專利名稱：：用于治療糖尿病性心血管病變的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及以植物材料提取物為活性成分的藥物組合物，具體涉及一組用于治療糖尿病性心血管病變的組合物及其制備方法。發(fā)明背景目前全世界糖尿病發(fā)病率約4.6%，累計(jì)達(dá)2億人。其發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)至2025年，糖尿病發(fā)病率約5.4%，達(dá)3億人。糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者最常見和最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，如大、中動(dòng)脈的粥樣硬化和微血管病變(糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病腦血管功能障礙等)，是預(yù)后不良及致死的主要原因。糖尿病可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能不全，導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸入、血管平滑肌細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞死亡，引發(fā)血管增生，最終導(dǎo)致粥樣硬化、斑塊破裂及血管再狹窄。糖尿病血管并發(fā)癥在很大程度上是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或功能障礙所致。血管內(nèi)皮功能改變是血管病變的病理基礎(chǔ)，而內(nèi)皮功能的異常也加速了糖尿病及其并發(fā)癥的進(jìn)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞也是胰島素的靶器官之一，胰島素與內(nèi)皮細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合后，促使其釋放一氧化氮(NO)增加而實(shí)現(xiàn)其血管舒張的生理功能。包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞膜損傷引起胰島素受體分布和功能變化，從而產(chǎn)生胰島素抵抗，又促使內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)行性損害，使血管功能障礙發(fā)生、發(fā)展。血管內(nèi)皮功能異常在糖尿病前期就己存在，隨著血糖升高，血管內(nèi)皮功能受損會逐漸加重。，內(nèi)皮釋放的NO具有一種血管舒張效應(yīng)并抑制血小板的聚集、白細(xì)胞到內(nèi)皮的粘附和內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞的增殖，它在許多關(guān)健性的心血管機(jī)理中是至關(guān)重要的。心血管疾病的形成中的關(guān)健步驟由于內(nèi)皮NO釋放的降低，例如，低密度脂蛋白的氧化作用，血管內(nèi)膜中的單核細(xì)胞的補(bǔ)充和沉積，內(nèi)膜細(xì)胞的增殖加速。動(dòng)脈粥樣化形成的后果是在血管的內(nèi)壁上形成斑塊，其可以反過來通過剪應(yīng)力的減少而導(dǎo)致內(nèi)皮NO釋放的進(jìn)一步下降以及病狀的進(jìn)一步惡化。由于內(nèi)皮N0也是一種血管擴(kuò)張劑，它們的降低還經(jīng)常導(dǎo)致高血壓，后者作為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致進(jìn)一步的器官損壞。目前，糖尿病并發(fā)心血管疾病的藥物防治的常用措施為1、采用降糖藥物控制血糖。但僅僅控制血糖是不夠的，必須兼顧控制心血管疾病的危險(xiǎn)因素。2、采用降壓藥物控制血壓。大量臨床資料表明，控制血壓可以使糖尿病人群心血管病風(fēng)險(xiǎn)減少25%50%。3、采用降脂藥物調(diào)理血脂。如用他丁類或貝特類調(diào)理血脂，可使各種心血管疾病的危險(xiǎn)降低25%55%。4、采用抗血小板聚集藥物改善高凝狀態(tài)?？寡“寰奂幬铮绨⑺蛊チ?，有助于改善高凝狀態(tài)，使糖尿病患者的心血管事件與心肌梗死的發(fā)生率分別下降15%和46%。(吳秋楓，糖尿病并發(fā)心血管疾病的防治，欲s:^西^"裙合i^吉，2007年第17巻第7期，第397418頁；陳立新、李玨，糖尿病患者心血管并發(fā)癥的干預(yù)性治療進(jìn)展，《V5:厲^"度學(xué)腐學(xué)/見第24巻第4期，第601602頁)。這些治療措施的缺陷顯而易見，西藥治療糖尿病及其心血管并發(fā)癥注重于控制血糖及并發(fā)癥的癥狀，但不能阻止糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生，對心血管并發(fā)癥常沒有治本僅有治標(biāo)的作用且療效較低，而且還有一定的毒副作用。而傳統(tǒng)中藥藥方存在有效成分不明確、含量偏低或極低，不利于生產(chǎn)質(zhì)量控制及療效較西藥偏低等缺陷，盡管毒副作用較西藥很低或無。牛蒡子(Fructusarctii)是牛蒡的干燥成熟果實(shí)，為歷版《中國藥典》收載，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的功效。傳統(tǒng)中醫(yī)臨床多用于風(fēng)熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風(fēng)疹、咽喉腫痛、癢腮丹毒等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明牛蒡子有抗腫瘤、降血糖、抗HIV和抑制血小板聚集等作用。臨床上用牛蒡子治療糖尿病及其并發(fā)癥糖尿病腎病效果顯著。藥理實(shí)驗(yàn)也證明牛蒡子具有降低血糖和尿中蛋白質(zhì)的作用。但是目前國內(nèi)外均采用牛蒡子有效部分進(jìn)行降血糖實(shí)驗(yàn)，而且其活性成分并不明確。近年來，國內(nèi)研究表明牛蒡子水提物、醇提物能顯著而持久地降低大鼠血糖，對碳水化合物耐量增高，毒性較??；牛蒡子提取物對糖尿病大鼠腎臟病變有一定的改善，其作用機(jī)制可能與減輕細(xì)胞內(nèi)蛋白非酶糖基化有關(guān)。牛蒡子提取物中的成分中含有牛蒡子苷及牛蒡子苷元，牛蒡子苷(arctiin)及牛蒡子苷元(arctigenin)如下結(jié)構(gòu)式(I)、結(jié)構(gòu)式(II)所示結(jié)構(gòu)式(I)結(jié)構(gòu)式(II)專利ZL02133954.6公開了一種用于治療糖尿病腎病或糖尿病的牛蒡子總木脂素苷類提取物。其技術(shù)方案為:用乙醇等有機(jī)溶媒提取，精制，干燥，獲得含牛蒡子總木脂素苷類物質(zhì)5090%(用紫外分光光度法測定)，或含牛蒡子苷1570%(高效液相法測定)的提取物為原料藥配制用于治療糖尿病腎病或糖尿病的藥物制劑。專利申請CN200610013120.0公開了一種以牛蒡子總木脂素苷類提取物為原料制成的具有降糖益腎作用的中藥，其牛蒡子總木脂素的含量5089%之間，牛蒡子苷的含量在30%以上。專利申請CN200510025834.9公開了一種牛蒡子提取物及其制備方法及應(yīng)用，該提取物中包含以牛蒡子苷元為主的總木質(zhì)素類化合物和牛蒡子苷，總木質(zhì)素類化合物和牛蒡子苷的重量含量占52%—80%，其他成分的重量含量占20%一49%。以上發(fā)明的不足是僅發(fā)現(xiàn)牛蒡子提取物的降糖效果；藥用成分為混合物，不利于生產(chǎn)質(zhì)量控制和藥效的提高；牛蒡子苷純度不高。本發(fā)明人經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷和牛蒡子苷元可以用于治療糖尿病性心血管病發(fā)癥，牛蒡子苷和牛蒡子苷元對心血管血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提出一種對糖尿病性心血管病變標(biāo)本兼治，且療效較高、毒副作用較低的藥物。為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目標(biāo)，本發(fā)明人進(jìn)行了牛蒡子苷和牛蒡子苷元對心血管內(nèi)皮的保護(hù)作用的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小劑量牛蒡子苷和苷元能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)。本發(fā)明人同時(shí)發(fā)現(xiàn)，牛蒡子苷和牛蒡子苷元在一定劑量下，能夠顯著對抗高糖對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，給予牛蒡子苷干預(yù)后內(nèi)皮細(xì)胞在高糖條件下分泌NO的能力顯著提高，此劑量下的牛蒡子苷能夠顯著的保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖條件所致的損傷。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)行了更深入廣泛的研究，實(shí)現(xiàn)了這一目標(biāo)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種治療和預(yù)防糖尿病性心血管病變的組合物，其特征在于其特征在于述組合物包含(a)牛蒡子苷、藥用添加劑和/或藥用載體；或(b)牛蒡子苷元、藥用添加劑和/或藥用載體；或(c)牛蒡子苷、牛蒡子苷元、藥用添加劑和/或藥用載體。其中所述組合物(c)中牛蒡子苷的含量為50-99重量份，牛蒡子苷元的含量為l一50重量份；優(yōu)選為牛蒡子苷75—95重量份，牛蒡子苷元5—25重量份。所述組合物中牛蒡子苷純度為90%(高效液相色譜法測定)以上，牛蒡子苷元的純度為90%(高效液相色譜法測定)以上。藥用添加劑和/或藥用載體的含量為100—20000重量份；所述組合物中的藥用添加劑和藥用載體包括填充劑、崩解劑、粘合劑、滑潤劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分散劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、調(diào)味劑、芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、溶劑、增溶劑、旨在獲得貯存效果的試劑、旨在改變滲透壓的鹽、涂布劑或抗氧化劑。