專利名稱：納米固定化酶止血材料制備方法
納米固定化酶止血材料制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種新型納米微粒止血材料的制備方法。
技術(shù)背景
應(yīng)用局部止血劑妥善止血是降低創(chuàng)傷或戰(zhàn)傷死亡率、縮短手術(shù)時間、提 高手術(shù)成功率的有效手段。當(dāng)前，局部止血劑涉及醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、高分子化
學(xué)等多個學(xué)科，諸如l)經(jīng)典止血劑凝血酶、纖維蛋白原等；2)微球類止 血材料，如沸石、微孔多聚糖止血粉等；3)殼聚糖類止血劑如HemCon繃 帶、聚乙酰氨基葡萄糖止血繃帶。但各種新型止血敷料的止血機理主要有以 下三個1)直接提供高濃度凝血因子，在局部快速形成血凝塊；2)濃縮局 部凝血因子，提供凝血表面，激活血小板、吸附紅細胞，激發(fā)凝血級聯(lián)反應(yīng)； 3)刺激血管收縮或局部壓迫使血管閉鎖。
作為生物蛋白酶的經(jīng)典止血劑——凝血酶可有效縮短止血時間，其環(huán)境 穩(wěn)定性卻限制著它的使用范圍。新型止血材料殼聚糖可通過改性制備成各種 制劑，但其止血效果多不及生物酶類止血劑。微球類止血材料是一類利用分 子篩、提供凝血表面等物理、化學(xué)作用縮短止血時間的制劑，在臨床應(yīng)用中， 止血效果不甚穩(wěn)定。納米材料有著獨特的性質(zhì)，如表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、隧 道效應(yīng)等，可以為外科止血提供獨立于縫扎、電凝、填塞、促進凝血栓形成 等方法之外的新途徑，但是納米止血技術(shù)尚處試驗階段，極不成熟。
如何將經(jīng)典的生物酶類止血材料與最新止血技術(shù)相結(jié)合，制備適合多種 環(huán)境(諸如野戰(zhàn)急救、術(shù)中止血等)的新型止血材料成為止血領(lǐng)域的研究熱 點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在運用納米技術(shù)及分子篩原理，結(jié)合酶固定化技術(shù)，提供一種納米固定化酶止血材料制備方法，有機整合殼聚糖和凝血酶，實現(xiàn)優(yōu)勢互補。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明納米固定化酶止血材料制備方法，其在嚴(yán)格控制溫度低于10°C、 pH值在4-7.3之間的環(huán)境條件下，以納米級配制凝血酶溶液和具有止血效 果的由生物相容性材料組成的固體聯(lián)結(jié)物溶液，并將兩種溶液共混后干燥，
或?qū)煞N溶液干燥后共混，制備成納米固定化酶止血材料。
所述固體聯(lián)結(jié)物溶液所采用的生物相容性材料采用殼聚糖、曱尤素、聚
乙酰氨基葡萄糖、膠原蛋白、淀粉中任意一種。
所述凝血酶溶液的溶劑為凝血酶原、纖維蛋白或纖維蛋白原。 在制備凝血酶溶液時可加入包被藥物，用于參與治療。所述包被藥物為
生長因子、化療藥物、止痛藥物或抗菌藥物。
本方法在制備止血材料的過程中，控制所述固體聯(lián)結(jié)物與凝血本酶共混
后質(zhì)量比為1: 1~100: l之間。
所述固體聯(lián)結(jié)物的濃度被控制為0.5mg/L~20mg/L之間。 本方法的止血材料粒徑控制在3 0~2000nm之間。
更進一步，制備成所稱的止血材料后，本方法還具有對其進行消毒的步驟。
本方法所制得的止血材料中，被控制至少存在l~500mg的凝血酶。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點
1. 按本發(fā)明的方法可避免使用有毒材料，諸如傳統(tǒng)的交聯(lián)劑戊二醛、曱 醛等，所生產(chǎn)的產(chǎn)品與機體生物相容性好、無毒副作用，在體內(nèi)可徹底降解.；
2. 凝血酶已經(jīng)為納米級固體聯(lián)結(jié)物尤其是殼聚糖所固定化，物理及化學(xué) 穩(wěn)定性大為提高，可于常溫下儲存運輸，價格低廉；可直接噴灑于出血創(chuàng)面， 使用方便、快捷；
3. 納米級殼聚糖固定化凝血酶，不但使殼聚糖、凝血酶的常規(guī)止血作用 優(yōu)勢互補，還具有納米微球類的分子篩作用，發(fā)揮其獨特的止血作用；
