專利名稱：用于治療血管生成依賴性腫瘤的去纖苷酸和/或寡脫氧核糖核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療患腫瘤哺乳動(dòng)物的方法，所述方法是通過對(duì)所述哺乳 動(dòng)物施用有效量的去纖苷酸和/或寡苷酸(oligotide)實(shí)現(xiàn)的；具體地，本 發(fā)明涉及使用寡苷酸和/或去纖苷酸治療血管生成依賴性腫瘤。發(fā)明背景血管生成是導(dǎo)致從既有的血管系統(tǒng)生成新血管的多步驟過程，并且是 原發(fā)性腫瘤生長、入侵和轉(zhuǎn)移發(fā)展所必需的(20)。在成人體內(nèi)，血管生成 往往是受到抑制的，僅僅在生殖、發(fā)育和傷口愈合過程中短暫發(fā)生。在沒 有新血管生成的情況下，腫瘤不能進(jìn)一步擴(kuò)大超過臨界體積(12)。為促進(jìn) 此擴(kuò)大過程，腫瘤必須取得血管生成表型，后者是正(促血管生成 (pro-angiogenic))調(diào)節(jié)物和負(fù)(抗血管生成)調(diào)節(jié)物之間達(dá)到凈平衡的結(jié)果 (16)。然而，肺瘤在血管構(gòu)造、分化和功能性血液供應(yīng)方面高度異質(zhì)(24)。 這些無血管的血管生成性(avascular preangiogenic )腫瘤大小的差異部分 地可能是由于腫瘤細(xì)胞在不同程度組織缺氧條件下存活的能力不同(18)。某些腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤、甚至是非實(shí)體性白血病和淋巴瘤(8)和(21)、 以及乳腺癌(25)、結(jié)腸直腸癌(7)、胃癌(26)、前列腺癌(9)、宮頸癌(19)、肝 細(xì)胞癌(23)、還有非小細(xì)胞肺癌(13)的血管生成依賴性證據(jù)來自這樣的觀察 結(jié)果，即衡量血管生成程度的微血管密度是上述臨床病例存活情況的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素(17)。在最近的臨床研究中，同樣是在乳腺癌的研究中，逐 漸清楚血管生成相關(guān)基因，例如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF、 VEGF受 體FLT1以及金屬蛋白酶MMP9對(duì)臨床結(jié)果非常重要(6)。定義術(shù)語寡苷酸在文中用于指分子量為4000-10000道爾頓的任何寡脫氧 核糖核苷酸。優(yōu)選是指具有如下分析參數(shù)的任何寡脫氧核糖核苷酸 分子量(mw): 4000-10000道爾頓， 增色效應(yīng)(h) : <10， A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160， 比旋+30° - +46.8。，優(yōu)選+30。 - +46.20。寡苷酸可以通過從動(dòng)物和/或植物組織特別是哺乳動(dòng)物器官中提取生 產(chǎn)，或者可以通過合成生產(chǎn)。當(dāng)通過提取生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選將按照文獻(xiàn)(l)、 (2) 和(3)中描述的方法獲得，特此將其并入本文作為參考。已知寡苷酸被賦予 了一種重要的抗缺血活性。術(shù)語去纖苷酸指通過從動(dòng)物和/或植物組織提取獲得的多脫氧核糖核 普酸，當(dāng)然也可以通過合成生產(chǎn)；多脫氧核糖核普酸常用形式是堿金屬鹽、 通常是鈉鹽，并且通常分子量是45-50 kDa (CAS注冊(cè)號(hào)83712-60-1)。優(yōu) 選去纖苷酸以文獻(xiàn)(4)和(5)中描述的物理/化學(xué)特征存在，特此將其并入本 文作為參考。發(fā)明內(nèi)容我們最近開發(fā)了胂瘤血管形成可選路徑的才莫型。我們提出，除了從既 有的血管上芽生內(nèi)皮細(xì)胞之外，攜帶血液的內(nèi)皮細(xì)胞也可以產(chǎn)生腫瘤血管 系統(tǒng)。這些內(nèi)皮樣細(xì)胞(ELC)能夠在特定培養(yǎng)條件下自腫瘤相關(guān)的樹突細(xì) 胞轉(zhuǎn)分化而來(ll)。簡言之，從來自健康人血液供體的白細(xì)胞去除術(shù)產(chǎn)物 中淘選出單核細(xì)胞，并在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4 (IL-4)的存在下培養(yǎng)，以刺激樹突細(xì)胞(DC)分化。此外，還用由腫瘤 細(xì)胞特異性釋放的混合物(M-CSF、 IL.6和乳酸，Gottfried等，已投稿)處 理細(xì)胞，以促進(jìn)腫瘤相關(guān)的樹突細(xì)胞(TuDQ長出。這些TuDC-ELC獲得了內(nèi)皮細(xì)胞的表型(FactorVIII相關(guān)抗原，vWF)， 但其喪失了單核細(xì)胞標(biāo)志(CD14)和樹突細(xì)胞標(biāo)志(CDla)。