所述組合物可制備成片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、噴霧劑或栓劑；本說明書中各組分的重量以重量份計(jì)，有特殊說明的除外；其中片劑或丸劑的片芯中含有組合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，從乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種250~350，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10，包衣預(yù)混劑歐巴代OY-C-7000A3—5;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，從乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種250—350，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10，包衣預(yù)混劑歐巴代0Y-C-7000A3—5;組合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，從乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種250—350，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10，包衣預(yù)混劑歐巴代0Y-C-7000A3—5;其中含速釋層的雙層緩釋片劑或丸劑的片芯中含有組合物(a)中牛蒡子苷1一IOO，從乳糖、淀粉、羥丙基纖維素，聚乙烯基吡咯垸酮中選出的至少一種80—150，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，從乳糖、淀粉、羥丙基纖維素，聚乙烯基吡咯垸酮中選出的至少一種80—150，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10;組合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，從乳糖、淀粉、羥丙基纖維素，聚乙烯基吡咯垸酮中選出的至少一種80—150，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種5—10;所述雙層緩釋片劑或丸劑的包衣液中含有羥丙基纖維素70—100，聚乙二醇-400l—5、聚山梨酯-801—5，從檸檬黃、鈦白粉中選出的至少一種1—5;其中膠囊劑中含有組合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種200—300，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種l-4;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，從乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種200—300，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種1~4;組合物(c)中牛蒡子苷50~99，牛蒡子苷元1一50，從乳糖、淀粉、糊精、羥丙基纖維素中選出的至少一種200—300，從滑石粉、硬脂酸鎂中選出的至少一種1-4;其中注射劑中含有組合物(a)中牛蒡子苷1—100，氯化鈉18，注射用水定容至2000;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，氯化鈉18，注射用水定容至2000;組合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1一50，氯化鈉18，注射用水定容至2000;其中栓劑中含有組合物(a)中牛蒡子苷1—100,半合成脂肪酸酯600—800;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，半合成脂肪酸酯600—800;組合物(c)中牛蒡子苷50一99，牛蒡子苷元i一50，半合成脂肪酸酯600—800;其中噴霧劑中含有組合物(a)中牛蒡子苷I一IOO，甜菊素50，山梨酸鉀30，注射用水加至10000;組合物(b)中牛蒡子苷元I一IOO，甜菊素50，山梨酸鉀30，注射用水加至10000;組合物(c)中牛蒡子苷50—99，牛蒡子苷元1—50，甜菊50，山梨酸鉀30，注射用水加至10000。所述的重量份可以是克、市兩、公斤、市斤、噸等。本發(fā)明分別提純了純度大于90%(高效液相色譜測定)的牛蒡子苷和牛蒡子苷元，牛蒡子苷、牛蒡子苷元單獨(dú)用藥可以分別作用于心血管內(nèi)皮細(xì)胞治療和預(yù)防糖尿病性心血管并發(fā)癥，將牛蒡子苷和牛蒡子苷元組合用藥對于治療糖尿病性心血管并發(fā)癥變具有協(xié)同的治療效果。提純后的牛蒡子和牛蒡子苷元中的雜質(zhì)包括牛蒡酚B(lappaolB)、牛蒡酚A(lappaolA)、牛蒡酚F(lappaolF)、羅漢松脂素(matairesinol)、8-羥基松脂素(8-hydroxypinoresino1)、(+)-秦皮樹月旨醇((+)-Fraxiresino1)、山萘酚(kaempferol)、無梗五加苷B(acanthosideB)、槲皮素(quercetin)和異槲皮素(isoquercitrin)等。本發(fā)明采取的用于治療和預(yù)防糖尿病性心血管并發(fā)癥的組合物的制備方法1、牛蒡子苷、牛蒡子苷元的分離提純方法(1)牛蒡子苷的制備①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程60—90'C石油醚回流脫脂2—4次，脫脂后取出晾干，60%—80%8倍乙醇回流提取2—4次，每次0.5—2h，提取液6(TC—8(TC減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加15—35%乙醇，超聲處理15—35分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成濃度約為5—7mg/mL的溶液，通過AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的l-2倍，流速控制為1.5—2.5BV/h，柱徑高比控制為1:5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度0.5—3BV/h;再換以4一6BV50。/。乙醇洗脫，醇洗速度1—3BV/h，收集洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分離牛蒡子粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的1-2倍，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，硅膠柱為牛蒡子苷粗品的10—50倍，氯仿-甲醇95:l洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮，得牛蒡子苷；(2)牛蒡子苷元制備①牛蒡子苷元粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程6090。C的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2—4次，每次1.5—2.5h，提取液70。C減壓濃縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制將褐色浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷元粗品的1-2倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，氯仿-甲醇98:l洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元。其中大孔樹脂精制牛蒡子苷提取物時(shí)的優(yōu)選方案為取牛蒡子苷醇提物，加15—30%乙醇，充分?jǐn)嚢?，超聲處?5—30分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成上樣藥液濃度為3—6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的l-2倍，上樣流速控制為2BV/h，柱徑高比控制為1:5。水洗2—3倍樹脂體積，水洗速度1—2BV/h;再換以3.5—4.5BV50%乙醇洗脫，醇洗速度l一2BV/h，收集醇洗液，濃縮干燥得牛蒡子粗品。2、按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、藥用添加劑和/或藥用載體的比例配置混合。本發(fā)明涉及的組合物可通過任何適宜的途徑給予，例如，通過口服、眼局部、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、表皮下、直腸、經(jīng)皮、或經(jīng)肺給藥。本發(fā)明涉及的組合物可通過任何符合上述組合物的口服的給藥形式包括但不限于丸劑、普通片劑、雙層片劑、多層片劑、緩釋片劑、單室控釋片劑、雙室控釋片劑、微孔型控釋片劑、舌下含片、口腔速崩片、分散片、腸溶片、顆粒劑、延遲釋放片、定時(shí)/位釋放片、普通膠囊、腸溶膠囊、緩釋膠囊、控釋膠囊、含有微丸或小片的膠囊、含有微丸或小片的PH依賴型膠囊、顆粒劑、膜劑或貼劑、水溶液、酒精溶液或油溶液、乳劑或混懸劑；眼局部給藥的形式包括但不限于滴眼液、眼用軟膏劑、眼用貼劑；直腸給藥的形式包括但不限于栓劑;注射給藥的形式包括但不限于溶液、固體粉未或塊狀物、乳劑或混懸劑。其它適用的給藥形式還包括不限于經(jīng)皮膚或局部給藥，例如以軟膏劑、酊劑、噴霧或透皮治療劑體系的形式，或以鼻噴入法或氣霧劑混合物的形式的吸入給藥，或采取微囊劑、植入劑或植入棒的形式給藥。本優(yōu)選的給藥形式為口服和注射給藥形式給藥。藥物給藥形式的制備方法通常依據(jù)其具體形式、組合物實(shí)際情況和添加劑的性質(zhì)等來確定。用于制備本發(fā)明的藥物給藥形式的方法在本領(lǐng)域中是已知的，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的。在這一方面，將牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元與一種或多種固體或液體藥物載體和/或藥用添加劑并且與其他具有治療或預(yù)防功能的具有藥物活性的化合物結(jié)合在一起，制成適當(dāng)?shù)慕o藥形式或配藥形式。本發(fā)明涉及的組合物的給藥形式也可以包含添加劑，例如填充劑、崩解劑、粘合劑、滑潤劑、濕潤劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、分散劑、防腐劑、甜味劑、著色劑、調(diào)味劑、芳香劑、增稠劑、稀釋劑、緩沖物質(zhì)、溶劑、增溶劑、旨在獲得貯存效果的試劑、旨在改變滲透壓的鹽、涂布劑或抗氧化劑。本發(fā)明涉及的藥用載體或藥用添加劑的選擇及其用量的選擇根據(jù)具體的應(yīng)用形式、口腔組合物實(shí)際情況、制備方法和主觀需求等來確定?？诜o藥形式通常包含惰性稀釋劑或可食用載體。它們可以包封在明膠膠囊中或壓成片劑。為了口服給藥治療，可以將活性化合物或其前體藥物衍生物與賦形劑混合并以片劑，錠劑或膠囊劑的形式使用。