專利名稱：無支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種工程組織的構(gòu)建方法，尤其涉及無支架工程軟骨組織的構(gòu)建方 法及其產(chǎn)品，屬于再生醫(yī)學及組織工程領域。
背景技術：
軟骨損傷修復一直是關節(jié)外科研究的熱點。國外自體軟骨細胞移植(autologous chondrocyte implantation, ACI)已經(jīng)取得較好的臨床療效，但須二次手術，增加患者 的痛苦。目前，用于構(gòu)建工程軟骨組織的種子細胞可來源于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stromal cells, BMSCs )，但隨著年齡增長干細胞數(shù)量和增殖能力顯著下降。 自體脂肪干細胞用于關節(jié)軟骨組織工程的構(gòu)建也有報道，但這些均存在需要患者進 行二次手術的問題。胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)由于免疫表型發(fā)育不 完全，可用于異體移植，但面臨倫理、法律方面的問題，也有移植后形成畸胎瘤的 報道，應用受到限制。因此，尋找新的干細胞來源已越來越受到各國學者的關注。 近來有學者從分娩后的廢棄材料臍帶或胎盤中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞
(mesenchymal stem cells, MSCs ),并進行形態(tài)學、分化功能和表面標志物等生物學 表型鑒定，為干細胞多向分化及MSCs在臨床的應用提供了新的種子細胞來源和實 驗基礎。
胎盤與臍帶屬于胚胎外組織，存在大量多向分化的干細胞。采用膠原酶消化法 可快速獲得大量成纖維細胞樣形態(tài)的干細胞。在揭:作過程中，小心分離臍帶血管組 織和臍帶外膜組織，即可獲得臍帶Wharton膠；由于臍帶僅含有3根血管，不含有 毛細血管，可獲得純度較高的間質(zhì)干細胞。臍帶Wharton膠間質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)時 間約為3 ~ 5天，而BMSCs原代培養(yǎng)時間約8 ~ 10天；臍帶Wharton膠間質(zhì)干細胞 培養(yǎng)過程中CFU-F頻率約為3:104,而BMSCs CFU-F頻率僅為1:104 ~ 105。流式細 胞儀檢測臍帶Wharton膠干細胞陽性表達CD44、 CD105、 CD271,此為間充質(zhì)干細 胞的表面標志；而不含表達CD34、 CD45造血干細胞標志，這表明從臍帶間質(zhì) Wharton膠分離的干細胞均屬MSCs,而不含造血干細胞，因此，從臍帶Wharton膠分離MSCs的純度高于BMSCs，方法更簡便。
通過對人臍帶Wharton膠中的MSCs進行組織化學和免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn) Wharton膠MSCs與軟骨細胞具相似的細胞外基質(zhì)成分。文獻報道臍帶為富含膠 原和GAGs的組織，其中膠原占干重的50%,透明質(zhì)酸占GAGs的70%;軟骨組織 也富含膠原和GAG,膠原占干重的50%,其中II型膠原占總膠原的90% ~ 95% 。 本發(fā)明人在以往的實驗發(fā)現(xiàn)，臍帶MSC甲苯胺藍染色、番紅"O，，染色和II型膠原免 疫組織化學染色呈弱陽性；軟骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)后，曱苯胺藍染色發(fā)現(xiàn)細胞外 基質(zhì)富含軟骨糖蛋白、番紅"O"染色發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)外富含增多的氨基多糖、免疫組織 化學染色發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)II型膠原增多。對臍帶MSC進行RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，臍帶 MSC天然表達Sox-9和Col-2Al。 Sox-9基因位于人17號染色體長臂上，在胚胎性 別決定、調(diào)控軟骨分化發(fā)育起重要作用。Sox-9結(jié)合軟骨細胞特征分子II型膠原， aggrecan蛋白增強子元件，激活表達，從而調(diào)控軟骨分化。臍帶MSC天然陽性表達 Sox-9和Col-2Al,從分子水平揭示了臍帶MSC具有前軟骨細胞的特性；臍帶MSC 經(jīng)軟骨誘導培養(yǎng)后，II型膠原免疫組織化學染色呈強陽性，更接近于軟骨細胞，以 上均表明人Wharton膠分離出的干細胞具有自然向軟骨分化的特點。這也是它與成 人骨髓干細胞、脂肪干細胞不同之處。
