專利名稱：：紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防肺損傷藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從中藥紅花中提取制備的紅花黃色素的新用途，即在制備治療和/或預(yù)防肺損傷特別是急性肺損傷藥物的新用途，上述紅花黃色素組成的藥物組合物。技術(shù)背景肺損傷為常見的疾患，急性肺損傷嚴(yán)重影響著人類的健康。體內(nèi)過度的炎性反應(yīng)常引發(fā)急性肺損傷，其癥狀可見呼吸功能不全、肺毛細(xì)血管通透性增高、肺間質(zhì)水腫、肺順應(yīng)性下降、肺組織充血、肺血管周圍出血及肺泡蔞陷、肺泡上皮壞死、白細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象[龍村主編，體外循環(huán)學(xué)，北京，人民軍醫(yī)出版社，2004年2月第1版，140-148。]。在感染性疾病中，大量釋放的細(xì)菌毒素脂多糖這一致炎因子可引發(fā)炎癥反應(yīng)，造成急性肺損傷[郭振輝，洪新，毛寶齡，錢桂生，陳正堂，山莨菪堿對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織TNFa、TL-8表達的影響，第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，22(5):4]0-412]。多種炎癥介質(zhì)及脂多糖等可激活白細(xì)胞釋放趨化因子和炎癥介質(zhì)如TNFa、IL-ie、IL-6等，還可釋放髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶、明膠酶等，可引起內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞'的損傷。在急性肺損傷的炎癥反應(yīng)中，內(nèi)皮細(xì)胞表達的ICAM-1、ICAM-2、E-選擇素、VCAM-1和白細(xì)胞合成的L-選擇素、CDllb/CD18等黏附分子對介導(dǎo)白細(xì)胞的聚集、黏附起了重要作用。激活的內(nèi)皮細(xì)胞還可釋放IL-1P、IL-6、TNFa等炎癥因子，激活并吸引更多的白細(xì)胞游出到炎癥灶，進一步加劇了肺部的炎癥損傷[金咸瑢，急性呼吸衰竭的病理生理進展，內(nèi)科急危重癥雜志，2004，10(4):214-218;金慧銘，盧建，殷蓮華，細(xì)胞分子病理生理學(xué)，鄭州，鄭州大學(xué)出版社2002年5月第一版485-505。]。抑制炎癥反應(yīng)、緩解炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的相關(guān)損傷對于治療及預(yù)防急性肺損傷具重要意義。中藥紅花為菊科植物Carf力3MAti/"or2'iAL的干燥花，為一活血化瘀代表性藥物。紅花活血通經(jīng)，散瘀止痛，主要用治冠心病，腦血栓等多種血液循環(huán)障礙性疾病。臨床上紅,花多以水煎液入藥，紅花黃色素為紅花的主要水溶性組分，為多種査耳酮苷的混合物，研究結(jié)果表明，紅花黃色素為紅花活血化瘀的有效部位，具擴張血管、降血壓、抗凝等作用[王會玲，紅花黃色素的現(xiàn)代研究概述。中國中醫(yī)藥科技，1998，5(5):333-334]。羥基紅花黃色素A(HydroxysaffloryellowA，HSYA，分子結(jié)構(gòu)見附圖)為紅花黃色素中的主要有效成分[金鳴，高子淳，李金榮,臧寶霞，吳偉，大孔樹脂色譜法制備羥基紅花黃色素A及紅花黃色素，中草藥，2004，35(1):25-28]，該成分可抑制血小板激活[臧寶霞，金鳴，司南，張彥，吳偉，樸永哲，HSYA對血小板活化因子的拮抗作用。藥學(xué)學(xué)報，2002，37(9):696-699]，具多方面的藥理作用。近年來雖然關(guān)于紅花黃色素藥理作用的研究報道逐漸增多，但紅花黃色素緩解肺損傷特別是急性肺損傷的研究尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供紅花黃色素的一種新用途。本發(fā)明所述的紅花黃色素所含紅花主要有效成分羥基紅花黃色素A的含量按重量計為50-100%。'