也可以包含在藥學(xué)上可配伍的粘合劑和/或佐劑物質(zhì)，作為組合物中的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑等等可以包含任何下列組分或性質(zhì)類似的化合物粘合劑如微晶纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素或明膠；賦形劑如淀粉、甘露醇或乳糖；增塑劑為甘油、丙二醇或聚乙二醇；分散劑如藻酸或玉米淀粉；遮光劑為二氧化鈦；抗粘劑如硬脂酸鎂或滑石粉；潤滑劑如膠態(tài)二氧化硅；增甜劑如糖精、阿斯巴甜或甜菊素；矯味劑如薄荷，橙皮油。當(dāng)劑量單位形式為膠囊劑時(shí)，除上述種類的物質(zhì)外，它可以包含液體載體如脂油。另外，劑量單位形式可以包含各種其它能夠改變劑量單位物理形態(tài)或性能的物質(zhì)，例如包衣劑。軟明膠膠囊和栓劑的載體是例如脂肪、蠟、半固體和液體多元醇、天然或硬化油等。適用于微囊劑、植入劑或植入棒的載體是例如羥基乙酸和乳酸的共聚物。也可以將牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的凍干物，例如將其用于制備用于注射和輸注的制劑中。用于非腸道，真皮內(nèi)，皮下或局部給藥的溶液或懸浮液可包含下列組分:滅菌的稀釋劑如注射用水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抑菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；鰲合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽，枸椽酸鹽或磷酸鹽和調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉。非腸道給藥的制劑可包封在由玻璃或塑料制成的安瓿，可處理注射器或多劑量小瓶中。如果通過靜脈注射給藥，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖的鹽水。本發(fā)明涉及的組合物在藥物制劑中的量一般為每劑0.11000mg(以牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元計(jì)，下同)，優(yōu)選0.5500mg，特別是1200mg。典型的局部給藥劑量為0.013%wt/wt(在適宜的載體中)。給予本發(fā)明涉及的組合物來獲得活性化合物的血漿峰濃度，其值為0.0000110mmol/L,優(yōu)選為0.001300|amol/L,進(jìn)一步優(yōu)選為0.0130pmol/L。例如，這可以通過靜脈注射活性組分的溶液或制劑，可有可無的鹽水或水性溶媒，或者可以通過給予活性組分的藥團(tuán)來獲得。組合物中的活性化合物(牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元)的血藥濃度依賴于藥物的吸收，分布，滅活和排泄速率以及本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的其它因素。在本發(fā)明涉及的組合物中，也可以將牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元與其它不削弱所需作用的活性物質(zhì)，或與補(bǔ)充所需作用的物質(zhì)，如其它相同活性的藥物、降糖藥、抗氧化劑、醛糖還原酶抑制劑、內(nèi)皮生長因子抑制劑、抗血小板聚集藥或它們的混合物。本發(fā)明還涉及上述的組合物的用途。其可用于治療和預(yù)防糖尿病性視網(wǎng)膜病變的藥物、保健品或食品添加劑。本發(fā)明還涉及一種治療和預(yù)防糖尿病性心血管并發(fā)癥的組合物，包括I.牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元II.其它治療藥，所述的治療藥選自其它與牛蒡子苷相同活性的藥物、降糖藥、抗氧化劑、醛糖還原酶抑制劑、內(nèi)皮生長因子抑制劑、抗血小板聚集藥或它們的混合物。上述的方法中，施用牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的給藥的劑量取決于各個(gè)實(shí)例，并且依慣例根據(jù)每一情況進(jìn)行調(diào)整從而達(dá)到最好的效果。施用本發(fā)明涉及的組合物的給藥的劑量值也隨著疾病產(chǎn)重程度的減輕而改變。進(jìn)一步應(yīng)該知道，就任何特定的治療對象而言，特定的劑量方案應(yīng)該根據(jù)個(gè)休需要和具體的療程或監(jiān)督給予組合物的人的職業(yè)判斷，隨時(shí)間變化進(jìn)行調(diào)節(jié)，并且本文所提出的濃度范圍僅作為實(shí)例說明并不限定所公開組合物的范圍或應(yīng)用。由此，上述劑量取決于待處理的病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，也取決于患者的性別和體征，取決于牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元的作用時(shí)間，取決于治療是急性的或長期的或預(yù)防性的，或者取決于除牛蒡子苷、牛蒡子苷元或牛蒡子苷及牛蒡子苷元外是否有其它活性化合物被給藥。一般而言，為了取得所希望的效果，適宜的每日劑量是約0.01500mg/kg，優(yōu)選0.05200mg/kg，特別是0.1100mg/kg。每日劑量可以在一次給藥中使用，或者被分成幾次(例如兩次或三次)給藥。在有些情況下，取決于個(gè)體的反應(yīng)，可能需要從給出的每日劑量向上或向下調(diào)整。本發(fā)明相對已有技術(shù)的優(yōu)勢1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了牛蒡子苷和牛蒡子苷元對于心血管內(nèi)皮細(xì)胞的治療作用，可以顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞在高糖條件下分泌一氧化氮(nitrogenoxide，NO)的能力，顯著保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受高糖條件所致的損傷。2、與以往治療糖尿病性心血管并發(fā)癥的化學(xué)藥物相比，本發(fā)明涉及的組合物具有標(biāo)本兼治的效果，即針對糖尿病具有很強(qiáng)的治療效果，又改善視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞。因而具有多重療效，且毒性極低，副作用極小。3、與以往治療糖尿病性心血管并發(fā)癥的傳統(tǒng)藥方、中成藥相比，本發(fā)明涉及的藥物或藥物組合物具有有效成分明確，純度高；有利于生產(chǎn)質(zhì)量控制，有利于實(shí)施中藥現(xiàn)代化；療效較高，且毒副作用沒有明顯增加等優(yōu)勢。圖1是牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷和牛蒡子苷元1:1混合物對高糖條件下大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rataorticendothelialcells,RAECs)表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響。具體實(shí)施方式由此已詳細(xì)地描述了本發(fā)明，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在本發(fā)明的范圍內(nèi)顯然還可有各種改變，本發(fā)明并不受說明書所述的限制。實(shí)施例1牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制備方法(1)牛蒡子苷的制備①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程60—9(TC石油醚回流脫脂2次，脫脂后取出晾干，60%8倍乙醇回流提取2次，每次0.8h，提取液6(TC減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加15%乙醇，超聲處理15分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成濃度約為5mg/mL的溶液，通過AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液1倍，流速控制為1.5BV/h，柱徑高比控制為1:5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度0.5BV/h;再換以4BV50。/。乙醇洗脫，醇洗速度lBV/h，收集洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分離牛蒡子苷粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的1倍，經(jīng)200-300目硅膠柱層析，硅膠柱為牛蒡子苷粗品的IO倍，氯仿-甲醇95:l洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮，得牛蒡子苷，高效液相色譜測定純度為90.3%;(2)牛蒡子苷元制備①牛蒡子苷元粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程6090°C的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2次，每次1.5h，提取液70'C減壓濃縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制褐色將浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子粗品的1倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，氯仿-甲醇98:l洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色譜測定純度為90.5%。實(shí)施例2牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制備方法(1)牛蒡子苷的制備①牛蒡子苷的粗提:牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程60—9(TC石油醚回流脫脂4次，脫脂后取出晾干，80%8倍乙醇回流提取4次，每次2h，提取液80"C減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加35%乙醇，超聲處理35分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成濃度約為7mg/mL的溶液，通過AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液的2倍，流速控制為2.5BV/h，柱徑高比控制為1:5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度3BV/h;再換以6BV50。/。