綜上所述，臍帶Wharton膠干細胞從形態(tài)學、增殖特性、細胞表面分子標志和 免疫表型等方面均證實了具有MSCs的特點,并證實了具有前軟骨細胞的特性，在一 定條件下可較好轉(zhuǎn)化為軟骨細胞。此外，臍帶的巨大優(yōu)勢還在于取材幾乎不受限 制；無倫理學限制；如能進一步表明其免疫抑制特征或降低去除其抗原性，則可用 于異體移植，在同種異體關節(jié)軟骨修復方面將有著廣闊應用前景。
關節(jié)軟骨損傷的修復是一臨床難題，種子細胞是關節(jié)軟骨損傷修復的面臨的主 要問題。目前國內(nèi)外組建軟骨組織工程的種子細胞均來源于自體，且體外構(gòu)建的方 式多為細胞復合細胞支架。細胞與上述支架材料的復合較為繁瑣，細胞接種密度不 均，且存在細胞與支架生物相容性、支架體內(nèi)降解產(chǎn)物對人體安全性、支架臨床應 用審批復雜等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種無支架的軟骨組 織的構(gòu)建方法。
本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種無支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法，包括
(1) 將人臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs )誘導分化為軟骨
細胞；
(2) 將軟骨細胞接著進行聚集誘導培養(yǎng)，使軟骨細胞向細胞外分泌基質(zhì)并結(jié) 成膜狀物，將膜狀物(該膜狀物由細胞外基質(zhì)及軟骨細胞組成)從培養(yǎng)瓶壁剝離后 在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移至離心管離心，在離心力的 作用下使細胞進一步聚集，形成疏松的軟骨細胞團塊；
(3) 將疏松的軟骨組織團塊在旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行旋轉(zhuǎn)誘導培養(yǎng)，得到 致密的類軟骨組織。
步驟(1)中所述的誘導分化方式可采用單層誘導培養(yǎng)方式，可參考有關文獻 所公開的方式進行誘導分化(例如Wang HS， Hung SC， Peng ST, et al. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem Cells, 2004, 22(7):1330);更優(yōu)選的，步驟(1 )中所述的誘導分化按照以下培養(yǎng)體系和培養(yǎng)條件 進行誘導培養(yǎng)液為DMEM(20。/。FBS)加入10ng/mlhTGF-|31, 10ng/mlhFGF,體 積分數(shù)為1%ITS和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為37°C 、在5%C02 的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每3天換液一次。
步驟(2)中所述的聚集誘導培養(yǎng)的誘導培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件同步驟(1)所述的 誘導培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件，也可按照文獻所公開的聚集誘導培養(yǎng)的條件所進行(B. Johnstone, T.M. Hering， A.I. Caplan， V.M. Goldberg, J.U. Yoo, In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells, Exp. Cell Res. 238 (1998) 265-272 )。
所述的離心管優(yōu)選是15毫升的尖底離心管；所述離心優(yōu)選在以下條件進行離 心離心轉(zhuǎn)速為1000rpm-2000rpm,離心時間為10分鐘。
步驟(3)中將疏松的軟骨組織團塊在旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)誘導培養(yǎng)時，所述 的誘導培養(yǎng)液同步驟(1 ),即DMEM力卩20%FBS,再加入10ng/ml hTGF陽卩l(xiāng)、 10ng/ml hFGF、體積分數(shù)為1%的ITS和1.Ox l(T8 mol/L地塞米松；培養(yǎng)條件如下培養(yǎng)溫度 為37。C;旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)速分步進行調(diào)整，即(1 )將旋轉(zhuǎn)的起始速度控制 為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)30分鐘后，休息30分鐘，再重復上述操作2次之后將旋 轉(zhuǎn)速度改為16轉(zhuǎn)/分鐘，每持續(xù)旋轉(zhuǎn)三天換誘導培養(yǎng)液一次， 一般持續(xù)培養(yǎng)10-20 天，優(yōu)選為15天(本領域技術人員可視細胞的多少及所需形成的組織大小而適當 改變或設定培養(yǎng)時間)。