專利名稱：蛻皮甾酮的一種新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛻皮甾酮(P-ecdysterone)的一種新用途。
背景技術(shù)：
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis簡(jiǎn)稱0P)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致 骨脆性和骨折危險(xiǎn)性增加為特征的一種系統(tǒng)性、全身性骨骼疾病，也是一種以骨密 度低下為主要癥狀的骨代謝失調(diào)的全身性疾病。骨質(zhì)疏松癥是中老年人的一種常見 病、多發(fā)病。隨著全球老齡化日益嚴(yán)重，國(guó)際醫(yī)學(xué)界已將骨質(zhì)疏松癥、糖尿病與心 血管病等并列為嚴(yán)重危害老年人健康的常見疾病。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是以骨量減 少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性和骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身性骨骼 疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織的一項(xiàng)調(diào)査顯示，在歐盟國(guó)家中，每30秒就有一個(gè)人遭受 骨質(zhì)疏松性骨折，骨質(zhì)疏松帶來的危害不容忽視。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)60至69歲的老年 婦女骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率高達(dá)50-70%，而70歲以上老年婦女骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率 幾乎是100%，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率呈明顯的上升趨勢(shì)
(Albright F. Postmenopausal osteoporosis. JAMA 1941,116:2465-2474. Consensus development conference: Prophylaxis and treatment of osteoporosis. Osteoporosis Int. 1991， 1:114-117, Heino TJ, Hentunen TA, Vaananen HK. et al. Osteocytes inhibit osteoclastic bone resorption through transforming growth factor-beta: Enhancement by estrogen. J Cell Biochem. 2002;85(l):185-97.)。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的病因尚不十分清楚，目前研究認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥與性激 素調(diào)控、營(yíng)養(yǎng)因素、運(yùn)動(dòng)因素、遺傳、職業(yè)和陽光照射等多種因素有關(guān)，是多種病 因、多個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，且與機(jī)體的衰老程度密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥的主要 癥狀為腰膝酸軟、骨骼疼痛、肢體麻木、乏力等，目前尚無能夠治愈骨質(zhì)疏松癥的 特效藥物。用于防治骨質(zhì)疏松癥的藥物目前主要有三類，第一類是抗骨吸收藥物， 包括雌激素、降鈣素和二磷酸鹽等；第二類是促進(jìn)骨形成藥物，如氟化物和促進(jìn)合 成代謝的類固醇等；第三類是礦化作用藥物，如鈣制劑和維生素D等(Riggs BL. The mechanisms of estrogen regulation of bone resorption. J Clin Invest 2000; 106(10): 1229-37.朱建民骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病原因及防治。中華內(nèi)科雜志1992; 11(31):714。)。雖然西藥在治療骨質(zhì)疏松癥上已取得了很大進(jìn)展，但由于存在副作用以及 治療費(fèi)用過高等因素限制了它的長(zhǎng)期使用。