乙醇洗脫，醇洗速度3BV/h，收集洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；(D牛蒡子苷的分離牛蒡子苷粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的2倍，經(jīng)200-300目硅膠柱層析，硅膠柱體積為牛蒡子苷粗品的50倍，氯仿-甲醇95:l洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮，得牛蒡子苷，高效液相色譜測定純度為90.7%;(2)牛蒡子苷元制備①牛蒡子苷元粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程609(TC的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取4次，每次2.5h，提取液7(TC減壓濃縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制將褐色浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，氯仿-甲醇98:1洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色譜測定純度為90.8%。實(shí)施例3牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制備方法(1)牛蒡子苷的制備①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程60—9(TC石油醚回流脫脂3次，脫脂后取出晾干，70%8倍乙醇回流提取3次，每次lh，提取液7(TC減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加20%乙醇，超聲處理20分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成濃度約為6mg/mL的溶液，通過AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的1.5倍，流速控制為2BV/h，柱徑高比控制為1:5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度2BV/h;再換以5BV50%乙醇洗脫，醇洗速度2BV/h，收集洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分離牛蒡子苷粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的2倍，經(jīng)200-300目硅膠柱層析，硅膠柱體積為牛蒡子苷粗品的25倍，氯仿-甲醇95:l洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮，得牛蒡子苷，高效液相色譜測定純度為91.3%;(2)牛蒡子苷元制備①牛蒡子苷元粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程609(TC的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液7(TC減壓濃縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制將褐色浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷元粗品的L5倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，氯仿-甲醇98:1洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色譜測定純度為91.7%。實(shí)施例4牛蒡子苷和牛蒡子苷元的制備方法(1)牛蒡子苷的制備①牛蒡子苷的粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程8(TC石油醚回流脫脂3次，脫脂后取出晾干，75%8倍乙醇回流提取3次，每次lh，提取液7(TC減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加25%乙醇，充分?jǐn)嚢?，超聲處?5分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成上樣藥液濃度為5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的1.5倍，上樣流速控制為2BV/h,柱徑高比控制為k5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度1.5BV/h;再換以4BV50。/。乙醇洗脫，醇洗速度1.5BV/h，收集醇洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；③牛蒡子苷的分離牛蒡子苷粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的2倍，經(jīng)200-300目硅膠柱層析，硅膠柱體積為牛蒡子苷粗品的40倍，氯仿-甲醇95:l洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮得牛蒡子苷，高效液相色譜測定純度為90.8%;(2)牛蒡子苷元制備①牛蒡子苷元粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程6090。C的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，提取液70。C減壓濃縮，得褐色浸膏；②牛蒡子苷元的精制將褐色浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷元粗品的2倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱析層，氯仿-甲醇98:1洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元，高效液相色譜測定純度為91.2%。實(shí)施例5膠囊劑膠囊劑配方組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)100g乳糖(賦形劑)130g淀粉(賦形劑)120g硬脂酸鎂(抗粘劑)2.5g共制成IOOO粒組合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)訓(xùn)g乳糖(賦形劑)130g淀粉(賦形劑)120g硬脂酸鎂(抗粘劑)2.5g共制成IOOO粒組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)50g牛蒡子苷元(活性成分)50g乳糖(賦形劑)130g淀粉(賦形劑)120g硬脂酸鎂(抗粘劑)2.5g共制成IOOO粒制法將活性成份和藥用輔料均過IOO目篩，按處方分別準(zhǔn)確稱量，在混合機(jī)中混合10—15min，加入硬脂酸鎂2.5g,混合2min后，裝入1000粒膠囊即得。實(shí)施例6注射劑注射劑配方組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)100g氯化鈉(調(diào)節(jié)滲透壓的鹽)18g注射用水(藥用載體)至2000ml共制成IOOO支組合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)100g氯化鈉(調(diào)節(jié)滲透壓的鹽)18g注射用水(藥用載體)至2000ml共制成IOOO支組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)85g<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>制法稱取處方量的活性成份，加全量卯％的注射用水?dāng)嚢枋谷芙猓醋⑸溆盟康?.iy。(W/V)比例加入活性炭，攪拌20分鐘，布氏漏斗鋪兩層無菌濾紙抽濾后，再將粗濾液經(jīng)已滅菌的0.2pm微孔濾膜精濾。補(bǔ)加注射用水至足量，使牛蒡子苷和牛蒡子苷元含量為標(biāo)示量的95.0%105.0%，灌裝，即得。實(shí)施例7片芯配方:片劑或丸劑組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)100g糊精(賦形劑)162.5g乳糖(賦形劑)137.5g低取代羥丙基纖維素(粘合劑)18.75g4%羥丙基纖維素的50%乙醇(粘合劑)112.5ml滑石粉(抗粘劑)3.75g硬脂酸鎂(抗粘劑)3.75g共制成1250片組合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)100g糊精(賦形劑)162.5g乳糖(賦形劑)137.5g低取代羥丙基纖維素(粘合劑)18.75g4%羥丙基纖維素的50%乙醇(粘合劑)112.5ml滑石粉(抗粘劑)3.75g硬脂酸鎂(抗粘劑)3.75g共制成1250片組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)75g牛蒡子苷元(活性成分)25g糊精(賦形劑)162.5g乳糖(賦形劑)137.5g低取代羥丙基纖維素(粘合劑)lS.75g4%羥丙基纖維素的50%乙醇(粘合劑)112.5ml滑石粉(抗粘劑)3.75g硬脂酸鎂(抗粘劑)_3.75g共制成1250片包衣液配方包衣預(yù)混劑(歐巴代0Y-C-7000A)4.37g純水_30g制成1250片制備工藝將活性成份和其他輔料均過100目篩，稱取處方量的活性成份、糊精和占處方量一半的低取代羥丙基纖維素,按等量遞加法混合均勻，以4%羥丙基纖維素的50%的乙醇為潤濕劑制軟材，18目篩制粒，濕顆粒于455(TC干燥，20目篩整粒，加入剩余量的低取代羥丙基纖維素、處方量的微粉硅膠、硬脂酸鎂混勻，測定主藥含量后，確定片重，于10.0mm淺凹沖模壓片。按常規(guī)方法包以白色薄膜衣，包衣增重12%。包衣液的配制在攪拌下把包衣預(yù)混劑(歐巴代0Y-C-7000A)加入純水中，5分鐘內(nèi)加完，繼續(xù)攪拌45分鐘即得。實(shí)施例8噴霧劑噴霧劑配方組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)100.0g甜菊素(增甜劑)50.0g山梨酸鉀(防腐劑)30.0g注射用水(藥用載體)_加至10000ml共制成500支組合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)100.0g甜菊素(增甜劑)50.0g山梨酸鉀(防腐劑)30.Og注射用水(藥用載體)加至10000ml共制成500支組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)80.Og牛蒡子苷元(活性成分)20.Og甜菊素(增甜劑)50.Og山梨酸鉀(防腐劑)30.Og注射用水(藥用載體)加至10000ml共制成500支制備方法稱取處方量的活性成份，加入約30%的溫度801:左右熱注射用水中，攪拌使其溶解，再將甜菊素、山梨酸鉀逐步加入其中，攪拌使其溶解，加入0.05%針用活性炭，于溫度708(TC吸附15分鐘，脫炭，補(bǔ)加注射用水至全量，攪勻，灌裝即得。