本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，紅花黃色素具有治療和/或預(yù)防肺損傷作用。本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，紅花黃色素具有治療和/或預(yù)防急性肺損傷作用。急性肺損傷的重要損傷作用為肺部的炎癥損傷，本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，紅花黃色素具有治療和/或預(yù)防急性肺損傷的作用，這種損傷的主要起因是由肺部缺血再灌注損傷、肺部栓塞、致炎因子作用于肺這三種因素中的一種或兩種或三種因素的作用所引起的急性肺損傷所致。本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防肺損傷特別是急性肺損傷的藥物組合物，其特征在于含有治療和/或預(yù)防肺損傷特別是急性肺損傷有效量的紅花黃色素和可藥用的載體，它可以制成膠囊、注射劑、片劑、栓劑或口服液等可使用的制劑，上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué),領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。以下三個實驗說明了紅花黃色素的新藥效。實驗一、紅花黃色素對油酸-脂多糖所致大鼠急性肺損傷的緩解作用1.實驗步驟本實驗所用紅花黃色素采用本發(fā)明實施例3中的大孔樹脂-凝膠柱層析法制備，HPLC面積歸一化法測定其HSYA含量為95%。以山莨菪堿(RA)為陽性對照藥[林建東，劉寧，山莨菪堿防治急性肺損傷及其機理探討，中國醫(yī)師雜志2000，2(11):653-655]。Wistar大鼠，$，230士20g，北京維通利華公司清潔級動物，大鼠隨機分為6組，即正常組、肺損傷組(ALI)、肺損傷+山莨菪堿組(ALI+RA)、肺損傷+紅花黃色素高劑量組(ALI+SYH)、肺損傷+紅花黃色素中劑量組(ALI+SYM)、肺損傷+紅花黃色素低劑量組(ALI+SYL)。肺損傷+紅花黃色組實驗方法20私烏拉坦/NS腹腔注射麻醉大鼠，腹腔注射相應(yīng)劑量的紅花黃色素/NS后半小時，油酸/0.4%牛血清白蛋白/NS混懸液按油酸0.2g.kg—'尾靜脈注射，4h后尾靜脈注射2mg.kg—1旨多糖/706代血漿，此模型中進入肺微血管中的油酸可造成栓塞，致炎因子脂多糖可加劇炎癥反應(yīng)造成急性肺損傷，注射脂多糖/706代血漿后2h腹主動脈取血lmL，以P/。肝素/NS0.lmL抗凝，立即測動脈血氧分壓及動脈血pH值并計算本組動物的酸中毒(血pH〈7.35)發(fā)生率；同時取另一份腹主動脈血2mL，以W肝素/NS0.lmL抗凝，1000g離心10min,制備血漿，-2(TC保存以備ELISA法測定血漿IL-1e和IL-6;取右肺下葉肺瘀血最嚴(yán)重處肺組織加入Trizo1Regent勻漿，-2(TC保存，一周內(nèi)提取RNA。肺損傷組于尾靜脈注射油酸混懸液前半個小時腹腔注射NS，其余操作同肺損傷+紅花黃色素組。JH常組分別以相同體積0.狄牛血清白蛋白/NS替代油酸/0.4y。牛血清白蛋白/NS混懸液尾靜脈注射、以相同體積706代血漿替代脂多糖/706代血漿尾靜脈注射、以相同體積NS替代紅花黃色素ZNS腹腔注射，其它處理均同肺損傷+紅花黃色,素組。山莨菪堿組以山莨菪堿/NS代替紅花黃色素/NS，其余處理同肺損傷+紅花黃色素組。2.肺濕重/干重比(W/D)、肺干重/體重比(D/B)及肺系數(shù)(LI)的測定打開胸腔取出整個肺臟，小心剔除肺外組織，稱全肺重，計算肺系數(shù)(LI-IOOX肺濕重/體重X100y。)。取左肺，用濾紙吸干表面血水稱重，然后將左肺標(biāo)本置80。C烘烤24h至恒重后精密稱定干重，計算肺濕重/干重比(W/D)、肺干重/體重比(D/B)和100X左肺干重/體重X100%。3.Trizol試劑一步法提取大鼠肺組織的RNA肺組織每5-10mg加入lmLTrizol試劑，制得勻漿置于1.5mL離心管內(nèi)，加入200|al氯仿'振蕩，4°C12000g離心15min，取上清液加入0.5mL異丙醇沉淀RNA，4°C12000g離心10min，75°/。乙醇洗一次沉淀，所得沉淀即為RNA，0.1%DEPC-H20溶解后測RNA樣品OD260/OD280值計算濃度；甲醛變性電泳觀察RNA片段的完整性。