重要的是，這些 細(xì)胞不表達(dá)CD34，也不表達(dá)CD133或CD146，這證明它們是真正的轉(zhuǎn)分 化產(chǎn)物，而且沒有污染循環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞祖先(CD34、 CD133)或者循環(huán)的成 熟內(nèi)皮細(xì)胞(CD146)。此外，這些細(xì)胞在體外血管生成實(shí)驗(yàn)MatrigelTM中 能夠形成血管樣結(jié)構(gòu)。Matrigel 實(shí)驗(yàn)是最常見且廣泛使用的體外血管生成實(shí)驗(yàn)(22)。 Matrigel 為合成的胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)半固體混合物，其在于模擬生理學(xué)存 在于血管內(nèi)皮細(xì)胞壁之下的基質(zhì)。當(dāng)在顯微鏡蓋玻片上將所研究的細(xì)胞種 植于此基質(zhì)上時(shí)，細(xì)胞能夠被激活，并在3-7天內(nèi)形成管狀結(jié)構(gòu)，但這僅 在這些細(xì)胞具有內(nèi)皮細(xì)胞表型的情況下發(fā)生。因此，此Matrigel 實(shí)驗(yàn)適 于顯示細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤血管系統(tǒng)的潛能。我們的數(shù)據(jù)表明，臨床及亞臨床濃度的寡苷酸和/或去纖苷酸能夠抑制 Matrigel 中轉(zhuǎn)分化ELC (TuDC-ELC)的血管形成。在存在或不存在寡苷 酸或去纖苷酸(各10 ng/mL)的情況下，將TuDC-ELC及成熟分化的內(nèi)皮細(xì) 胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)作為"穩(wěn)定"對(duì) 照I孵育7天。重要的是，單次添加去纖苷酸之后，HUVEC和HMEC的 血管形成潛能不受影響，表明去纖苷酸和/或寡普酸僅尋靶轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì) 胞(

圖1A)。然而，當(dāng)反復(fù)添加去纖普酸時(shí)，其也能夠阻斷完全分化的成熟 內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成(見下文)。借助于NIH免費(fèi)贈(zèng)送的軟件(Image J， http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)，我們 能夠?qū)@些效應(yīng)進(jìn)行量化，評(píng)估了血管的總長以及照片的面積，然后以總 長/面積[象素力得出微血管密度(MVD)。 DF顯著(p^0.02， T檢驗(yàn))下調(diào) TuDC-ELC的MVD (圖1B)。為了用可選的血管生成實(shí)驗(yàn)支持這些數(shù)據(jù)，當(dāng)每日施用DF時(shí)，大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在MatrigelTM中的芽生幾乎被100。/o阻止(圖2),表明DF不 僅作用于轉(zhuǎn)分化的內(nèi)皮細(xì)胞，而且還作用于完全分化的成熟內(nèi)皮細(xì)胞。動(dòng)脈環(huán)實(shí)驗(yàn)是用來研究大血管內(nèi)皮細(xì)胞的。但腫瘤血管系統(tǒng)通常由微 血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成。因此，我們以微血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)9-11天的培養(yǎng)后通過 真皮成纖維細(xì)胞層進(jìn)行血管化為基礎(chǔ)，進(jìn)行了第三種體外血管生成實(shí)驗(yàn)。 這些血管樣結(jié)構(gòu)隨后能夠通過CD31和vWF染色進(jìn)行觀察。如圖3(A和B)所示，DF每日施用，能夠卓越地阻斷人微血管內(nèi)皮細(xì) 胞的血管生成。有趣的是，10jig/mL左右的濃度似乎最為有效。單次施用 DF不能夠顯著阻斷血管生成?？偠灾?，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地表明，去纖苷酸和/或寡苷酸能夠阻斷 如下細(xì)胞的血管生成腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)分化內(nèi)皮細(xì)胞以及從早已存在的血管 細(xì)胞產(chǎn)生的那些細(xì)胞。寡苷酸和去纖苷酸是否也在體內(nèi)抑制血管生成，還正在進(jìn)行研究。我 們目前進(jìn)行了背皮膚小室實(shí)驗(yàn)(dorsal skin chamber assay) (14)，以研究去 纖苷酸在高度血管化的人胃癌小鼠模型(異種移植系統(tǒng))中的效應(yīng)。第 一手 數(shù)椐清楚表明DF處理腫瘤的微血管密度(MVD)低于對(duì)照腫瘤的微血管密 度。