中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，主骨生髓，骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、強(qiáng)壯和衰弱都與腎的盛 衰有關(guān)，如腎精虧虛則骨髓生化乏源、骨骼失養(yǎng)，導(dǎo)致骨痰?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，臨床 腎虛時(shí)下丘腦一垂體一性腺功能下降、性激素水平降低，這和現(xiàn)代骨質(zhì)疏松癥的發(fā) 病機(jī)理一致。中醫(yī)按"腎主骨"的理論治療骨瘓，多采取補(bǔ)腎療法，如補(bǔ)腎壯陽、 溫腎壯陽、滋腎填髓、補(bǔ)腎壯骨、健脾益氣和活血通絡(luò)等，常用藥物包括淫羊蕾、 肉從蓉、杜仲、冤絲籽和骨碎補(bǔ)等。中醫(yī)的特點(diǎn)在于辯證施治，整體調(diào)節(jié)，因此在 骨質(zhì)疏松癥的治療方面取得了不少獨(dú)特的成就。
雖然中藥治療骨質(zhì)疏松癥取得了滿意的效果，且毒副作用少、價(jià)格適中、可長(zhǎng) 期服用。但是，目前用于骨質(zhì)疏松癥治療的中藥也存在著明顯的缺點(diǎn)，如用藥量大、 有效成分不明確、難以進(jìn)行質(zhì)量控制以及無法運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論進(jìn)行解釋等問題。 因此運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)手段對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥的中藥進(jìn)行研究，尋找其中的有效成分并 深入研究其作用機(jī)理就顯得非常迫切和必要。
露水草是一種多年生草本藥用植物，具有補(bǔ)虛除濕、舒筋活絡(luò)之功效。
蛻皮甾酮(e-ecdysterone)是露水草中含量非常豐富的一種蛻皮激素，可以應(yīng) 用高速逆流色譜等技術(shù)從露水草中提取高純度的P-ecdysterone。已有實(shí)驗(yàn)證明，P -ecdysterone能夠有效促進(jìn)哺乳動(dòng)物中多種組織和器官的核酸與蛋白質(zhì)的合成及糖 代謝和脂類代謝過程,改善高血糖癥和高血脂癥；而且能調(diào)節(jié)免疫功能和中樞神經(jīng) 系統(tǒng)，改善和治療缺氧和缺血性腦損傷；還具有較高的抗氧化活性，能抗內(nèi)皮細(xì)胞損 傷、促進(jìn)表皮細(xì)胞分化、增強(qiáng)生命力(中國(guó)老年學(xué)學(xué)會(huì)骨質(zhì)疏松委員會(huì)骨質(zhì)疏松 診斷標(biāo)準(zhǔn)學(xué)科組。中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1999， 1:1221)。
骨組織中主要有兩種細(xì)胞，骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨形成，破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨吸收。正常情 況下，兩種細(xì)胞的作用強(qiáng)度相當(dāng)，所以骨組織處于動(dòng)態(tài)平衡中。 一旦這個(gè)平衡被打 破，就可能患骨質(zhì)疏松癥。骨細(xì)胞是由骨髓基質(zhì)干細(xì)胞或者成骨前體細(xì)胞分化而來， 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞有向成骨前體細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。有證據(jù)表明，隨著年齡 的增長(zhǎng)，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞向骨細(xì)胞分化的能力下降，向脂肪細(xì)胞分 化的趨勢(shì)加強(qiáng)，因此老年人的骨髓中常見大量脂肪組織?；谝陨显?，在尋找抗 骨質(zhì)疏松中藥的活性成分時(shí)，可以以促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞向骨細(xì)胞 分化、增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性為目標(biāo)，就可能篩選出有效的治療骨質(zhì)疏松的活性成分。西方學(xué)者研究植物雌激素主要局限于大豆異黃酮，目前，尚無e-ecdysterone 對(duì)骨代謝影響的基礎(chǔ)或臨床研究報(bào)道，也沒有從3 -ecdysterone雌激素樣作用出發(fā)研 究其應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供蛻皮甾酮(e-ecdysterone)的一種新用途。 本發(fā)明所提供的蛻皮甾酮(P-ecdysterone)的新用途具體為
1) 以蛻皮甾酮(e-ecdysterone)為活性成分的治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥
物；
2) 以蛻皮甾酮(e-ecdysterone)為活性成分的促進(jìn)骨分化的藥物；
3) 以蛻皮甾酮(e-ecdysterone)為活性成分的促進(jìn)骨愈合的藥物；
4) 蛻皮甾酮(e-ecdysterone)在制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)