4.RT-PCR法檢測大鼠肺組織TNFa、ICAM-1,VCAM-lraRNA的表達量反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)10|liLRNA，70°C5min，冰浴加入OligodT1^1，dNTP10mMl|al，5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液4pl，M-MLV25U,加&0至20^1，39°C60min即得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR反應(yīng)分別選取TNFa或ICAM-1的特異引物，以18srRNA為內(nèi)對照進行半定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lpl,10XPCRbuffer2.5(_il，dNTP10mM2pl，primer25pmol,rTaq'1U,力口120至25|^1。首次循環(huán)先在95。C變性5min，經(jīng)95。C變性45sec，退火45sec，退火溫度分別為TNFa59°C、ICAM-155。C、18sr腿55。C，72。C延伸45sec，延伸加時72。C5min,共28個循環(huán)。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并以18srRNA為內(nèi)對照，用Scionimage成像系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描，用Totallabvl.11軟件分析TNFa及ICAM-l與18srRNA條帶的灰度比，并比較各組表達量的變化。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5.ELISA法檢測大鼠血漿IL-1P，IL-6的水平參照股D公司ELISA試劑盒說明書操作，將標(biāo)準(zhǔn)品及以試劑盒稀釋液制備的1/50000血漿稀釋樣本各100pl加入包被板孔中，24。C反應(yīng)20min后棄反應(yīng)液，洗滌液洗板三次，每孔加入100jalBiotinantiratIL-6工作液，混勻30sec，24。C溫育20min后洗滌液洗板三次，每孔加入IOOpi1XHRP工作液，混勻30sec,24。C溫育10min，洗漆液洗板三次，每孔加入100(ilTMB顯色液，輕輕混勻10sec，24。C溫育20min,每孔加入100plTMB終止液，混勻30sec，15min內(nèi)在450nm處讀0.D.值。用CurveExpertl.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的0.D.值在標(biāo)準(zhǔn)曲線匕査出對應(yīng)濃度。IL-ie檢測所用抗體為BiotinantiratIL-1e，其余操作同上。6.統(tǒng)計學(xué)方法以SPSS12.0進行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本量的比較采用單因素方差分析和兩兩比較q檢驗，計數(shù)資料用卡方檢驗，P〈0.05表示差異的顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義。。實驗一結(jié)果1.紅花黃色素對急性肺損傷大鼠動脈血氧分壓影響表1.紅花黃色素緩解大鼠急性肺損傷血Pa02飽和度下降的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>ALI+SYL3301685.7±19.2ALI+SYM5001693.6±22.9*'ALI+SYH7501795.3±15.3"ALI+RA301888.7±16.與正常組比較AAP〈0.01;與ALI組比較求P〈0.05,林P<0.01表1結(jié)果可見，ALI組動脈血氧分壓較空白組明顯降低(P<0.01)，而紅花黃色素處理組和RA處理組則較ALI組動脈血氧分壓明顯升高，其中紅花黃色素750mg.kg—'組(P<0.01)、紅花黃色素500mg.kg—1處理組(P<0.01)和RA處理組(P<0.05)與ALI組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。2.紅花黃色素對急性肺損傷大鼠酸中毒發(fā)生率的影響表2.