4. 運用納米藥物緩釋技術(shù)，可攜帶多種藥物，制備適合不同環(huán)境、各種 出血創(chuàng)面的止血制劑，擴大本止血材料的使用范圍，在機體中可緩慢釋放藥 物，達到局部用藥、減少藥物毒副作用或促進創(chuàng)面愈合的功能。

圖1為本發(fā)明止血材料的示意圖，圖中T代表凝血酶，C代表固體聯(lián)結(jié)
物；
圖2為應(yīng)用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的產(chǎn)品的TEM(透射電子顯微鏡)照片； 圖3為應(yīng)用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的產(chǎn)品的SEM(掃描電子顯微鏡)照片。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進 一 步的說明
如下列舉本發(fā)明納米固定化酶止血材料制備方法的四種實施例，各實施 例均需先完成一個步驟，即配制固體聯(lián)結(jié)物溶液和凝血酶溶液，環(huán)境應(yīng)嚴(yán) 格控制溫度于l(TC以下，pH值在4 - 7.3之間，或者更精確地控制在4.2 - 4.8 之間。
需要指出的是，所述固體聯(lián)結(jié)物溶液所釆用的生物相容性材料可采用殼 聚糖、曱亢素、聚乙酰氨基葡萄糖、膠原蛋白、淀粉中任意一種。以下各實 施例中則以殼聚糖例進行說明。而所述凝血酶溶液的溶劑則可為凝血酶原、 纖維蛋白或纖維蛋白原。在制備凝血酶溶液時可加入包被藥物，用于參與治 療。所述包被藥物為生長因子、化療藥物、止痛藥物或抗菌藥物。
實施例一主要包括如下幾個步驟.
步驟一、分別真空冷凍干燥所述兩種溶液，得固體聯(lián)結(jié)物和凝血酶干粉 制劑；
步驟二、按比例將所述兩種干粉制劑共混，固體聯(lián)結(jié)物與凝血酶的質(zhì)量 比控制在(1~20): 1之間；
步驟三、將共混后的干粉制劑進行物理研磨至呈500 2000nm孩炎粒。 實施例二主要包括如下幾個步驟
步驟一、按比例混合所述兩種溶液，如所采用的殼聚糖和凝血酶的質(zhì)量 比控制在(2 100) :l之間，殼聚糖濃度在(0.5~20) mg/L;
步驟二、將共混后的溶液置入密閉容器，加蓋篩孔直徑為20 1000nm的 濾器，接真空冷凍干燥器，利用噴霧干燥法得粒徑在30 1000nm的納米^f敫粒。
實施例三主要包括如下幾個步驟
步驟一、按比例混合上述兩種溶液，如殼聚糖和凝血酶的質(zhì)量比控制在 (2 100 ) :1之間，殼聚糖濃度在(0.5 5 ) mg/L;步驟二、在磁力攪拌、超聲等方式下，加入三聚磷酸鈉等無毒離子交聯(lián)
劑，制備殼聚糖固定化凝血酶納米微粒溶液；
步驟三、真空冷凍干燥步本實施例步驟二所得納米微粒溶液，得粒徑在 3 0 5OOnm的納米微粒。
實施例四主要包括如下幾個步驟
步驟一、對固體聯(lián)結(jié)物如殼聚糖進行化學(xué)修飾，制備具有親水和疏水的 兩性分子；
步驟二、在磁力攪拌、超聲等方式下，將上述修飾過的兩性分子加入凝 血酶溶液，分子自組裝成納米微粒，使殼聚糖和凝血酶的最終質(zhì)量比在 (2~100) :l之間，殼聚糖的最終濃度在(0.5 5) mg/L之間；
步驟三、真空冷凍干燥本實施例步驟二所得溶液，得粒徑在20~300nm 的納米孩t粒。
上述各實施例在完成其各自的幾個主要步驟后，所得的納米微粒還需要 進行消毒的步驟，具體可釆用Co60進行消毒，消毒后即可用直接用于出血 部位，亦可作為原材料，進行深加工，從而制備適用于不同條件的止血劑。
上述各實施例制備的包含凝血酶的納米微粒具有止血效果，如再加入其 他治療目的的藥物后，可通過上述工藝制備具有不同治療作用的材料，深加 工后可制備止血貼劑、止血膠的不同止血制劑。
上述制作固體聯(lián)結(jié)物是殼聚糖納米微粒體系，該體系制作工藝成熟，產(chǎn) 物生物相容性好，有一定的黏附性，且可作為多種藥物的載體。同時，隨著 舊材料的改型及新材料的研發(fā)，殼聚糖納米粒亦可為曱殼素、聚乙酰氨基葡 萄糖、膠原蛋白、淀粉等材料所替代。
上述凝血酶來自豬或其他動物，亦可來自血站，制備方法如下
以新鮮血液為原料，經(jīng)過高速離心，碌u酸鋇沉淀、鹽溶液洗脫、脫鹽、 氯化鈣激活濃縮，加保護劑，去病毒、無菌過濾、得到凝血酶溶液。
本發(fā)明所制得的止血材料可通過參考圖1和圖3獲得進一步提高認識。