用；
5) 蛻皮甾酮(P-ecdysterone)在制備促進(jìn)骨分化的藥物中的應(yīng)用；
6) 蛻皮甾酮(e-ecdysterone)在制備促進(jìn)骨愈合的藥物中的應(yīng)用。 上述l) 、 2)和3)的藥物可通過注射或口服的方法導(dǎo)入機(jī)體。 所述預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松癥藥物的用量一般為腹腔注射O. 1 mg/kg體
重；低劑量口服O. 5 mg/kg體重、高劑量口服l mg/kg體重。
為了闡明上述新用途的作用機(jī)理，本發(fā)明采用較先進(jìn)的分子、細(xì)胞模型手段， 同時(shí)以動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，分別在整體和細(xì)胞水平上研究e -ecdysterone對(duì)骨代 謝的保護(hù)作用，探討其可能的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P-ecdysterone分別與成骨細(xì) 胞株MC3T3-El和原代培養(yǎng)的小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，能明顯促進(jìn)以上兩種 細(xì)胞的骨分化，而且這一作用是通過ER介導(dǎo)的。以維甲酸灌胃建造小鼠骨質(zhì)疏松 癥模型，用腹腔注射和灌胃兩種方式進(jìn)行e -ecdysterone的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明， e -ecdysterone具有提高骨密度、增大股骨徑和增加骨組織中羥脯氨酸含量的作用， 而且未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。e -ecdysterone顯示了較高的預(yù)防和/或治療骨質(zhì)疏松 癥的活性。


圖1A為P -ecdysterone對(duì)小鼠原代MSC中ALP活性的影響
圖1B為e -ecdysterone對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T3-El中ALP活性的影響
圖2為RT-PCR檢測(cè)cbfal 、 type I collgen和0CN基因的表達(dá)情況圖3為P -ecdysterone提高ALP活性通過ER介導(dǎo) 圖4為各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化情況 圖5為6 -ecdysterone對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨密度的影響 圖6為6 -ecdysterone對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠股骨骨長(zhǎng)的影響 圖7為e -ecdysterone對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠羥脯氨酸含量的影響 圖8為0 -ecdysterone的分子結(jié)構(gòu)示意圖 圖9為0 -ecdysterone的結(jié)構(gòu)鑒定圖譜
具體實(shí)施例方式
P -ecdysterone購(gòu)自上海同田生化技術(shù)有限公司公司，HPLC 98%，純度在99% 以上，化學(xué)成分該產(chǎn)品主要含20-P-蛻皮甾酮。P-ecdysterone的分子結(jié)構(gòu)示意圖 如圖8所示，e -ecdysterone的結(jié)構(gòu)鑒定圖譜如圖9所示。
實(shí)施例1 、 0 -ecdysterone的體內(nèi)活性試驗(yàn)
一、 小鼠骨質(zhì)疏松模型的構(gòu)建
選取雄性、2月齡、SPF級(jí)、體重約40土5g的昆明種小鼠50只(廣東醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)(該中心經(jīng)廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所鑒定，可以對(duì)外出售SPF級(jí)的各 種小鼠)，隨機(jī)分成5組:分別為正常對(duì)照組、維甲酸模型組、灌胃低劑量e -ecdysterone組、灌胃高劑量6 -ecdysterone組和腹腔注射P -ecdysterone組，每組10 只。除正常對(duì)照組外，其余各組每天上午灌胃給予維甲酸(70rag/kg體重)一次，進(jìn) 行造模。造模一周后，其中3組分別以低劑量(O. 5mg/kg體重)灌胃、高劑量(lmg/kg 體重)灌胃和腹腔注射(0. lmg/kg體重)給予P-ecdysterone，每天一次，連續(xù)21天。 自造模開始對(duì)小鼠每周稱重l次，共稱重4周，小鼠體重生長(zhǎng)曲線如圖4所示。結(jié) 果表明，實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠的體重變化不明顯，而且不同組之間沒有明顯差異， 說明給藥沒有對(duì)小鼠的健康狀態(tài)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。