紅花黃色素抑制急性肺損傷所致的酸中毒的作用分組藥物劑量(mg.kg—1)~~^n'酸中毒發(fā)生率(％)正常對照——1915.3ALI——17956.3AAALI+SYL33016422.2*ALI+SYM50016743.8ALI+SYH75017635.3ALI+RA3018527.8與正常組比較AAP〈0.01;與ALI組比較+P〈0.05,科P<0.01。n'為該組中發(fā)生酸中毒大鼠的例數(shù)。表2結(jié)果表明，損傷組大鼠酸中毒比率較正常組明顯增加(P<0.01)，紅花黃色素330mg.kg—'組酸中毒比率較損傷組明顯下降(P〈0.05)，紅花黃色素750mg.kg-'組、紅花黃色素500mg.kg—1組和山莨菪堿組酸中毒發(fā)生率較損傷組有下降趨勢。3.紅花黃色素對急性肺損傷大鼠肺系數(shù)、肺濕/干重比、100X左肺干重/體重的影響表3.紅花黃色素緩解ALI大鼠肺系數(shù)(LI)、肺濕/干重比(W/D)、100X左肺干重/體重變化的作用_~~分組藥物劑量~~^H^75100X左肺手重/體重<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與正常組比較AAP〈0.01;與ALI組比較補<0.05由表3.結(jié)果可見，ALI組肺系數(shù)較空白組明顯升高(P<0.01),而紅花黃色素處理組和RA處理組與ALI組相比均可有效降低肺系數(shù)，且其差異的顯著性均具有統(tǒng)計學(xué)意義。表3結(jié)果表明ALI組、紅花黃色素500mg.kg—'處理組、紅花黃色素330mg.kg—1處理組和山莨菪堿處理組的肺濕/干重比均較空白組明顯增加(P〈0.05),紅花黃色素處理組和山莨菪堿處理組肺濕/干重比均較ALI組明顯降低，均有統(tǒng)計學(xué)意義，且紅花黃色素組的藥效隨劑量增加呈增強趨勢。表3結(jié)果表明，ALI組和給藥組的100X左肺干重/體重均較空白組明顯增加(P<0.01)。紅花黃色素處理組和山莨菪堿處理組的LI和W/D均較ALI組明顯降低；紅花黃色素330mg.kg—1組(P<0.05)、紅花黃色素500mg.kg4處理組(P<0.05)和山茛菪堿處理組(P<0.01)的100X左肺干重/體重與ALI組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。4.紅花黃色素對急性肺損傷大鼠肺組織TNFamRNA及ICAM-1mRNA表達量的影響表4紅花黃色素對急性肺損傷大鼠肺組織TNFa和ICAM-lmRNA表達升高的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與正常組比較AAP〈0.01;與ALI組比較樸<0.05,**P<0.01由表4結(jié)果可見，肺損傷組TNFa和ICAM-1mRNA表達量均較正常組明顯增加(P<0.01)，山莨菪堿組、紅花黃色素750mg.kg—1處理組、紅花黃色素500mg.kg—'處理組和紅花黃色素330mg.kg—'處理組TNFa和ICAM-1mRNA表達量均較肺損傷組明顯下降(P均<0.01)。5.紅花黃色素對急性肺損傷大鼠血槳IL-1P、IL-6表達水平的影響表5.紅花黃色素抑制急性肺損傷大鼠血漿IL-15水平升高的作用分組~藥物劑量^iL-ie!T^<table>tableseeoriginaldocumentpage208</column></row><table>與正常組比較AAP〈0.01;與ALI組比較補<0.05由表5結(jié)果可見，ALI組血漿IL-1P蛋白濃度較正常組明顯升高(P<0.01)，給藥組血漿IL-1P蛋白濃度介于ALI組和正常組之間，與ALI組相比有降低的趨勢，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。ALI組血漿IL-6蛋白濃度較正常組明顯升高(P<0.01)，給藥組血漿IL-6蛋白濃度介于ALI組和正常組之間，與ALI組相比均有降低的趨勢，其中紅花黃色素750mg.kg—1組可顯著降低血漿IL-6蛋白濃度(P<0.05)。實驗二.紅花黃色素對油酸致大鼠急性肺損傷的保護作用1.實驗步驟本實驗所用紅花黃色素采用本發(fā)明實施例2中的大孔樹脂-凝膠柱層析法制備，HPLC面積歸一化法測定其羥基紅花黃色素A(HydroxysaffloryellowA，HSYA)含量為76。/。。