綜上所述，本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有較大的改進，用該本發(fā)明的方法所 生產(chǎn)的產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于普通外科、神經(jīng)外科、心胸外科、泌尿外科、婦產(chǎn) 科、口腔科、微創(chuàng)外科(如腹腔鏡、胸腔鏡、盆腔鏡)等需要止血、堵漏(瘺) 的手術(shù)中，縮短手術(shù)時間，降低手術(shù)風(fēng)險，加速創(chuàng)傷愈合，縮短住院時間。 亦可用于戰(zhàn)傷、事故中的急救止血。
權(quán)利要求
1、一種納米固定化酶止血材料制備方法，其特征在于在嚴(yán)格控制溫度低于10℃、pH值在4-7.3之間的環(huán)境條件下，以納米級配制凝血酶溶液和具有止血效果的由生物相容性材料組成的固體聯(lián)結(jié)物溶液，并將兩種溶液共混后干燥，或?qū)煞N溶液干燥后共混，制備成納米固定化酶止血材料。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米固定化酶止血材料制備方法，其特征在 于所述固體聯(lián)結(jié)物溶液所采用的生物相容性材料采用殼聚糖、曱亢素、聚 乙酰氨基葡萄糖、膠原蛋白、淀粉中任意一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米固定化酶止血材料制備方法，其特征在 于所述凝血酶溶液的溶劑為凝血酶原、纖維蛋白或纖維蛋白原。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米固定化酶止血材料制備方法，其特征在 于在制備凝血酶溶液時加入包被藥物，用于參與治療。
5 、根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米固定化酶止血材料制備方法，其特征在于 所述包被藥物為生長因子、化療藥物、止痛藥物或抗菌藥物。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項所述的納米固定化酶止血材料制備 方法，其特征在于本方法在制備止血材料的過程中，控制所述固體聯(lián)結(jié)物 與凝血本酶共混后質(zhì)量比為1: 1 100: l之間。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項所述的納米固定化酶止血材料制備 方法，其特征在于所述固體聯(lián)結(jié)物的濃度被控制為0.5mg/L 20mg/L之間。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項所述的納米固定化酶止血材料制備 方法，其特征在于本方法的止血材料粒徑控制在30 2000nm之間。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項所述的納米固定化酶止血材料制備 方法，其特征在于制備成所稱的止血材料后，本方法還具有對其進行消毒 的步驟。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項所述的納米固定化酶止血材料制備 方法，其特征在于本方法所制得的止血材料中，；故控制至少存在1 500mg 的凝血酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種納米固定化酶止血材料制備方法，其在嚴(yán)格控制溫度低于10℃、pH值在4-7.3之間的環(huán)境條件下，以納米級配制凝血酶溶液和具有止血效果的由生物相容性材料組成的固體聯(lián)結(jié)物溶液，并將兩種溶液共混后干燥，或?qū)煞N溶液干燥后共混，制備成納米固定化酶止血材料。本發(fā)明運用了納米技術(shù)及分子篩原理，結(jié)合酶固定化技術(shù)，有機整合了殼聚糖和凝血酶，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，該方法操作方便、無需繁瑣的準(zhǔn)備工作、所制得止血材料使用時安全可靠、能起到快速止血、加速創(chuàng)面愈合、并且可作為藥物載體。
文檔編號A61L15/32GK101229389SQ20081008266
公開日2008年7月30日 申請日期2008年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者陳長昊 申請人:陳長昊