實(shí)施例9栓劑栓劑配方組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)80g半合成脂肪酸酯(藥用載體)700g_制成400粒組合物(b)牛蒡子苷元(活性成分)20g半合成脂肪酸酯(藥用載體)700g_制成400粒組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)85g牛蒡子苷元(活性成分)15g半合成脂肪酸酯(藥用載體)700g_制成400粒制備方法稱取活性成分過100目篩，另取半合成脂肪酸酯1700g加熱熔融，待溫度降至60'C以下時(shí)，將牛蒡子苷藥粉加入，實(shí)施例IO含速釋層的雙層緩釋片劑緩釋片芯配方組合物(a)牛蒡子苷(活性成分)羥丙基纖維素(粘合劑)乳糖(賦形劑)聚乙烯基吡咯垸酮(崩解劑)硬脂酸(抗粘劑)攪拌均勻，澆模制成1000粒即得<100.Og28.7g58.Og8.0g5.3g制成667片組合物(b)牛蒡子苷(活性成分)100.0g羥丙基纖維素(粘合劑)28.7g乳糖(賦形劑)58.0g聚乙烯基吡咯烷酮(崩解劑)8.0g硬脂酸(抗粘劑)_5.3g制成667片組合物(c)牛蒡子苷(活性成分)85.0g牛蒡子苷元(活性成分)15.0g羥丙基纖維素(粘合劑)28.7g乳糖(賦形劑)58.0g聚乙烯基吡咯烷酮(崩解劑)8.0g硬脂酸(抗粘劑)5.3g包衣液處方:制成667片羥丙基纖維素(粘合劑)86g聚乙二醇-400(增溶劑)3ml聚山梨酯80(乳化劑)2ml鈦白粉(著色劑)3g檸檬黃(著色劑)6mg60%乙醇3200ml制成3200ml制備方法:1、預(yù)處理將活性成份過7號篩。輔料羥丙基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮、硬脂酸分別過7號篩。2、煙酸片芯顆粒制備稱取處方量的活性成份、聚乙烯基吡咯垸酮和31%處方量的羥丙基纖維素，混合均勻，作為混合粉，用水制粒。濕粒置6(TC通風(fēng)干燥，干顆粒經(jīng)2號篩整粒后，加入處方量的硬脂酸和剩余量的羥丙基纖維素，混勻。測顆粒含藥量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)片重。3、壓片13mm淺凹沖壓片，片劑硬度控制在56千克力(kgf)。4、包衣液的配制稱取處方量的羥丙甲基纖維素、聚乙二醇-400和吐溫-80,溶于處方量的60%乙醇中，并用此液研磨處方量的鈦白粉，取上清液即得空白包衣液。5、包衣取片芯稱重，放入包衣鍋內(nèi)，溫度控制在40士2'C，進(jìn)行預(yù)包幾分鐘，將己過7號篩的牛蒡子苷分散到包衣液中，連續(xù)噴入包衣液，至片劑增重15%。實(shí)施例11牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對糖尿病性心血管的作用(一)實(shí)驗(yàn)方法1.實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級Wistar大鼠4只，體重150180g;試驗(yàn)藥物牛蒡子苷、牛蒡子苷元，純度均要求大于90.0%，實(shí)測值牛蒡子苷94.2X(HPLC法)，牛蒡子苷95.2X(HPLC法)，牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物(質(zhì)量比1:1)。2.大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定2.1大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)(rataorticendothelialcells,RAECs)處死大鼠，無菌條件下取其胸腹主動(dòng)脈,清除血管外膜及脂肪組織，將血管縱向剖開，用0.01PBS漂洗干凈，用眼科剪剪成約1.5mmxl.5mm大小的組織塊，放入培養(yǎng)瓶中，放入37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中貼壁4h后加入含20。/。FBS(小牛血清)、1OOug/mlECGS(endothelialcellgrowthsupplement,內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑)、100ug/ml肝素及雙抗(100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。3天后去除組織塊并換液后繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3天更換培養(yǎng)液1次。取25代用于試驗(yàn)。差速消化法純化內(nèi)皮細(xì)胞及其傳代培養(yǎng)吸棄培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次，加入0.1%的胰蛋白酶12ml，置相差顯微鏡下觀察，13min即可見大部分RAECs收縮變圓而雜細(xì)胞仍然貼壁，此刻立即加入小牛血清終止消化，用吸管輕輕吹散細(xì)胞，吸出離心后，置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。2.2RAECs的鑒定(1)RAECs的生長特性觀察:分別在培養(yǎng)l天、2天、3天及7天時(shí)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。(2)細(xì)胞免疫熒光染色細(xì)胞免疫熒光染色檢查Vfll因子相關(guān)抗原來鑒定大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。3.采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazoletetrazoliumm,MTT)法檢測牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對RAECs增殖能力的影響取生長良好的細(xì)胞，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化吹打分散細(xì)胞后，再加入10X的新生小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl()S個(gè)/ml。按200pl/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，6h后各孔內(nèi)加牛蒡子苷使其終濃度分別為10ng.mr1、100ng.mr1、l嗎.mr1、10嗎.mr1、100嗎.mr1、lmg.mr1、5mg.ml"及10mg.mr1，同時(shí)設(shè)立空白對照組，每組設(shè)6復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入MTT(5mg'ml—1)2(^1，培養(yǎng)結(jié)束后傾去培養(yǎng)上清液，加入二甲基亞砜150mJ，振蕩至完全熔解后，將96孔板放入酶標(biāo)儀，在490nm處測定光密度(opticaldensity,OD)值。牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物加藥劑量和實(shí)驗(yàn)方法同牛蒡子苷。4.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs活性的影響方法同前3。各孔內(nèi)加葡萄糖使其終濃度30mmo1同時(shí)加入牛蒡子苷，其終濃度同上，同時(shí)設(shè)立正常對照(不加葡萄糖及牛蒡子苷)及空白對照組(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，每組設(shè)6復(fù)孔。牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物加藥劑量和實(shí)驗(yàn)方法同牛蒡子苷。5.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對RAECs釋放乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)、丙二醛(maleicdialdehyde,MDA)禾口一氧化氮(nitrogenoxide,NO)的影響實(shí)驗(yàn)方法選用三種藥物濃度(l嗎'mr1、10嗎'mr1、100昭'ml")進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參照上述方法，按200nl/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和lml/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。24h后各孔內(nèi)加牛蒡子苷使其終濃度分別為l嗎'mr1、10嗎'mr1、100嗎'mr1，同時(shí)設(shè)立空白對照組，每組設(shè)6復(fù)孔，分別收集24孔細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中LDH、MDA和NO含牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物加藥劑量和實(shí)驗(yàn)方法同牛蒡子苷。6.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs釋放LDH、MDA和NO的影響方法同5。培養(yǎng)24h后各孔內(nèi)加葡萄糖使其終濃度30mmo11/1，同時(shí)加牛蒡子苷使(濃度同5)，同時(shí)設(shè)立正常對照組(不加葡萄糖及牛蒡子苷)高滲對照組(加甘露醇終濃度為30mmol丄")及模型對照組(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，每組設(shè)6復(fù)孔。牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物加藥劑量和實(shí)驗(yàn)方法同牛蒡子苷。7.牛蒡子苷、牛蒡子苷元和牛蒡子苷及牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響將細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后加葡萄糖使其終濃度30mmoH/1，同時(shí)加牛蒡子苷使其終濃度分別為l嗎'ml'1、10嗎'mr1、100嗎'mr1，同時(shí)設(shè)立正常對照組(不加葡萄糖及牛蒡子苷)高滲對照組(加甘露醇終濃度為30mmol丄")及空白對照組(加葡萄糖，不加牛蒡子苷)，待細(xì)胞達(dá)90%融合后，用0.25%胰酶消化收集、裂解細(xì)胞，用免疫沉淀法分離eNOS蛋白，并運(yùn)用蛋白考馬斯亮藍(lán)法定量;蛋白免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測eNOS表達(dá)水平。牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物加藥劑量和實(shí)驗(yàn)方法同牛蒡子苷。8.