清潔級Wistar雄性大鼠，體重210270g,購自維通利華實驗動物公司，適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按體重分層隨機分為6組，即正常對照組，急性肺損傷(ALI)組及四個給藥組紅花黃色素治療組(290mg'kg"、170mg.kg"、100mgkg")和陽性藥物對照組山莨菪堿30mgkg"組。急性肺損傷模型制備與給藥油酸-0.4%牛血清白蛋白混懸液的配制油酸精密稱重后按密度計算得體積，加入五倍體積的用生理鹽水配制的0.4°/。牛血清白蛋白，振蕩器劇烈振蕩混勻后立刻尾靜脈注射。急性肺損傷模型制作腹腔注射1.2g，kg"氨基甲酸乙酯麻醉大鼠，ALI組和四個給藥組分別按油酸0.13g"kg—'尾靜脈注射油酸-0.4Q/。牛血清白蛋白混懸液，油酸栓塞于肺部微血管可造成損傷。正常對照組以0.4°/。牛血清白蛋白代替油酸-0.4%牛血清白蛋白混懸液。給藥注射油酸前30min,四個給藥組腹腔注射各組藥物，ALI組和正常對照組腹腔注射生理鹽水。觀測指標(biāo)(l)肺系數(shù)(LI)及A指數(shù)、B指數(shù)的測定油酸尾靜脈注射5h后處死動物，取全肺稱重，計算肺系數(shù)(LP100X肺濕重/體重X10(W)。取右肺大葉稱量濕重(W)，置,8(TC烤箱24h至恒重，稱量干重(D)。A指數(shù)及B指數(shù)計算方法A指數(shù)-100XW/體重X100%，B指數(shù)-100XD/體重X100。/。。(2)血漿IL-ie及IL-6含量測定注射油酸5h后腹主動脈取血，1%肝素抗凝，950g離心10min取上清,分裝后-20'C凍存。樣品解凍后按Bio-lab公司ELISA試劑盒說明進行操作，用CurveExpertl.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的OD450值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)濃度。每批檢測時各組取相同樣品數(shù)。2.統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSSIO.O軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。P〈0.05表示差異的顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義。。實驗二結(jié)果1.紅花黃色素對肺系數(shù)(LI)、A指數(shù)、B指數(shù)的影響與正常對照組相比,ALI組LI、A指數(shù)、B指數(shù)均顯著升高(PO.Ol)。與ALI組相比，四個給藥組均能明顯降低油酸引起的LI、A指數(shù)、B指數(shù)增加(PO.01，P<0.05),其中紅花黃色素290mg'kg^組與ALI組相比，三個指數(shù)差異均非常顯著(PO.Ol)，紅花黃色素170mgkg—1組、紅花黃色素100mgkg—1組和山莨菪堿組與ALI組相比均有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，見表6。表6各組動物L(fēng)I、A指數(shù)、B指數(shù)的比較組另廿ii0A指數(shù)B指數(shù)(mg，kg')(%)(%)(%)正常…1641.3±1.914.2±0.62.99±0.15ALI—1856.8±4.5AA20.0土1.8厶^4.18±0.30AALI+SYL1001952.1±8.5'18.1士3.3'3.83士0.52"ALI+SYM1702052.2±5.8*18.1±2.廣3.88±0.44*ALI+SYH2901850.3±6.4**17.5±2.2**3.73±0.35**ALI+RA301852.1±6.4*18.0±1.93.81土0.39"注與正常組比較，AAP〈0.01;與ALI組比較，*P〈0.05,林P<0.012.紅花黃色素對血漿IL-1e、IL-6的影響與正常對照組相比，油酸組血漿IL-ie、IL-6蛋白水平顯著升高(P<0.05)。紅花黃色素三個劑量組和山莨菪堿組均能明顯降低油酸引起的血漿IL-ie蛋白水平的升高(P<0.01)，紅花黃色素三個劑量組和山茛菪堿組均能明顯降低油酸引起的血漿IL-6蛋白水平的升高，其中紅花黃色素290mg'kg"組、紅花黃色素100mg'kg"組與ALI組差異非常顯著(PO.01);紅花黃色素170mg'k^組、山莨菪堿組與ALI組相比有顯著性差異(P<0.05)，見表7。