專利名稱：兩面針堿的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及兩面針堿的新用途。
背景技術(shù)：
端粒DNA是位于染色體末端并對(duì)染色體具有保護(hù)作用的富含鳥(niǎo)嘌呤(G)的 DNA序列，它由一段雙鏈重復(fù)區(qū)域和一段單鏈重復(fù)區(qū)域構(gòu)成，人類和哺乳動(dòng)物的 重復(fù)序列單元為TTAGGG。富含G的DNA單鏈在陽(yáng)離子的誘導(dǎo)下可以通過(guò)G堿 基間Hoogsteen氫鍵形成四鏈體(G4)。研究表明，85~90%惡性腫瘤的發(fā)病都與 端粒酶的活性有關(guān)，而DNAG4結(jié)構(gòu)的形成可以有效抑制端粒酶的活性，進(jìn)而達(dá)到 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。因此，能夠誘導(dǎo)DNAG4形成并使之穩(wěn)定的化合物有望 成為抗腫瘤的先導(dǎo)化合物，成為目前研究的熱點(diǎn)。
大量研究表明，單鏈DNA (序歹!j為TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG，簡(jiǎn) 稱為Hum24)在Na+溶液中形成反平行G4結(jié)構(gòu)，在K+溶液中形成平行和反平行共 存的G4混合結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供兩面針堿的一種新用途。
本發(fā)明所提供的兩面針堿的用途是兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù) 防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述兩面針堿的結(jié)構(gòu)式如下
式U L
所述兩面針堿藥學(xué)上可接受的鹽具體可為氯鹽。
所述兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽，適合于制備預(yù)防和/或治療人肝癌、肺癌、 腹水癌、鼻咽癌、舌癌的藥物，優(yōu)選為制備預(yù)防和/或治療人肝癌藥物。
3本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分可為式(I )所示的 兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽。
所述兩面針堿藥學(xué)上可接受的鹽具體可為氯鹽。
所述預(yù)防和/或治療腫瘤藥物可通過(guò)注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物
理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他 物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機(jī)體。
以兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分的抗腫瘤藥物，需要的時(shí)候，在 上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常 規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性 劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等。
用兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽制備的預(yù)防和/或治療腫瘤藥物可以制成注 射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑 型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
兩面針堿體外抗癌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩面針堿對(duì)癌細(xì)胞有很好的抑制作用。濃 度為5pg/ml的兩面針堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為63%。
兩面針堿抑瘤機(jī)理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩面針堿通過(guò)誘導(dǎo)人和哺乳動(dòng)物端粒DNA形 成G4混合結(jié)構(gòu)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。


圖1為人體端粒DNAHum24在未加入兩面針堿和加入兩面針堿的條件下構(gòu)象 變化的圓二色譜圖(a) Hum24; (b)加入兩面針堿，使Hum24與兩面針堿的 摩爾比為1 : 12;每個(gè)譜圖的摩爾橢圓度為-10—10 (mdeg)。
圖2 (a)為兩面針堿誘導(dǎo)單鏈Hum24形成G4混合結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)曲線圖；(b) 為Na+誘導(dǎo)單鏈Hum24形成反平行G4結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 、 MTT還原法檢測(cè)兩面針堿體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn) MTT法的基本原理為四甲基偶氮唑鹽[MTT, 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide](購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司)是一種能接受氫原子的 染料?；罴?xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不 溶性的藍(lán)紫色的formazon，而死細(xì)胞則無(wú)此功能。用DMSO溶解formazon后，在 一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。按照公式可計(jì)算腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％) = (OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn))/OD對(duì)照x 100%。 具體操作步驟如下-
1) 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁人肝癌細(xì)胞HEPG-2，用0.25 %胰酶消化后，用含10 % 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制成5000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分別接種在96孔培 養(yǎng)板中，每孔接種100nl， 37°C， 5。/。C02培養(yǎng)24h。
2) 每孔加入兩面針堿(成都思科華有限公司，純度為98%)溶液10|il，用RPMI 1640培養(yǎng)液補(bǔ)充至每孔終體積為200nl，使每孔中兩面針堿終濃度為5pg/ml。設(shè)對(duì) 照組，加入200^1 RPMI 1640培養(yǎng)液。設(shè)空白組，每孔未接種細(xì)胞，只加入200^1 RPMI 1640培養(yǎng)液。37°C， 5。/。C02培養(yǎng)3d。實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。