本發(fā)明首先將人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化為軟骨細胞，將軟骨細胞進行聚集 誘導培養(yǎng)，得到大量的由細胞外基質(zhì)及軟骨細胞組成的膜狀物，將膜狀物剝離后放 入在離心管內(nèi)，在離心機的離心力的作用下，膜狀物堆積，取出堆積膜狀物，在細 胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)一周，隨著培養(yǎng)時間的延長，繼續(xù)分泌的細胞外基質(zhì)將膜
狀物進行整合，形成疏松的軟骨組織團塊；最后將軟骨組織團塊轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)細胞培 養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行誘導培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的作用下，疏松的軟骨組織團塊在力 學的刺激下，細胞繼續(xù)增殖，并分泌基質(zhì)，形成更大的組織團塊，組織變得致密、 光滑而具有光澤，使得誘導后的組織接近軟骨組織。
本發(fā)明由人臍帶MSCs經(jīng)過密集誘導培養(yǎng)后結(jié)成的細胞膜結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物反應 器技術體外誘導培養(yǎng)，誘導后細胞分泌的細胞外基質(zhì)(ECM)具有類似軟骨細胞外 基質(zhì)的成分，是良好的軟骨細胞天然的支架，構(gòu)建得到無支架的工程軟骨組織。經(jīng) 細胞學、組織學、免疫組織化學染色顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的工程組織具有正常軟骨 細胞特點。
本發(fā)明在整個培養(yǎng)過程中(細胞—細胞聚集成膜狀—疏松組織塊—致密組織塊 —類軟骨樣組織)不涉及細胞與外源性支架的復合問題，細胞種植密度均勻，不存 在細胞與支架生物相容性的問題，對人體安全，操作簡單，臨床可應用于關節(jié)軟骨 缺損的治療或修復。


圖1 間充質(zhì)干細胞的表型。
圖2 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的外觀。
圖3 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的HE染色結(jié)果。
圖4 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的番紅花"O"染色結(jié)果。
圖5 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的曱苯胺藍染色結(jié)果。
圖6 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的n型膠原免疫組織化學染色結(jié)果。
圖7 本發(fā)明所構(gòu)建的無支架軟骨組織的RT-PCR檢測結(jié)果((Sox-9及Col-2Al 為陽性)；1: Marker; 2、 7: (3-actin ; 3、 5: Sox-9; 4、 6: Col-2Al。 2、 3、 4為 誘導前的結(jié)果，5、 6、 7為誘導后的結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方 案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
一、 材料與試劑
PE-CD44、 PE-HLA陽ABC、 FITC墨HLA-DPDQDR、 FITC-CD34、 FITC-CD45及 FITC-IgGl和PE-IgGl抗體(BD公司，USA )， PE-CD105抗體(Sant Crus公司，USA), PE-CD271抗體(Miltenyi Biotec GmbH， Germany); DMEM培養(yǎng)基(dulbecco，s modified Eagle's medium, DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)、胰島素-轉(zhuǎn) 鐵蛋白-硒(insulin-transferrin-selenium， ITS)、胰酶、地塞米松、II型膠原單克隆抗 體(Sigma公司，USA);青霉素、鏈霉素(華北制藥有限公司)；人轉(zhuǎn)化生長因子卩l(xiāng) (human transforming growth factor|3-l, hTGF-pi， PeproTechEC公司，USA)、人成 纖維細胞生長因子(human fibroblast growth factor, hFGF, Pepro Tech EC公司， USA)。 Trizol Reagent (Invitrogen公司，USA)， RT陽PCR試劑(QIAGEN公司， Germany),瓊脂糖(Promega公司，USA )。