表7各組動物血漿IL-ie、IL-6含量的比較組別劑』nIL墨1PIL國6(mgkg')(ML—')(ML一1)正?！?2111±22250±46ALI—12143±52A302±64AALI+SYL10012100±22，''243±53"ALI+SYM17012104±17"'248±57'ALI+SYH29012106土3(T'224±52"AL工+RA3012105±28"'251±53'注與正常組比較，AP<0.05;與ALI組比較，*P<0.05,**P<0.01實驗三、紅花黃色素緩解豬體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的作用1.實驗步驟本實驗所用的紅花黃色素采用本發(fā)明實施例1中的大孔樹脂柱層析法制備，HPLC面積歸一化法測定其羥基紅花黃色素A(HydroxysaffloryellowA,HSYA)含量為68%。實驗動物為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)實驗用小型豬，雌雄不限，體重19-28公斤。本實驗體外循環(huán)過程屮由于肺臟停止供血，體外循環(huán)結(jié)束恢復(fù)肺部灌流后可造成缺血再灌注損傷。以如下步驟進行紅花黃色素緩解體外循環(huán)肺損傷實驗即紅花黃色素+體外循環(huán)組實驗。取小型豬，腹腔注射戊巴比妥鈉使麻醉，稱體重后，建立外周靜脈輸液通路，股動靜脈置管，氣管插管連接呼吸機輔助呼吸，股動脈置管，建立外周動脈血壓監(jiān)測裝置。靜脈注射1.5mL/kg紅花黃色素/NS。胸部正中切口，靜脈注射3mg/kg肝素全身抗凝，建立體外循環(huán)，上下腔靜脈分別插管，套阻斷帶，休外循環(huán)開始后阻斷上下腔靜脈，從右心房注入2mL/kg紅花黃色素/NS。給藥后10min阻斷升主動脈，灌注15-20niL/kg停跳液，心臟停跳40min后開放上下腔靜脈，做呼吸后2分鐘，抽取左、右心房血液，10min后開放升主動脈，20min后注入右心房1.5mL/kg紅花黃色素ZNS，IO分鐘后停止體外循環(huán)，體外循環(huán)結(jié)束后靜脈注射l:l魚精蛋白中和肝素，關(guān)胸，繼續(xù)輔助呼吸、觀察4h。術(shù)中觀察氣道壓、潮氣量、血壓及心率；魚精蛋白中和l小時后，再經(jīng)外周靜脈給予紅花黃色素/NS1.5mL/kg，于魚精蛋白中和后4小時處死動物，取左上葉,肺組織稱量濕重(W)，置8(TC烤箱24h至恒重，稱量干重(D)計算濕/干重比(W/D)。另外沿左肺下葉最長橫軸做水平切面，從該切面中瘀血最重處取組織置4%中性福爾馬林固定常規(guī)切片、HE染色后光鏡觀察，各動物的光鏡切片隨機選取5個視野照相，參照雷文章[雷文章，韋靖江，沈文律，金立人，實驗性胰腺炎多器官損害與內(nèi)毒素血癥的關(guān)系，中華實驗外科雜志，1995，12(3):131。]肺損傷評分方法以盲法對各照片進行評分，以每張切片五個視野評分的平均值作為該動物的得分。體外循環(huán)損傷組動物以NS代替紅花黃色素/NS溶液注射，其它操作均同體外循環(huán)+紅花黃色素組。陽性對照藥選用目前臨床常用的體外循環(huán)肺保護藥物烏司它丁(ULI)，體外循環(huán)+ULI組動物以ULI/NS溶液代替紅花黃色素/NS注射，其它操作均同體外循環(huán)+紅花黃色素組。假手術(shù)組動物同法麻醉，建立外周靜脈輸液通路，股動靜脈置管，氣管插管連接呼吸機輔助呼吸，建立外周動脈血壓監(jiān)測裝置，術(shù)中不阻斷升主動脈及上下腔靜脈，不進行體外循環(huán)，以NS代替紅花黃色素/NS溶液在與紅花黃色素組相同的給藥途徑分別在相應(yīng)的時間點注射。2.統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料采用SPSSIO.O軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗。等級資料以秩和檢驗法進行分析。P〈0.05表示差異的顯著性具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗三結(jié)果1.紅花黃色素緩解豬體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的作用表8.