統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(^士SD)表示，采用SPSSIO.O專用統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)Ω鹘M數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以PO.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)對高糖條件下大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用1.大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(mtaorticendothelialcells,RAECs)的鑒定原代和傳代培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞體外生長情況及形態(tài)原代內(nèi)皮細(xì)胞23天即可由組織塊邊緣爬出并逐漸向外延伸，呈扁平短梭形或多角形，約7一10天融合成層，呈鵝卵石樣排列；傳代細(xì)胞12h后，可見細(xì)胞生長增殖，呈小簇狀生長，24h后，細(xì)胞生長形成細(xì)胞群。細(xì)胞團(tuán)塊中間較密,呈魚貫狀相連或旋窩狀排列,周邊細(xì)胞多為長梭形并游離向外生長。7天后各細(xì)胞群相互融合成層，細(xì)胞成鵝卵石樣排列。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果vwF抗原免疫熒光染色呈陽性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)vwF抗原。2.對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響表l(a)不同濃度牛蒡子苷對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響(；土SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表l(b)不同濃度牛蒡子苷元對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響(；土SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表i(c)不同濃度的牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物對內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響(；土SD,=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注與正常對照組比較*P<0.05，**p<0.01結(jié)果表明在10ng'ml"100昭Tnl"之間，各給藥組呈劑量依賴性地增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力，空白對照組490nm吸光光度值為0.48士0.06，各給藥組組有增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的趨勢，與對照組相比有顯著性差異(11=6，p〈a^)，而l嗎'mr1、10吸mr1、100附ml"的各給藥組能顯著增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，與對照組相比有極顯著性差異(n-6，p<aW);lmg'mr1、5mg'ml"及10mg'ml"組，與對照組相比盡管仍能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，但與ioo嗎.mr1的濃度相比其作用有逐漸減弱的趨勢。3.對高糖條件下RAECs增殖能力的影響表2(a)不同濃度牛蒡子苷對高糖條件下RAECs增殖能力的影響(x土SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注與正常對照組相比，*p<0.05，,<0.01;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<<表2(b)不同濃度牛蒡子苷元對高糖條件下RAECs增殖能力的影響(；±SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<0.01;表2(c)不同濃度的牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs增殖能力的影響(；±SD,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>高糖對照組(含GS:30mmol)10ngml—'+30mmolGSlOOngmr'+30mmolGSlugml—'+30畫lGS10ygml—'+30,lGS100ugmr+30,lGSlmgmr'+30咖olGS5mgml—'+30咖olGS10mgml—'+30,lGS高滲對照組(甘露醇30咖o1)注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01;與高糖對照組相比，Ap<0.05,AAp<0.01;結(jié)果表明與正常對照組相比，高糖能顯著降低細(xì)胞增殖能力(n二6，/7<0.0/)，高滲甘露醇(30mmol'L")溶液對細(xì)胞增殖能力無影響(n二6，p〉a05)。l嗎'mr1、10吸mr1、100嗎'ml"的牛蒡子各組呈劑量依賴性地增強(qiáng)高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，與高糖對照組相比有顯著性差異^<^.0";10ng，ml"及l(fā)OOngTnr1的牛蒡子各組對高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力無影響，與空白對照組相比無顯著性差異(^〉0.0";lmg'mr1、5mg'ml"及10mg.mr1的牛蒡子各組作用于內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)與空白對照組相比盡管仍能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力(^<0.05入但與ioo嗎'mr1的濃度相比其作用呈逐漸減弱趨勢。4.對高糖條件下RAECs細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)、丙二醛(maleicdialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitrogenoxide，NO)禾口內(nèi)皮素(endothelium,ET)的影響表3(a)牛蒡子苷對髙糖條件下RAECs細(xì)胞釋放MDA、N0、LDH和ET的影響(；±SD,n==6)組別MDA(nmol/L)NO(nmol/L)LDH(U/L)ET(pg/ml)~58.5±2.16~~54.02±9.71139.0士17.65'71.42±6.55*117.1±19.30A65.44±8.94A89.1±7.65A60.61±12.69A69.7±8.75A58.26士5.54厶010ngml_llOOngml—1lug*ml—1lOugml—1訓(xùn)ugml—'lmgmF'5mgml-110mgml—100.19±0.08**0.22土0.04**0.17±0.02**0.24±0.05**厶0.35±0.06**"0.42±0.05**"0.34±0.03**厶'0,28±0.03**"0.31±0.0.03**'0.51±0.12正常對照高糖對照(含GS:30mmol)30腿olGS30mmolGS100lag.ml"十30mmolGS4.5±0.813.5±0.7**9.6士0.5厶6.5±0.5A7.42±0.64.46±0.5*4.92±0.6A5.78士0.7厶6.22士0.4厶高滲對照4.3±0.3#7.65±0.8#57.8±2.54#53.62±6.88#注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01，#p>0.05;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<0.01表3(b)牛蒡子苷元對高糖條件下RAECs細(xì)胞釋放MDA、NO、LDH和ET的影響(5±SD,n=6)組別MDA(umol/L)N0(umol/L)LDH(U/L)ET(pg/ml)54.02±9.71~71.39±6.68*63.42±4.51A67.02±4.03A55.81±4.71A53.59±6.88*注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01，ttp〉0.05;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<0.01表3(c)牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs細(xì)胞釋放MDA、N0、LDH和ET的影響±SD,n_^_組別MDA(iimol/L)N0(umol/L)LDH(U/L)ET(pg/ml)54.02±9.71"~71.39±6.68*69.19±5.37A58.98±4.71A61.69±4.96A53.59±6.88*注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01，#p>0.05;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<0.01試驗(yàn)結(jié)果與正常對照組相比，高糖對照組MDA的含量顯著增加(^^O.W力高滲對照與正常對照組相比，MDA釋放量無顯著差異(^〉a("。與空白對照組相比，ljig'ml"、10嗎'ml"及100嗎'ml"的牛蒡子各組均能顯著減少高糖誘導(dǎo)的MDA釋放，呈劑量依賴性。33正常對照高糖對照(含GS:30mmol)1ygml—'+30畫1GS10ng*ml—l+30腸1GSlOOugmr'+30畫1GS高滲對照4.5±0.813.7±0.7**11.6±0.4'9.8±0.5厶7.0±0.3A4.5±0.5*7.42±0.64.43±0.9*4.81±0.2厶5.81±0.5厶5.99±0.3A7.75±0.7*58.5±2.16140.0±17.65*122.29±10.05A86.54±4.39'73.84±5.20'58.0±2.44s正常對照高糖對照(含GS:30腿o1)1lig*mr1+30腸1GS10ygm廣十30畫1GSlOOugml-1+30腸1GS高滲對照4.5±0.813.7±0.7**11.1±0.7'9.7±0.1'6.3±0.6'4.5±0.5*7.42±0.64.43±0.9*5.20±0.3^6.01±0.8'6.54±0.7'7.75±0.7"58.5±2.16140.0土17.65*127.06土13.01厶92.27±6.7568.67±7.25'58.0±2.44*與正常對照組相比，高滲對照組NO的含量無顯著性差異(^^.05,而高糖對照組NO的含量顯著降低(^<0.0"。