21d后斷頭處死小鼠，取血、離心后分離血清；同時(shí)取股骨，剔凈肌肉、軟骨 和結(jié)締組織。所有組織樣品迅速放入-8(TC冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 二、 e-ecdysterone對(duì)骨骼密度的影響
從各實(shí)驗(yàn)組中分別隨機(jī)選取一只小鼠，對(duì)其上半身骨骼進(jìn)行X光照相，根據(jù)光 密度觀察各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨密度的變化情況。各實(shí)驗(yàn)組小鼠骨密度的變化情況如圖5 所示。其中，左上為正常對(duì)照組、右上為腹腔注射e-ecdysterone組、左下為灌胃高 劑量e-ecdysterone組、中間為維甲酸模型組、右下為灌胃低劑量P-ecdysterone組。從圖中5可以看出，維甲酸模型組的骨密度比正常對(duì)M組明顯降低，說明維甲酸造 模成功；灌胃高劑量e-ecdysterone組、灌胃低劑量P-ecdysterone組和腹腔注射0 -ecdysterone組的骨密度比維甲酸模型組有所提高，與正常對(duì)照組相比，都較大程度 地恢復(fù)了骨密度。
三、 P-ecdysterone對(duì)骨徑、骨長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響
從各實(shí)驗(yàn)組中分別隨機(jī)選取5只小鼠，取其右側(cè)股骨，用游標(biāo)卡尺測(cè)量股骨長(zhǎng) 度及中部骨徑長(zhǎng)度。其中正常對(duì)照組的中部骨徑長(zhǎng)度為1.95士0.16mm，腹腔注射組 的中部骨徑長(zhǎng)度為1.81士0.12mm，灌胃高劑量組的中部骨徑長(zhǎng)度為1.70±0.06 mm， 維甲酸模型組的中部骨徑長(zhǎng)度為1.62±0.11 mm，灌胃低劑量組的中部骨徑長(zhǎng)度為 L64土0.07mm。結(jié)果表明，維甲酸模型組骨徑明顯變小，灌胃高劑量的P -ecdysterone顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，但腹腔注射P -ecdysterone或灌胃低劑量的P -ecdysterone效果不太明顯。股骨長(zhǎng)度的測(cè)量結(jié)果如圖6所示，其中正常對(duì)照組的 股骨長(zhǎng)度為19.66士0.26mm，腹腔注射組的股骨長(zhǎng)度為20.45±0.55 mm，灌胃高劑 量組的股骨長(zhǎng)度為20.07±0.46 mm，維甲酸模型組的股骨長(zhǎng)度為19.32±0.34 mm， 灌胃低劑量組的股骨長(zhǎng)度為19.80士0.64mm。結(jié)果表明，維甲酸模型組的股骨長(zhǎng)度 明顯不及正常對(duì)照組，而腹腔注射P-ecdysterone、灌胃低劑量的P-ecdysterone或 灌胃高劑量的3 -ecdysterone均明顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
四、 P -ecdysterone對(duì)骨組織中羥脯氨酸含量的影響
Type I collagen是骨組織中含量最豐富的基質(zhì)蛋白，對(duì)骨細(xì)胞的增殖、分化和 骨組織的發(fā)育起關(guān)鍵作用，Type I collagen中的脯氨酸在合成后必須進(jìn)行羥基化修 飾才能正確地行使生物學(xué)功能。在骨組織中，Type I collagen處于不斷地新陳代謝 過程中。因此羥脯氨酸不斷地被合成，又通過骨吸收被代謝掉，出現(xiàn)在尿液中。所 以測(cè)定骨組織中的羥脯氨酸含量是檢測(cè)骨組織代謝情況的重要指標(biāo)。
使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒，根據(jù)其說明書上的方法測(cè)定上述 各組小鼠骨中的羥脯氨酸含量。
P -ecdysterone對(duì)羥脯氨酸含量影響的結(jié)果如圖7所示。設(shè)定維甲酸模型組的羥 脯氨酸含量為100，其他各組的羥脯氨酸含量和它比較得出相對(duì)數(shù)值。結(jié)果表明， 維甲酸模型組羥脯氨酸含量顯著降低，腹腔注射e-ecdysterone、灌胃低劑量的3 -ecdysterone或灌胃高劑量的P -ecdysterone均明顯著逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。
實(shí)施例3、以成骨細(xì)胞株MC3T3-E1和小鼠原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSC)為模型，檢測(cè)P -ecdysterone促進(jìn)骨分化的活性
一、 P-ecdysterone增強(qiáng)堿性磷酸酶(ALP)的活性