紅花黃色素緩解豬體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與假手術(shù)組比較，AP〈0.05;與體外循環(huán)組比較，*P<0.05表8結(jié)果表明，注射紅花黃色素的豬肺濕/干重比較體外循環(huán)損傷者有下降趨勢，肺組織光鏡切片HE染色后分析結(jié)果表明，紅花黃色素高劑量組病理變化評分明顯低于體外循環(huán)損傷組，低劑量組則與體外循環(huán)損傷組相當(dāng)，烏司它丁保護組的肺濕/干重比和光鏡病理評分均較體外循環(huán)組有改善的趨勢。從圖6可見，370mg.kg'紅花黃色素可緩解豬肺部損傷所見的充'血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤等損傷。實驗一至實驗三的結(jié)果均表明紅花黃色素可抑制肺部炎癥因子的表達，緩解實驗動物的急性肺損傷。這種損傷中，肺部炎癥反應(yīng)為其重要損傷機制，肺缺血再灌注、局部栓塞及致炎因子刺激為這些急性肺損傷的重要起因。附圖HSYA的分子結(jié)構(gòu)具體實施例方式以下實施例是為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明的實施方法，而不是為了限制本發(fā)明。實施例l大孔樹脂柱層析法制備粗品紅花黃色素實驗材料紅花生藥購自新疆維吾爾族自治區(qū)烏魯木齊藥材公司，產(chǎn)地為新疆維吾爾族自治區(qū)吉木薩爾縣。鑒定人北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系李家實教授，為菊科植物紅花^r"SMASf/Mtor^AL.的干燥花。95%衛(wèi)生酒精北京市遠弘藥用酒精有限責(zé)任公司生產(chǎn)；D-4020型非'極性大孔樹脂為天津南開大學(xué)化工廠產(chǎn)品；本發(fā)明的大孔樹脂柱層析實驗還可用其它型號的大孔樹脂如D-3520，X-5，NKA-9等。新購大孔樹脂用5%NaOH液浸泡2hr后，用水洗至中性，再用5%HC1浸泡2hr，水洗至中性，濕法裝柱，95%乙醇洗至流出液中加水無白色混濁，水沖洗至無醇味備用。HSYA對照品為發(fā)明人自制[臧寶霞，金鳴，司南，張彥，吳偉，樸永哲，HSYA對血小板活化因子的拮抗作用。藥學(xué)學(xué)報，2002,37(9):696-699]。乙腈為,Fisher公司HPLC級產(chǎn)品，甲醇為國產(chǎn)優(yōu)級純，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。設(shè)備島津LC-6A型高效液相色譜儀，色譜軟件為泰立化公司TL9000液相色譜工作站；XZR-A型20升旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，中科院生物物理所科龍儀器廠產(chǎn)品。紅花水提取液的制備紅花生藥20kg,加400L水，室溫浸泡并不時攪動，24hr后放出提取液，再加400L水同法冷浸24hr，棄藥渣，合并兩次水提液，離心過濾除去藥渣，8(TC減壓濃縮至1g生藥/mL，過濾即得紅花水提取液。大孔樹脂柱層析法制備粗品紅花黃色素取1g生藥/mL紅花水提液4000mL上直徑40厘米X高120厘米的D-4020型非極性大孔樹脂層析柱，蒸餾水洗至Molish反應(yīng)陰性后用20%乙醇洗脫，收集后續(xù)黃色流出液，此洗脫液6(TC減壓濃縮即得紅花黃色素粗品濃縮液。HPLC法分析紅花黃色素方法色譜柱為Inertsil0DS-35,4.6I.Dx250mm分析柱，日本Glscience公司產(chǎn)品，檢測波長403nm，流動相為甲醇一乙腈一水(20:10:70)含0.02%磷酸，pH2.6，流速lmL/rain。'HPLC法分析粗品紅花黃色素的結(jié)果大孔樹脂柱層析法制備所得的紅花黃色素粗品溶液稀釋后HPLC分析結(jié)果表明其HSYA純度為68%。實施例2大孔樹脂-凝膠柱層析法制備精品紅花黃色素本實驗所用的凝膠為S印hadexLH-20，為Pharamacia公司產(chǎn)品；本發(fā)明的凝膠柱層析實驗除可用S印hadexLH-20外，還可用S印hadexG-25或S印hadexG-50凝膠。取前述大孔樹脂層析法制得的紅花黃色素粗品濃縮液上直徑10厘米X高70厘米的凝膠層析柱，蒸餾水洗脫除去先流出的棕色雜質(zhì)，收集黃色洗脫液，6CTC減壓濃縮即得紅花黃色素精品。