l嗎'mr1、10嗎'ml"及100嗎'ml"濃度的牛蒡子各組能顯著增加高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的能力，與高糖對照組相比有顯著性差異^<^.05人呈劑量依賴性。與正常對照組相比，高糖對照組LDH的含量顯著增加^^O.0》；高滲對照與正常對照組相比，LDH釋放量無顯著差異(^〈O.0"。與高糖對照組相比，l昭，mr1、lO嗎'mr1及100吸mr1的牛蒡子各組均能顯著減少高糖誘導(dǎo)的LDH釋放，呈劑量依賴性。與正常對照組相比，高糖對照組ET的含量顯著增加(^^aO";高滲對照與正常對照組相比，ET釋放量無顯著差異^〈a05入與空白對照組相比，l嗎'ml"、10吸mr1及100嗎'mr1的牛蒡子各組均能顯著減少高糖誘導(dǎo)的ET釋放，呈劑量依賴性。5.對高糖條件下RAECs表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響表4牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷和牛蒡子苷元混合物對高糖條件下RAECs表達(dá)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響分組(n-3)eN0S含量(e5ng)(;土SD)正常對照2.06±0.03高糖對照組(含GS:30咖o1)1.05±0.01*牛蒡子苷10ug'm1—1+30mmolGS1.18±0.06厶牛蒡子苷元10ug'ml—i+30mmolGS1.56±0.04厶混合物+30mmolGS1.76±0.04A高滲對照2.05±0.02#注與正常對照組相比，*p<0.05，**p<0.01，#p>0.05;與高糖對照組相比，Ap<0.05，AAp<0.01電泳圖見說明書附l，其中M為marker,1為正常對照組，2為高糖對照組，3為牛蒡子苷10嗎'mr1，4為牛蒡子苷元組10吸mr1，5為混和物組(牛蒡子苷元5吸ml"+牛蒡子苷5嗎'mr1)，6為高滲對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常對照組相比，高滲對照組eNOS的表達(dá)無顯著性差異(^〉a05)，而高糖對照組eNOS的表達(dá)顯著降低(^〈ft0";牛蒡子苷組、牛蒡子苷元組1及其混和物組能增加高糖條件下內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)，與高糖對照組相比有顯著性差異(^<0.05入實(shí)施例13牛蒡子苷和牛蒡子苷元的急性毒性試驗(yàn)將本發(fā)明所述的牛蒡子苷和牛蒡子苷元用于進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)，，得牛蒡子苷的小鼠的口服半數(shù)致死量LD5o為139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半數(shù)致死量LD5。為64.6g/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前述試驗(yàn)有效劑量，表明該牛蒡子提取物毒副作用小，在開發(fā)制備臨床用藥方面前景廣闊。一、試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，SPF級，6-8周齡，18—22g。飼養(yǎng)于全封閉動(dòng)物房內(nèi)，溫度20—22"C，相對濕度50_60%，光照12小時(shí)暗，12小時(shí)明，中央空調(diào)集中通風(fēng)8—15次/小時(shí)。自由攝食和飲水，每日更換飲用水一次。適應(yīng)性詞養(yǎng)觀察2天后，禁食不禁水過夜，次日稱重、編號。二、實(shí)驗(yàn)方案1.動(dòng)物分組將給藥組分為5個(gè)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。2.給藥劑量以"不等濃度等容積"的原則給藥，牛蒡苷和牛蒡苷元用0.5%羧甲基纖維素鈉配成供灌胃用的混懸液，各組小鼠按等比級數(shù)1:0.5分別灌胃給予受試藥物。以后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天動(dòng)物的毛色、自發(fā)活動(dòng)、飲食、體重等，記錄死亡癥狀和時(shí)間，7天后處死動(dòng)物，解剖觀察小鼠各組織、臟器有無異常變化。將本發(fā)明所述的牛蒡子提取物用于進(jìn)行小鼠的急性毒性試驗(yàn)，得牛蒡子苷的小鼠的口服半數(shù)致死量LD5o為139.8g/kg，得牛蒡子苷元的小鼠的口服半數(shù)致死量LD5。為64.6g/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前述試驗(yàn)有效劑量，表明該牛蒡子提取物毒副作用小，在開發(fā)制備臨床用藥方面前景廣闊。表5牛蒡子苷的小鼠死亡率劑量(g/kg)雄性雌性總死亡率401.445/55/5100%200.723/54/570%100.361/51/520%50.181/5Ji^_10%25.090/50/50%注表內(nèi)為"死亡數(shù)/動(dòng)物數(shù)"。表6牛蒡子苷對雄性小鼠體重的影響(X土s，g)劑量(g/kg)第1天第7天401.4418.2±0.74(5)200.7221.5±1.01(5)33.2±1.27(2)100.3617.2±0.82(5)32.7±1.08(4)50.1817.8±1.27(5)31.9±0.85(4)25.0921.7±1.55(5)30.9±1.27(5)注"()"內(nèi)為動(dòng)物數(shù)，下同。表7牛蒡子苷對雌性小鼠體重的影響(X土s，g)劑量(g/kg)第l天第7天401.4419.l土O.73(5)200.7218.8±0.29(5)28.1±0.99(1)100.3620.3±1.26(5)29，6±1.65(4)50.1819.9±0.84(5)30.1±1.31(5)25.0920.7±1.04(5)29.5±0.87(5)表8牛蒡子苷元的小鼠死亡率劑量(g/kg)雄性雌性總死亡率240.485/55/5100%120.243/54/570%60.121/51/520%30.061/50/5腦15.030/50/50%表9牛蒡子苷元對雄性小鼠體重的影響(X土s，g)劑量(g/kg)第l天第7天240.4817,5±0.74(5)120.2419.4±1.15(5)32.6±1.32(2)60.1218.5±0.095(5)31.8±1.24(4)30.0618.1±1.17(5)31.7±0.98(4)15.0321.4±0.86(5)30.7±1.32(5)表10牛蒡子苷元對雌性小鼠體重的影響(X土s，g)劑量(g/kg)第l天第7天19.5±0.91(5)18.4±0.59(5)27.8±1.15(1)19.8±1.16(5)28.5±1.55(4)20.2±0.78(5)30.7±0.71(5)20.6±1.14(5)29.6±0.77(5)結(jié)論牛蒡子苷的小鼠口服LD5o為139.8g/kg，LDso的95^可信限為99.8195.9g/kg。牛蒡子苷元小鼠口服LD5o為64.6g/kg,1^50的95%可信限44.693.7g/kg。牛蒡子苷和牛蒡子苷元的小鼠LD5。遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其有效劑量，表明其毒副作用小，在開發(fā)制備臨床用藥方面前景廣闊。實(shí)施例14臨床試驗(yàn)研究病例將80例糖尿病并高血壓患者隨機(jī)分為治療組(Aa組，Ab組，Ac組，各組『40)和對照組(B組，"=40)。A組治療前平均血壓(162士12)/(102士13)mmHg，平均空腹血糖為105士2.7mmol/L。B組治療前平均血壓為(171士11)/(105士14)mmHg，平均空腹血糖9.7士2.8mmo1/L。糖尿病的診斷采用國際糖尿病聯(lián)盟西太區(qū)委員會(IDFWPF)1999年公布的診斷標(biāo)準(zhǔn)；高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用世界衛(wèi)生組織(WHO)1999年新標(biāo)準(zhǔn)，舒張壓》100mmHg(g卩2，3級高血壓)者作為人選對象。治療方法各組均予糖尿病飲食，各組均予基礎(chǔ)治療試驗(yàn)期間受試者根據(jù)適合個(gè)體需要的最佳用藥原則，各組均同時(shí)口服二甲雙胍以控制血糖，使受試者血糖達(dá)到控制標(biāo)準(zhǔn)或保持穩(wěn)定的水平。在此基礎(chǔ)上，Aa組加服牛蒡子苷膠囊(100mg/粒,實(shí)施例5a樣品)，Ab組加服牛蒡子苷元膠囊(100mg/粒實(shí)施例5b樣品)，Ac組加服牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物膠囊(100mg/粒,實(shí)施例5c樣品)，每次2粒(每粒0.1g)，l天3次。(一)觀察內(nèi)容1、實(shí)驗(yàn)室檢査初查和3月療程結(jié)束后都進(jìn)行系統(tǒng)的三大常規(guī)、空腹血糖(FBS)、餐后血糖(PBS)、血脂、肝腎功能、血內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢查、一氧化氮含量及血液流變學(xué)參數(shù)檢測，服藥1個(gè)月，和2個(gè)月則只查FBS。2、測定血壓降壓療效評定標(biāo)準(zhǔn)收縮壓或舒張壓下降^10mmHg并降至正?；蛳陆?0mmHg以上為顯效；下降雖未達(dá)到10mmHg，但降至正常或下降1019mmHg為有效；未達(dá)到上述水平者為無效。3、觀察副作用(二)臨床試驗(yàn)結(jié)果-1、各組治療前后空腹血糖(FBG)、餐后血糖(PBG)、糖化血紅蛋白(HbAlc)的結(jié)果見表ll、12。表ll(a)試驗(yàn)組(Aa)治療前后FBG、PBG、HbAlc比較&土5)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>注碌示p〈0.05表ll(b)試驗(yàn)組(Ab)治療前后FBG、PBG、HbAlc比較(冗土6)FBG(mmol/L)PBG(咖ol/L)HbAlc(%)治療前治療后tP11.88±1.496.89±0.8510.052.97X10-8*16.94±1.907,13±0.8613.392.69X10—"*9.88土0.546.54±0.7810.533.43X1(T5*注*表示？<0.05表ll(c)試驗(yàn)組(Ac)治療前后FBG、PBG、HbAlc比較(f土5)_FBG(,1/L)_PBG(畫ol/L)_HbAlc(%)治療前14.89±1.1114.50±1.8810.55±0.82治療后6.78±0.657.40±0.528.32±0.56t9.5112.4110.19p3.43X10—8*2.53X10—"*3.68X10—5*注*表示。<0.05表12對照組治療前后FBG、PBG、HbAlc比較(，士6)FBG(畫1/L)PBG(畫1/L)HbAlc(%)治療前12.25±2.1616.78±3.3210.43±1.93治療后8.07±1.849.35±1.7510.27±1.85t_1.050.474.87P0.56tt0.63#3.05X10—2*注*表示口<0.05，#表示p〉0.05結(jié)果顯示各組均具有一定的降血糖作用。