二、 實驗設備
C02培養(yǎng)箱(Hereus B5060型，Germany);倒置相差光學顯微鏡及成像系統(tǒng) (OLYMPUS, 1X70， Japan )及光學顯微鏡及成像系統(tǒng)(OLYMPUS, BX51， Japan); 流式細胞儀(BD公司，USA);凝膠分析系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司，Champgel 2000型)；旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(SYNTHECON公司，USA)。
三、 D-hank，s平衡液的配制
取8.0gNaCl、 0.4gKCl、 0.06g Na2HP04.H20、 0.06gKH2PO4，加水200ml溶解， 加入酚紅母液lml，定容至1000 ml,分裝到250ml瓶中，高壓蒸汽消毒，用時用 NaHC03調(diào)整pH值到7.2左右。
實施例1 無支架組織工程軟骨組織的構(gòu)建及鑒定 1 、人臍帶Wharton膠干細胞的分離與培養(yǎng)
從手術臺取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，D-Hank平衡液充分洗滌殘留的血 液，去除臍靜脈、動脈及臍帶外膜，剝離Wharton膠，剪碎后用I型膠原酶37。C磁 力攪拌器作用下消化。將消化后的含細胞消化液用D-Hank平衡液清洗、1500轉(zhuǎn)/ 分鐘離心10min，離心3遍后，將收集的細胞種植于含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM培養(yǎng)瓶中，37°C、 5%0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，以倒置相差顯微鏡觀察。
2、 人臍帶Wharton膠干細胞表面分子標志檢測與鑒定
收集第二代人臍帶Wharton膠干細胞，分別加入造血干細胞標志抗體 FITC-CD34和FITC-CD45， MSCs標志抗體PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271,主 要組織相容性抗原復合物(major histocompability complex, MHC )標志抗體 PE-HLA-ABC和FITC-HLA-DPDQDR,觀察人臍帶干細胞造血標志、MSCs標志和 MHC表達情況，同時采用PE-IgGl和FITC-IgGl作為同行對照。人臍帶干細胞與 相應抗體在4。C冰箱中孵育30min， PBS洗滌并調(diào)整細胞濃度為lxl06/ml,流式細 胞儀檢測。結(jié)果PE-CD44、 PE-CD105和PE-CD271陽性，F(xiàn)ITC-CD34和FITC-CD45 陰性；HLA-ABC陽性，HLA-DPDQDR陰性(圖1 )。
3、 軟骨組織的構(gòu)建(聚集誘導培養(yǎng)+旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)誘導培養(yǎng))
(1 )取高密度的第二代人臍帶Wharton膠MSCs置于向軟骨分化的誘導培養(yǎng) 液中(DMEM(20。/oFBS)加入10ng/mlhTGF-(31, 10ng/mlhFGF,體積分數(shù)為1%ITS 和l.Oxl(T8 mol/L地塞米松)；培養(yǎng)條件37°C 、 5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，每3 天換液，可見誘導后人臍帶Wharton膠MSCs迅速結(jié)成膜狀；
(2)隨著聚集誘導培養(yǎng)，結(jié)成的膜狀物隨著誘導時間的延長，膜的邊緣掀起， 將細胞膜小心吹打，移至15ml尖底的離心管內(nèi)在轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm的條件下離 心lOmin,細胞進一步聚集，使膜狀物堆積于尖底的離心管底部，離心管內(nèi)的誘導 培養(yǎng)液同步驟(l);然后取出膜狀物，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)，誘導l周后， 用吸管小心的將基于細胞膜的松散的團塊樣組織移至旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)進 行誘導培養(yǎng)，在旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)的誘導培養(yǎng)液同步驟(1)，培養(yǎng)溫度為37。C, 旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)速分步進行調(diào)整，即(l)起始速度為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)培 養(yǎng)30分鐘后停止旋轉(zhuǎn)(休息)30分鐘，(2)將步驟(1 )再重復2次，之后旋轉(zhuǎn) 速度改為16轉(zhuǎn)/分鐘，每持續(xù)旋轉(zhuǎn)三天換誘導培養(yǎng)液一次，持續(xù)培養(yǎng)15天左右， 即得。