HPLC法分析精品紅花黃色素的結(jié)果大孔樹脂柱層析收集全部黃色流份后再經(jīng)凝膠柱層析法純化，所得的紅花黃色素精品溶'液稀釋后HPLC分析結(jié)果表明其HSYA純度為76%。實施例3大孔樹脂-凝膠柱層析法制備高純度精品紅花黃色素取1g生藥AnL紅花水提液4000mL上直徑40厘米X高120厘米的D-4020型非極性大孔樹脂層析柱，蒸餾水洗至Molish反應(yīng)陰性后用20%乙醇洗脫，為了得到純度較高的紅花黃色素，可在紅花水提液進行大孔樹脂柱層析時，以HPLC法分析每份流出液，將HSYA色譜峰面積80%以上的流出液合并后濃縮即得HSYA含量較高的紅花黃色素粗品濃縮液。此HSYA含量較高的紅花黃色素粗品濃縮液再上直徑10厘米X高70厘米的凝膠層析柱，蒸餾水洗脫,除去先流出的棕色雜質(zhì)，以HPLC技術(shù)檢測黃色洗脫液，收集HSYA色譜峰面積不低于95%的流出液合并即得高純度紅花黃色素洗脫液，6(TC減壓濃縮即得高純度精品紅花黃色素。此高純度紅花黃色素精品溶液稀釋后HPLC分析結(jié)果表明其HSYA純度為95%。以本發(fā)明實施例1-3制備的紅花黃色素按以下實施例方法可制得可使用的紅花黃色素藥物制劑。實施例4紅花黃色素口服硬膠囊劑紅花黃色素100克干淀粉100克上述組分混合后裝入iooo個硬膠囊，即得紅花黃色素口服硬膠囊劑實施例5紅花黃色素注射劑紅花黃色素50克注射用水適量全量1000毫升取50克紅花黃色素以適量注射用水溶解后加至1000毫升按常規(guī)方法經(jīng)灌裝，封口等步驟制得紅花黃色素注射劑.實施例6紅花黃色素栓劑紅花黃色素500克半合成脂肪酸甘油脂適量制成1000粒取半合成脂肪酸甘油脂加熱使融，適當(dāng)降溫后加入500克紅花黃色素混勻，制栓，冷卻即得紅花黃色素栓劑.實施例7紅花黃色素口服液紅花黃色素0.5克蒸餾水10毫升紅花黃色素溶解后按常規(guī)方法經(jīng)灌裝，封口等步驟生產(chǎn)即得紅花黃色素口服液.實施例8紅花黃色素片劑紅花總黃色素500克硬脂酸鎂5克淀粉20克制成1000片紅花黃色素，硬脂酸鎂與淀粉混勻后按常規(guī)方法經(jīng)壓片，包衣，裝瓶等工藝即得紅花黃'色素片劑.此外，在未違背本發(fā)明精神內(nèi)，可以對給定的實施例進行各種變化和改進。由本
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟練的技術(shù)人員認(rèn)識到的可選擇的實施例，它們也被包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防肺損傷藥物的應(yīng)用。2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于紅花黃色素所含的紅花主要有效成分羥基紅花黃色素A的含量按重量計為50-100%。3.權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防急性肺損傷藥物的應(yīng)用。4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防主要表現(xiàn)為肺部炎癥損傷的急性肺損傷藥物的應(yīng)用。5.權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防主要由肺部缺血再灌注損傷、肺部栓塞、致炎因子作用于肺這三種因素中的一種或兩種或三種因素的作用所引起的急性肺損傷的應(yīng)用。6.—種治療和/或預(yù)防肺損傷特別是急性肺損傷的藥物，其特征在于含有治療和/或預(yù)防肺損傷特別是急性肺損傷有效量的紅花黃色素和可藥用的載體。7.權(quán)利要求6的藥物，其特征在于可以制成膠囊、注射劑、片劑、栓劑或口服液等可使用的制劑。全文摘要本發(fā)明公開了從中藥紅花中提取制備的紅花黃色素在制備治療和/或預(yù)防肺損傷藥物的新用途，特別是在制備治療和/或預(yù)防肺缺血再灌注、肺部栓塞或致炎因子作用于肺引發(fā)炎癥反應(yīng)造成的急性肺損傷藥物的新用途，上述紅花黃色素制成的藥物及其制劑。文檔編號A61K31/351GK101327208SQ200810094399公開日2008年12月24日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者何美玲,鋒劉,偉吳,璟楊,王曉菲,靜童,臧寶霞,鳴金,龔慶成申請人:北京市心肺血管疾病研究所