拌均勻，放入鍋內(nèi)煮沸后加入允許 范圍內(nèi)的防腐劑，經(jīng)過濾，裝罐，封口，滅菌，放置冷卻凝結(jié)；或者攪拌 均勻后注模，烘干(保留10 50%水份)，出模，得半成品，包裝，即得仙 人掌果膏。該膏劑口服，每次250克，每日1-2次；可用于防治腫瘤。
本發(fā)明的實(shí)施例3:以新鮮仙人掌果或仙人掌果汁為原料，經(jīng)全部或 部分發(fā)酵或勾兌釀制成酒精度》7% (V/V)的溶液，過濾，裝罐，封口， 即得仙人掌果酒。該酒劑口服，每次10ml，每日1-2次；可用于防治腫瘤。
本發(fā)明的實(shí)施例4:取仙人掌果打漿(成糊狀)，過濾(去渣、去籽)， 加糖，攪勻，注模，烘干(保留10 60%水份)，出模，得半成品，包裝， 即得仙人掌果果丹皮。該制劑口服，每次l-5克，每日1-2次；可用于防 治腫瘤。
本發(fā)明的實(shí)施例5:仙人掌果加水煎煮0.5 2小時后，加入1 30% 體積量的牛奶和1 30%體積量的茶水，再加入甜味調(diào)料，攪勻，裝罐，封 口，滅菌，即得仙人掌果奶茶，該茶劑口服，每次10—25ml，每日l-2 次；可用于防治腫瘤。
本發(fā)明的實(shí)施例6:取實(shí)施例1制備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加
入矯味劑，控制合適的相對密度，分裝、滅菌，制得仙人掌果多糖口服液
或仙人掌果汁。每lml 口服液中含仙人掌果多糖O. 1克或仙人掌果1克， 每次服用10ml，每日2-3次，用于高血壓的治療。
本發(fā)明的實(shí)施例7:取實(shí)施例1制備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入溶劑、混勻，靜置、濾過，再濃縮至相對密度為1.30 1.35 (50 60 °C)，加入賦型劑制粒或以濃縮液噴霧干燥制粒，分裝、滅菌，制得仙人 掌果多糖顆?；蛳扇苏乒w粒劑。每袋1-5克，每次服用1袋，每日2-3 次，用于高血脂的治療。
本發(fā)明的實(shí)施例8:取實(shí)施例1制備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入適宜的賦型劑，用滾轉(zhuǎn)制粒法制得仙人掌果多糖片或仙人掌果片。每片 含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每次服用1-5片，每日2-3 次，用于高血糖的治療。
本發(fā)明的實(shí)施例9:取實(shí)施例1制備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入適宜的賦型劑，直接用全自動膠囊分裝機(jī)分裝，制得仙人掌果多糖膠囊 或仙人掌果膠囊。每粒含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙人掌果，每 次服用l-5粒，每日2-3次，用于高血糖的治療。
本發(fā)明的實(shí)施例10:取實(shí)施例1制備的仙人掌果多糖或仙人掌果，加 入適宜的賦型劑，制成滴丸。每丸含0. 1-0. 5克仙人掌果多糖或1-5克仙 人掌果，每次服用1-5丸，每日2-3次，用于高血壓的治療。
權(quán)利要求
1.仙人掌果在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應(yīng)用。
2. 仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物 或保健品中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征在于仙人掌果多糖是從仙人掌果中提取出來的多糖類成分，其總糖含量為60% 80%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征在于仙人掌果 多糖的制備方法為取仙人掌果，加4 10倍重量的水超聲提取0. 5 2.5 小時，提取液濃縮，加入40 95%的乙醇，調(diào)節(jié)濃縮液的乙醇濃度至40 90%進(jìn)行沉淀，然后在1000 10000rpm轉(zhuǎn)速下離心2 10min，離心沉淀物 加水溶解，用體積比為1 5 : 2 10的無水乙醇和乙酸乙酯混合液萃取 1 4次，水層用Sevage+木瓜蛋白酶法去除蛋白，濃縮，干燥，即得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征在于SeVage+ 木瓜蛋白酶法去除蛋白的過程為用體積比為氯仿正丁醇=4 10 : 1 5 的Sevage溶液萃取水溶液l 3次后，取水層液，調(diào)pH至5 7，向水溶 液中加入1 4u/100ml的木瓜蛋白酶，45 65。C保溫20 28h， 1000 10000rpm離心2 10min,去除底層沉淀，得仙人掌果多糖脫蛋白液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征 在于取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加藥用輔料，按照常規(guī)方法 制備成藥物制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征 在于將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它藥用成分組合，并加入或不加藥 用輔料，按照常規(guī)方法制備成藥物制劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征 在于取仙人掌果或仙人掌果多糖，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備 成保健品。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述仙人掌果、仙人掌果多糖的應(yīng)用，其特征在于將仙人掌果或仙人掌果多糖與其它物質(zhì)組合，加入或不加輔料，按照常規(guī)方法制備成保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了仙人掌果及從仙人掌果中提取的仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品中的應(yīng)用。由于仙人掌果中所含的仙人掌果多糖可控制高血壓的發(fā)生發(fā)展，對防治高脂血癥和肝脂肪變性的發(fā)生發(fā)展有積極意義，對防治糖尿病及其并發(fā)癥有良好的潛在應(yīng)用價值，并具有一定的抗腫瘤作用，因此本發(fā)明為開發(fā)防治高血壓、高血脂、糖尿病及抗腫瘤的藥物或保健品奠定了基礎(chǔ)，有效促進(jìn)了仙人掌果資源的充分利用。而且仙人掌果屬于天然植物資源，其藥用和保健效果好，對人體多個臟器及系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，價格相對低廉，副作用相對較少，辨證論治，靈活加減，非常適宜于慢性疾病的治療；因此仙人掌果及仙人掌果多糖在制備降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤作用的藥物或保健品方面將具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P9/00GK101352474SQ20081007377
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者劉華鋼 申請人:劉華鋼