4、 鑒定
形成的組織具有類軟骨特點，外觀組織具有光澤和彈性，直徑為5mm(圖2 ) 組織化學和免疫細胞化學鑒定軟骨細胞圓形，位于陷窩中，番紅"O"、甲苯 胺藍染色，II型膠原染色細胞內(nèi)外均陽性(圖3，圖4,圖5,圖6 )。 DNA鑒定RT-PCR檢測，Sox-9及Col-2Al為陽性(圖7 )。
權(quán)利要求
1、一種無支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法，包括(1)將人臍帶間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells)誘導培養(yǎng)分化為軟骨細胞；(2)將軟骨細胞進行聚集誘導培養(yǎng)，使軟骨細胞向細胞外分泌基質(zhì)并結(jié)成膜狀物，將膜狀物在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)，之后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)離心，在離心力的作用下，使細胞進一步團聚，形成疏松的軟骨細胞團塊；(3)將疏松的軟骨細胞團塊在旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進行旋轉(zhuǎn)誘導培養(yǎng)，得到致密的類軟骨組織。
2、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中所述的離心管是15 毫升的尖底離心管。
3、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(2)中所述離心的轉(zhuǎn)速為 1000rpm-2000rpm，離心時間為10min。
4、 按照權(quán)利要求1的構(gòu)建方法，其特征在于步驟(3)中所述的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速按 照以下步驟進行調(diào)控(1 )將起始旋轉(zhuǎn)速度控制為12轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)30分鐘再停止 旋轉(zhuǎn)30分鐘；(2 )將步驟(1 )重復2次以后將旋轉(zhuǎn)速度控制為16轉(zhuǎn)/分鐘，進行 持續(xù)旋轉(zhuǎn)。
5、 按照權(quán)利要求4的構(gòu)建方法，其特征在于所述的持續(xù)旋轉(zhuǎn)的時間為10-20天。
6、 按照權(quán)利要求5的構(gòu)建方法，其特征在于所述的持續(xù)旋轉(zhuǎn)的時間為15天。
7、 權(quán)利要求l-6任何一項構(gòu)建方法所得到的無支架工程軟骨組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種無支架工程軟骨組織的構(gòu)建方法及由該方法所得到的產(chǎn)品。本發(fā)明的構(gòu)建方法包括將人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導分化為軟骨細胞，再接著進行聚集誘導培養(yǎng)，使其向細胞外分泌基質(zhì)并結(jié)成膜狀物；將膜狀物在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)誘導培養(yǎng)，形成疏松的軟骨組織團塊；在旋轉(zhuǎn)壁式生物反應器內(nèi)繼續(xù)誘導培養(yǎng)，得到致密的類軟骨組織。經(jīng)細胞學、組織學或免疫組織化學染色顯示，本發(fā)明所構(gòu)建的工程組織具有正常軟骨細胞表型。本發(fā)明所構(gòu)建的無支架工程軟骨組織不涉及細胞與外源性支架的復合問題，不存在細胞與支架生物相容性的問題，對人體安全，細胞種植密度均勻，臨床應用操作簡單，可應用于軟骨缺損的治療或修復。
文檔編號A61F2/28GK101543644SQ20081010284
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月27日
發(fā)明者侯克東, 盧世璧, 莉 張, 江 彭, 玥 田, 玫 袁, 許文靜, 郭金義 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院