將實(shí)施例1得到的P-ecdysterone溶于乙醇中，現(xiàn)用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋成 10—5-10—、(即4. 67*10—3g/L —4. 67*10—6g/L)后，加入到培養(yǎng)有成骨細(xì)胞株MC3T3-El (購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)或小鼠原代MSC (Xiang-hui LI,JIN-chao ZHANG,Sen-fang SUI,et al. Effect of daidzin,genistin, and glycitin on osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells and adipocytic transdifferentiation of osteoblasts .Acta Pharmacologca Sinica,2005，26(9): 1081-1086)白勺 培養(yǎng)板中。每三天換液一次，培養(yǎng)6天后檢測(cè)培養(yǎng)液中ALP的活性。使用購(gòu)自南京 建成生物工程研究所的試劑盒，按說明書的方法測(cè)定ALP的活性。同時(shí)以不加e -ecdysterone的成骨細(xì)胞株MC3T3-El或小鼠原代MSC在相同條件下得到的培養(yǎng)液 作為對(duì)照(congtrol組)。結(jié)果如圖1所示。其中A為P -ecdysterone對(duì)小鼠原代MSC 中ALP活性的影響，設(shè)定對(duì)照組的堿性磷酸酶活性(18.72U/100ml)為100，其他 各組的活性和它比較得出相對(duì)數(shù)值。B為e-ecdysterone對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T3-El中 ALP活性的影響，設(shè)定對(duì)照組的堿性磷酸酶活性(41.06U/100ml)為100，其他各組 的活性和它比較得出相對(duì)數(shù)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，10—8M (4.67*10—6g/L) 的P -ecdysterone即能增強(qiáng)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1或小鼠原代MSC中ALP的含量，并 呈明顯的量效關(guān)系。
二、 P-ecdysterone促進(jìn)核心結(jié)合因子al(Cbfal)、 I型膠原(type I collgen)和 骨鈣素(0CN)的表達(dá)
骨分化是一個(gè)有序調(diào)控的多步驟過程，ALP活性只是骨分化的早期檢測(cè)指標(biāo)。 cbfal是骨分化過程中的決定性轉(zhuǎn)錄因子，屬骨分化的早中期檢測(cè)指標(biāo);type I collgen 是骨組織中含量最豐富的胞外基質(zhì)蛋白，對(duì)成骨前體細(xì)胞的增殖、分化都非常重要； 0CN是骨分化的晚期指標(biāo)，在礦化過程中起關(guān)鍵作用。要成為成熟的、有功能的成 骨細(xì)胞，這些關(guān)鍵性、特異性基因表達(dá)量的升高也很重要。因此，還檢測(cè)了cbfal、 type I collgen和0CN的表達(dá)水平是否升高。
1、 P -ecdysterone促進(jìn)成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中核心結(jié)合因子al(Cbfal)、 I型膠 原(type I collgen)和骨韓素(0CN)的表達(dá)
把實(shí)施例1的濃度為10、 (4. 67*10—4g/L)的0 -ecdysterone加入到培養(yǎng)有成骨 細(xì)胞株MC3T3-El的細(xì)胞培養(yǎng)液中，同時(shí)以10nM的大豆甙元(Daidzein)(購(gòu)自上海同田生化技術(shù)有限公司公司)代替10—^的P-ecdysterone作為陽性對(duì)照，以未加 P -ecdysterone的成骨細(xì)胞株MC3T3-El在相同條件下得到的細(xì)胞培養(yǎng)液作為空白 對(duì)照。每三天換液一次，六天后分別收集細(xì)胞，提取總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，分別以GAPDH 5， -TCCATGACAACTTTGGTATCG-3' ， 5， -TGTAG CCAAATTCGTTGTCA-3， ， cbfal 5， -ACCTCTGACTTCTGCCTCTGGC-3， ， 5， -ATGCTGA CGAGTACCATAGTA-3' ， Type I collagen 5' -CATGAGCCGAAGCTAACCC-3' ， 5' -CATA GGACATCTGGGAAGCAA-3' ， OCN 5' -CTCTGTCTCTCTGACCTCACAG-3' ， 5' -GGA GCTGCTGTGACATCCATAC-3 ，為引物，半定量RT-PCR檢測(cè)上述cbfal 、 type I collgen和 OCN基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)條件為先94'C預(yù)變性5min;再94°C lrain， 56°C lmin; 72°C lmin，共28個(gè)循環(huán)；最后72°C 15min。