這組實(shí)驗(yàn)將會(huì)得到及時(shí)再現(xiàn)，DF能夠阻斷血管生成的作用機(jī)制尚有待闡明，但Western印跡分析 的初步證據(jù)表明DF對(duì)活化的p70S6激酶(p-p70S6)(—種絲裂原活化蛋白 激酶)具有下調(diào)效應(yīng)。有關(guān)p70S6激酶影響的其他證據(jù)獲自另一血管形成實(shí)驗(yàn)，即在存在或 不存在p70S6激酶抑制劑DRB的情況下孵育HMEC。我們還有接受了同種異體干細(xì)胞移植(SCT)患者的第一手臨床數(shù)據(jù) 在一群去纖苷酸治療的17名患者中，已經(jīng)觀察到血清VEGF水平的鮮明 下降，這也表明去纖苷酸可能通過撤除芽生腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子而起 作用。去纖普酸和寡苷酸為治療血管生成依賴性腫瘤的強(qiáng)有力候選物，并且 可以單獨(dú)使用，或者與其他抗血管生成劑如雷帕霉素聯(lián)合使用(14)。有趣的是，雷帕霉素具有促血栓形成活性的負(fù)面副作用(15)，而通過同時(shí)施用 抗血栓形成的纖溶性去纖苷酸能夠減弱此副作用。參考文獻(xiàn)1. US56461272. US56462683. US60461724. US49855525. US52236096. ，t Veer，L.J.等(2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415, 530-536.7. AbdaHa，S.A.等(1999) Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours， Oncol.Rep,， 6， 839-842.8. Andersen，N.F.等 (2005) Syndecan-1 and angiogenic cytokines in multiple myeloma: correlation with bone marrow angiogenesis and survival. Br.J.Haematol" 128, 210-217.9. Bostwick，D.G. & Iczkowski,K,A. (1998) Microvessel density in prostate cancer: prognostic and therapeutic utility. Semin.Urol.Oncol" 16， 118-123.10. Eissner，G.等(2002) Fludarabine induces apoptosis， activation, and allogenicity in human endothelial and epithelial cells: protective effect of defibrotide. Blood, 100， 334-340.11. Fernandez，P.B.等 (2001) Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur.J,Cdl Biol.， 80， 99-110.12. Folkman，J.等 (197" Isolation of a tumor factor responsible forangiogenesis. J.Exp.Med.， 133， 275-288.13. Fontanini，G.等(1995) Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J.Pathol.， 177, 57-63.14. Guba，M.等(2002) Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat.Med.， 8， 128-135.15. Guba，M.等(2005) Rapamycin induces tumor-specific thrombosis via tissue factor in the presence of VEGF. Blood.16. Hanahan，D. & Folkman，J. (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 86， 353-364.17. Hasan，J.等(2002) Intra-tumoural microvessel density in human solid tumours， Br.J.Ca匿r， 86,1566-1577.18. HelmIinger，G.等(1997) Interstitial pH and p02 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nat.Med.， 3,177-182.19. Kainz，C.等(1995) Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res" 15, 1549-1551.20. Morabito，A.