3) 棄上清液，每孔加入100^1新鮮配制的0.5 mg/ml MTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，37 。C 繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200^1 DMSO溶解MTTformazon沉淀，用微型 超聲振蕩器混勻，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)544nm處的光密度值。按照下述公式計(jì)算 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％) = (OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn))/OD對(duì)照 "00% (其中OD對(duì)照、OD實(shí)驗(yàn)為已經(jīng)扣除OD空白的實(shí)驗(yàn)數(shù)值)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明5pg/ml的兩面針堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為63%。
實(shí)施例2、兩面針堿抑瘤機(jī)理
在無(wú)金屬離子存在的條件下，溶液中Hum24呈單鏈構(gòu)型存在，這種構(gòu)型在圓 二色譜(CD)中有明顯的特征在256nm附近出現(xiàn)一個(gè)正峰，在240nm附近出 現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰。當(dāng)單鏈Hum24溶液中加入一定濃度兩面針堿時(shí)，Hum24由單鏈轉(zhuǎn)化 為一種G4混合結(jié)構(gòu)，在CD譜中有明顯的特征為在290nm附近出現(xiàn)一個(gè)正峰， 在270 nm附近出現(xiàn)一個(gè)正峰。
具體的實(shí)驗(yàn)方法如下緩沖溶液為由如下終濃度的物質(zhì)組成的水溶液10 mM Tris-HCl， lmM EDTA; pH 7.4。將30 OD單鏈Hum24 (上海英俊生物技術(shù)有限公 司)(其序列如序列表中序列1所示)溶解在所述緩沖溶液中得到濃度為250 pM的 Hum24母液。將0.5mg兩面針堿溶解在所述緩沖溶液中得到濃度為136 兩面 針堿母液。將兩面針堿母液用所述緩沖溶液稀釋成濃度分別為0.2pM、0.6pM、 lpM、 2pM、 4pM、 8pM、 12)iM、 14pM、 16|iM、 18|iM、 20|aM、 22pM的兩面針堿溶液。 取250 的單鏈Hum24溶液分別加入上述濃度的兩面針堿溶液，使混合溶液中單
鏈Hum24與兩面針堿的摩爾比分別為l : o.i， l : 0.3， l : 0.5， i:i， l : 2， 1:4， l:6， l:7， l:8， l:9， l : io， l: 12。將上述混合溶液，均在25 。C孵育12h，采用圓二色譜儀測(cè)定其構(gòu)象的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)單鏈Hum24與兩面針 堿的摩爾比大于等于l :4時(shí)都可以明顯看到G4混合結(jié)構(gòu)的特征峰。其中，單鏈 Hum24與兩面針堿摩爾比為1 : 12時(shí)形成的G4混合結(jié)構(gòu)的圓二色譜圖如圖1中b 所示。
通過(guò)變溫CD表征由兩面針堿誘導(dǎo)形成的G4混合結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。DNA的熔 點(diǎn)(Tm)反映了它的熱穩(wěn)定性。熔點(diǎn)越高說(shuō)明該DNA越穩(wěn)定，反之，熔點(diǎn)越低該 結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。Hum24G4的熔點(diǎn)是指G4結(jié)構(gòu)分解50。/。時(shí)的溫度。通過(guò)檢測(cè)此G4 混合結(jié)構(gòu)在290 nm的CD信號(hào)隨著溫度升高的降低來(lái)得到它的熔點(diǎn)。
具體的實(shí)驗(yàn)方法如下將以單鏈Hum24與兩面針堿摩爾比為1 : 6時(shí)形成的 G4混合結(jié)構(gòu)通過(guò)圓二色譜變溫測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行熔點(diǎn)的測(cè)定。采用的儀器為Jasco815 圓二色譜儀，CD實(shí)驗(yàn)中采用的CD吸收池光程為1 cm。在進(jìn)行CD實(shí)驗(yàn)前用高純 N2除氧5分鐘，而且實(shí)驗(yàn)中也一直用高純N2作為保護(hù)氣以保證沒(méi)有臭氧出現(xiàn)，CD 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集前，用緩沖溶液進(jìn)行基線校對(duì)。在近紫外區(qū)220nm-320nm采集CD 光譜，掃描速度為500nm/min，采集次數(shù)為4次。在變溫實(shí)驗(yàn)中采用JascoPTC-423S 控溫儀，升溫速度為2°C/min，通過(guò)監(jiān)控2卯nmCD信號(hào)來(lái)進(jìn)行G4熔點(diǎn)的測(cè)定， 結(jié)果如圖2所示。變溫CD結(jié)果表明，此G4混合結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)為43 °C (熔點(diǎn)圖如圖 2a所示)，比Na+誘導(dǎo)形成的反平行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定(熔點(diǎn)圖如圖2b所示)，說(shuō)明兩面 針堿誘導(dǎo)形成的G4混合結(jié)構(gòu)是比較穩(wěn)定的。
說(shuō)明兩面針堿是通過(guò)誘導(dǎo)人和哺乳動(dòng)物端粒DNA形成G4混合結(jié)構(gòu)來(lái)抑制腫 瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。序列表
<160>1
<210>1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223> <400>1
ttagggttag ggttagggU aggg
權(quán)利要求
1、兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述兩面針堿的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示式(I)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其特征在于所述兩面針堿藥學(xué)上可接受的鹽 為氯鹽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為人肝癌。
4、 一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，它的有效成分為下述式(I)所示的兩面針堿 或其藥學(xué)上可接受的鹽式(I)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于所述兩面針堿藥學(xué)上可接受的鹽為孰鹽o
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的藥物，其特征在于所述腫瘤為人肝癌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了兩面針堿的一種新用途。該用途是兩面針堿或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，特別是在制備預(yù)防和/或治療人肝癌藥物中的應(yīng)用；所述的兩面針堿，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示?？拱┗钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩面針堿對(duì)癌細(xì)胞有較好的抑制作用。5μg/ml的兩面針堿對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2的抑制率為63％。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101564393SQ20081010501
公開(kāi)日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 徐廣智, 舒 楊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所