同時(shí)以GADra作為內(nèi)參。具體 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。圖2中每組從左向右三個(gè)泳道依次為P -ecdysterone組、 Daidzein陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組。結(jié)果表明，加入濃度為10—^ (4. 67*l(T4g/L) 的0 -ecdysterone可以顯著誘導(dǎo)cbfal和OCN基因的表達(dá)，對(duì)type I collgen的表達(dá)也 有一定促進(jìn)作用。
三、P -ecdysterone促進(jìn)骨分化的機(jī)理
e-ecdysterone的結(jié)構(gòu)和雌激素類似，都有甾核，因此推測(cè)它可能通過雌激素受 體(ER)發(fā)揮生物學(xué)功能。ICI182780是一種特異性的ER拮抗劑，可以與受體結(jié)合， 從而干擾雌激素發(fā)揮生物學(xué)功能。
把實(shí)施例1的濃度為10—6M的3 -ecdysterone加入到培養(yǎng)有小鼠原代MSC的細(xì)胞 培養(yǎng)液中，同時(shí)加入濃度為10—6M的ICI182780 (購(gòu)自Tocris bioscience公司)。 培養(yǎng)6天后檢測(cè)培養(yǎng)液中ALP的活性。同時(shí)以小鼠原代MSC和只加入濃度為10—6M 的P -ecdysterone的小鼠原代MSC的在相同條件下的培養(yǎng)液作為對(duì)照。結(jié)果如圖3 所示。其中control為小鼠原代MSC培養(yǎng)液，Ec為只加入濃度為10—6M的p-ecdysterone 的小鼠原代MSC培養(yǎng)液，Ec + ICI為加入濃度為10—^的P-ecdysterone和10—^的 ICI182780的小鼠原代MSC培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)，設(shè)定對(duì)照組(control)的堿 性磷酸酶活性(20.75U/100ml)為100，其他各組的活性和它比較得出相對(duì)數(shù)值。
結(jié)果表明，ICI182780幾乎完全抑制了 3 -ecdysterone刺激產(chǎn)生的ALP酶活升高。 因此，P-ecdysterone很可能是通過與ER的結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的下游信號(hào)通路，從 而實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。
權(quán)利要求
1. 以蛻皮甾酮為活性成分的治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物。
2、 以蛻皮甾酮為活性成分的促進(jìn)骨分化的藥物。
3、 以蛻皮甾酮為活性成分的促進(jìn)骨愈合的藥物。
4、 蛻皮甾酮在制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。
5、 蛻皮甾酮在制備促進(jìn)骨分化的藥物中的應(yīng)用。
6、 蛻皮甾酮在制備促進(jìn)骨愈合的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了B-ecdysterone在制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明分別在整體和細(xì)胞水平研究B-ecdysterone對(duì)骨代謝的保護(hù)作用。B-ecdysterone與成骨細(xì)胞株MC3T3-E1和原代小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共同培養(yǎng)，能明顯的促進(jìn)這兩種細(xì)胞的骨分化。以維甲酸灌胃建造小鼠骨質(zhì)疏松模型，用腹腔注射和灌胃兩種方法進(jìn)行B-ecdysterone的體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明B-ecdysterone具有提高骨密度、增加骨組織中礦物質(zhì)含量、增大股骨徑和增強(qiáng)羥脯氨酸酶活性的作用。說明B-ecdysterone可用于制備治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的藥物，還可用于制備促進(jìn)骨分化和骨愈合的藥物。
文檔編號(hào)A61P19/00GK101302242SQ20081009739
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者史小軍, 勇 聶, 磊 高 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院