2、各組治療前后血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的結(jié)果見表13。表13(a)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平變化比較VEGF(pg/ml)(文土S)一^^_治療前治療后_試驗(yàn)組Aa753.6±314.5357.2土153.3i^T^4.05X10—5*對照組B763.8±298.7_664.8±169.64.06_0.32tt注承表示p〈0.05，tt表示p〉0.05表13(b)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平變化比較VEGF(pg/ml)0±S)""""J^_治療前治療后—_試驗(yàn)組Ab681.5±168.8296.9±105.53.86X10—5*對照組B763.8±298.7_664.8±169.64.06_0.32tt注*表示口<0.05，#表示pX).05表13(c)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平變化比較VEGF(pg/ml)(S土S)^^_治療前治療后_試驗(yàn)組Ac717.2±274.4334.4±153.38.914.23X10—5*對照組B763.8±298.7_664.8±169.64.06_0.32tt注*表示口<0.05，tt表示pX).05結(jié)果顯示各試驗(yàn)組治療前后血管內(nèi)皮生長因子水平顯著下降。3、降壓療效評定結(jié)果見表14。表14(a)試驗(yàn)組與對照組降血壓療效情況總?cè)@效有效無效有效率一數(shù)例例例例(％)試驗(yàn)組Aa4081312685對照組B400463025.0注碌示p〈0.05表14(b)試驗(yàn)組與對照組降血壓療效情況總?cè)@效有效I數(shù)例例例例試驗(yàn)組Ab40713127對照組B4004630注-碌示p〈0.05表14(c)試驗(yàn)組與對照組降血壓療效情況總?cè)@效有效數(shù)例例例例試驗(yàn)組Ac40714126對照組B4004630注*表示口<0.05結(jié)果顯示-各治療組均有一定的降血壓作用。4、一氧化氮含量結(jié)果見表15Z-0.60P5.98X10、有效率7p82'56.24X25.0—0.5610-9*有效率7p(%)855.98X25.0—0.6010-9*表15(a)治療前后一氧化氮比較組別一氧化氮(，土S)試驗(yàn)組Aa對照組B40治療前治療后89.76±17.24*47.61±9.23***40治療前治療后93.75±18.67**86.81土16.56*"注組內(nèi)治療前后比較，療前比較，*P>0.05。P<0.01，**P<0.05;組間治療后比較，"*P<0.01，組間治表15(b)治療前后一氧化氮比較組別一氧化氮(X土S)試驗(yàn)組Ab對照組B40治療前治療后96.33±7.71*48.10±6.9140治療前治療后93.75±18.67**86.81±16.56*"注組內(nèi)治療前后比較，療前比較，*P〉0.05。P<0.01，*<0.05;組間治療后比較，",<0.01，組間治表15(c)治療前后一氧化氮比較組別n一氧化氮(s士s)試驗(yàn)組Ac40治療前治療后96.25±9.72*53.82±6.64*"對照組B40治療前治療后93.75±18.67**86.81±16.56***注組內(nèi)治療前后比較，***P<0.01，**P<0.05;組間治療后比較，***P<0.01，組間治療前比較，*P>0.05。結(jié)果顯示各治療組均能有效抑制一氧化氮含量下降。5、全血高切粘度(TlHb)、全血低切粘度(llLb)、血漿粘度(TlP)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(EAI)、纖維蛋白原(Fb)的結(jié)果見表16表16(a)治療前后血液流變學(xué)變化(文土6)<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>rip(mpa.s)2.87±0.211.84±0.18*EAI3.00±0.132.16±0.32*Fb(g/1)8.38±1.314.11±0.90*注*表示口<0.05結(jié)果顯示各治療組治療后患者全血高切粘度OlHb)、全血低切粘度(7lLb)、血漿粘度0lP)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)(EAI)、纖維蛋白原(Fb)比治療前有明顯減低(P0.05)。6、安全性比較各試驗(yàn)組及對照組服藥期間血尿常規(guī)、肝功能指標(biāo)(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶AST)和腎功能指標(biāo)(血尿素氮BUN、肌酐Cr)均未顯示異常。各試驗(yàn)組未見比對照組中有更重的副作用，也沒有出現(xiàn)與對照組不一樣副作用。以上各結(jié)果表明，牛蒡子苷、牛蒡子苷元、牛蒡子苷與牛蒡子苷元混合物均能安全有效控制糖病性心血管病變。權(quán)利要求1.一種治療和預(yù)防糖尿病性心血管病變的組合物，其特征在于，所述組合物含純度為90％以上、按重量份計(jì)的50-99的牛蒡子苷或1-50的牛蒡子苷元。2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述組合物，其特征在于，所述組合物中含100—20000重量份的藥用添加劑或藥用載體。3.權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于將所述組合物制備成片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑、栓劑或噴霧劑。4.一種如權(quán)利要求3的所述組合物，其特征在于所述組合物制得的片劑或丸劑含按重量份計(jì)的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50—99與牛蒡子苷元1一50的混合物；250—350重量份的從乳糖、淀粉、糊精和輕丙基纖維素中選出的至少一種，5—10重量份的從滑石粉和硬脂酸鎂中選出的中的一種，3—5重量份的包衣預(yù)混劑歐巴代OY-C-7000A。5.—種如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于所述組合物制得的含速釋層的雙層緩釋片劑或丸劑含按重量份計(jì)的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50—99和牛蒡子苷元1一50二者的混合物；80—150重量份的從乳糖、淀粉、羥丙基纖維素和聚乙烯基吡咯烷酮中選出的至少一種；5—10重量份的從滑石粉和硬脂酸鎂中選出的至少一種；70—100重量份的羥丙基纖維素，l一5重量份的聚乙二醇-400、l一5重量份的聚山梨酯-80，1—5重量份的從檸檬黃和鈦白粉中選出的至少一種。6.—種如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于所述組合物制得的膠囊劑含按重量份計(jì)的牛蒡子苷I一IOO或牛蒡子苷元I一IOO或牛蒡子苷50—99和牛蒡子苷元l一50二者的混合物，200—300重量份的從乳糖、淀粉、糊精和羥丙基纖維素中選出的至少一種，l一重量份的從滑石粉和硬脂酸鎂中選出的至少一種。7.—種制備上述任一權(quán)利要求的組合物的方法，所說方法包括(1)牛蒡子苷的制備①粗提牛蒡子粉碎后，置索氏提取器中，經(jīng)沸程60—9(TC石油醚回流脫脂2—4次，脫脂后取出晾干，用60%—80%的8倍量乙醇回流提取2—4次，每次0.5—2h，于6(TC—80'C下減壓濃縮，得深褐色浸膏；②大孔樹脂精制將深褐色浸膏加15—35%乙醇，超聲處理15—35分鐘，溶解，過濾，調(diào)至成濃度為5—7mg/mL的溶液，通過AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的l-2倍，流速控制為1.5—2.5BV/h，柱徑高比控制為L5，水洗3倍樹脂體積，水洗速度0.5—3BV/h;再換以4一6BV50M乙醇洗脫，醇洗速度1—3BV/h，收集洗液，濃縮干燥得牛蒡子苷粗品；③分離牛蒡子苷粗品用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷粗品的1-2倍，經(jīng)200-300目硅膠柱析層，硅膠柱體積為牛蒡子苷粗品的10-50倍，氯仿-甲醇95:1洗脫，薄層色譜跟蹤流出液，收集牛蒡子苷單點(diǎn)的流份，合并濃縮，得牛蒡子苷；(2)牛蒡子苷元制備①粗提牛蒡子藥材粉碎后，過80目篩，置索氏提取器中，經(jīng)沸程609(TC的油醚回流脫脂3次，晾干后用乙酸乙酯回流提取2—4次，每次1.5—2.5h，于70°C下減壓濃縮，得褐色浸膏；②精制褐色將浸膏用60目粗硅膠拌樣，粗硅膠體積為牛蒡子苷元粗品的1-2倍，水浴烘干，干法上樣，經(jīng)200—300目硅膠柱層析，氯仿-甲醇98:l洗脫，洗脫液濃縮合并得到牛蒡子苷元；(3)按牛蒡子苷、牛蒡子苷元、藥用添加劑和/或藥用載體的比例配置混合。8.—種如權(quán)利要求7的制備方法，其特征在于所說牛蒡子苷的精制為取牛蒡子苷醇提物，加15—303^乙醇，充分?jǐn)嚢?，超聲處?5—30分鐘，使其恰恰充分溶解，過濾調(diào)至成上樣藥液濃度為3—6.5mg/mL的溶液，使用AB-8型大孔吸附樹脂，大孔吸附樹脂體積為藥液體積的1-2倍，上樣流速控制為2BV/h，柱徑高比控制為1:5。水洗2—3倍樹脂體積，水洗速度l一2BV/h;再換以3.5一4.5BV50。/。乙醇洗脫，醇洗速度1—2BV/h，收集醇洗液，濃縮干燥得牛蒡子粗品。9.權(quán)利要求l一6的任一組合物所述的用于治療和預(yù)防制備糖尿病性心血管病變的用途，其特征在于，將所述的組合物與其他其它治療藥混合施用，所述的治療藥選自與牛蒡子苷相同活性的藥物、降糖藥、抗氧化劑、醛糖還原酶抑制齊U、內(nèi)皮生長因子抑制劑、抗血小板聚集藥或它們的混合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含純度為90％以上、按重量份計(jì)的50-99的牛蒡子苷或1-50的牛蒡子苷元的組合物及其制備方法，其作用是治療和預(yù)防糖尿病性心血管病變。本發(fā)明通過提純牛蒡子苷和牛蒡子苷元，經(jīng)藥理、毒理和臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明涉及的牛蒡子苷或牛蒡子苷元的組合物對于糖尿病性視網(wǎng)膜病變具有治療效果強(qiáng)，毒副作用小的特點(diǎn)。文檔編號A61P9/00GK101278940SQ20081009437公開日2008年10月8日申請日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者盧春來,周世文,周吉銀,懿應(yīng),蓉張,徐梓輝,茂邢,黃林清申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院