等 (2004) Antiangiogenic strategies, compounds, and early clinical results in breast cancer. Crit Rev.Oneol.Hematol" 49， 91-107.21. Podar，K. & Anderson,K.C. (2005) The pathophysiologic role of VEGF in hematologic malignancies: therapeutic implications. Blood, 105， 1383-1395.22. Staton，C.A.等(2004) Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int.J.Exp.PathoI" 85， 233-248.23. Sun，H.C.等(1999) Microvessel density of hepatocellular carcinoma: its relationship with prognosis. J.Cancer Res.Clin.Oncol" 125， 419-426.24. Verheul,H.M.等(2004) Are tumours angiogenesis-dependent J.Pathol.， 202， 5-13. 25， Weidner，N,等 (1992) Tumor angiogenesis: a new significant andindependent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma.J.Natl.Cancer Inst" 84,1875-1887. 26. Xiangming，C.等(1998) Angiogenesis as an unfavorable factor relatedto lymph node metastasis in early gastric cancer. Ann.Surg.Oncol" 5，585-589.
權(quán)利要求
1.去纖苷酸和/或分子量4000-10000道爾頓的寡脫氧核糖核苷酸單獨(dú)或與雷帕霉素聯(lián)合在制備治療血管生成依賴性腫瘤的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述寡脫氧核糖核苷酸具有如 下分析參數(shù)h <10， A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160，比 旋+300- +46.8。。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于比旋為+30°至+46.2。。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述寡脫氧核糖核苷酸和/或 去纖苷酸通過從動(dòng)物和/或植物組織優(yōu)選哺乳動(dòng)物器官中提取獲得。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述寡脫氧核糖核苷酸和/或 去纖苷酸通過合成獲得。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述血管生成依賴性腫瘤為多 發(fā)性骨髓瘤。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述血管生成依賴性肺瘤為乳 腺癌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述藥物施用于哺乳動(dòng)物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述哺乳動(dòng)物為人。
10. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述藥物靜脈內(nèi)施用。
11. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述藥物為水性溶液。
12. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述去纖苷酸和/或寡脫氧核 糖核苷酸與雷帕霉素聯(lián)合制備藥物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其特征在于所述藥物含有常規(guī)賦形劑和/ 或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了去纖苷酸和/或分子量4000-10000道爾頓的寡脫氧核糖核苷酸單獨(dú)或與其他具抗腫瘤作用活性成分聯(lián)合作為抗腫瘤劑的用途。所述寡苷酸可以通過從動(dòng)物和/或植物組織特別是哺乳動(dòng)物器官中提取生產(chǎn)，或者可以通過合成生產(chǎn)。能治療的腫瘤優(yōu)選血管生成依賴性腫瘤，如多發(fā)性骨髓瘤或乳腺癌。
文檔編號(hào)A61K31/711GK101254204SQ20081008223
公開日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2006年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月3日
發(fā)明者G·艾森納, L·I·費(fèi)羅, M·亞科貝利 申請(qǐng)人:真蒂奧姆有限公司