專利名稱：：一種杏香兔耳風有效部位及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥領域，具體來說，是一種杏香兔耳風有效部位及其制備方法。本發(fā)明還涉及杏香兔耳風有效部位在開發(fā)抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳頭瘤病毒、治療心血管疾病等新型藥物中的應用。
背景技術：
：杏香兔耳風為菊科植物鐵燈兔耳風(AinsliaeamacroclinidioidesHay)或杏香兔耳風(AinsliaeafragransChamp)的干燥全草，具有清熱解毒，祛痰生新等功效，現臨床上主要用于濕熱下注所致慢性宮頸炎，子宮內膜炎，陰道炎，白帶等癥。現代研究表明，杏香兔耳風中主要含有綠原酸、3，5-二咖啡酰基奎寧酸、4，5-二咖啡?；鼘幩岬确铀犷惢衔?，還含有倍半萜內酯、倍半萜苷、甾體、三萜類化合物，黃酮類、丁香烯和豆甾醇等成分。其中3，5-二咖啡?；鼘幩?、4，5-二咖啡?；鼘幩釣榉铀犷惢衔铮鼈冊谝种艸IV-1整合酶、抑制小鼠黑色素瘤B^細胞中黑色素的生成、提高免疫功能、促進前列腺環(huán)素釋放、抗血小板聚集、清除DPPH自由基和抗脂質過氧化及體外抗炎、治療心血管疾病等方面具有一定的作用。現代研究表明，二咖啡酰基奎寧酸對于乙肝病毒、艾滋病毒、冠狀病毒感染有特殊治療作用。眾所周知，乙肝和艾滋病都是威脅人類健康甚至是生命的疾病，目前用于抗病毒的藥物大多效果不顯著，或者有些藥物的治療費用太高，不適合我國國情，這就要求我們開發(fā)出療效確切、成本低廉的抗病毒藥物。我們通過研究發(fā)現，杏香兔耳風中含有大量的3，5-二咖啡?；鼘幩?、4，5-二咖啡?；鼘幩岬榷Х弱；鼘幩犷惢衔铮瑢⑵溟_發(fā)成具有抗乙肝病毒、抗艾滋病毒等新型的抗病毒藥物具有廣闊的市場前景。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供一種杏香兔耳風有效部位，本發(fā)明的另一目的是提供一種杏香兔耳風有效部位的制備方法。為了達到上述目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案-一種杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下歩驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材，加10%~80%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A,減壓濃縮，得濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B上大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10%~90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位。杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材粗粉，加入10~20倍量的10%~80%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮至藥材量的3~8倍，得到杏香兔耳風濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B,先用石油醚萃取36次，再用乙酸乙酯萃取36次，分別合并萃取液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B，過大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10%~90%乙醇洗，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位。杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有1-80%的總酚酸。杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩岬确铀犷惢衔铩Ｐ酉阃枚L有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有總酚酸類具體為含0.05%-20%的綠原酸和0.5%-50%的3，5-二咖啡酰基奎寧酸及4，5-二咖啡酰基奎寧酸等其它酚酸類化合物。杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(l)中杏香兔耳風藥材滲漉時間為1-15天，加熱回流次數為l-4次，加熱回流時間為l-3小時。杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(2)中減壓濃縮溫度是30-7(TC。杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(3)中所使用的干燥方法為常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括AB-8、NKA-9、HPD-700、HPD_600、HPD_500、HPD-400等型號的大孔吸附樹脂，其中優(yōu)選NKA-9大孔吸附樹脂。杏香兔耳風有效部位具有抑菌、抗炎作用，對乙肝病毒、艾滋病毒、人乳頭瘤病毒等均具有明顯抑制作用，對心血管疾病也有一定的療效，可單獨或與其它藥物配合開發(fā)抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳頭瘤病毒、治療心血管疾病等新型藥物。本發(fā)明通過大量工藝研究結合藥效篩選出杏香兔耳風的有效部位及其制備方法。我們通過抗炎、體內和體外抑制病毒等藥理試驗發(fā)現，本發(fā)明分離得到的有效部位具有明顯抗炎作用，且對病毒具有明顯抑制作用，尤其是對乙肝病毒、艾滋病毒、人乳頭瘤病毒的抑制作用顯著。我們提供的杏香兔耳風有效部位制備方法工藝穩(wěn)定，重現性好，可進一步開發(fā)成抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳頭瘤病毒、治療心血管疾病等新型藥物。具體實施例方式下列實施例、實驗例是為了進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施例1-1一種杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材，加10%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮，得濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B上大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位。實施例1-2一種杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材，加80%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮，得濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B上大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用90%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位。實施例1-3一種杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材，加50%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A,減壓濃縮，得濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B上大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用60%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位。實施例2-1杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材粗粉，加入IO倍量的10%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮至藥材量的3倍，得到杏香兔耳風濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，先用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分別合并萃取液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B，過大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10%乙醇洗，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位。實施例2-2杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材粗粉，加入20倍量的80%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮至藥材量的8倍，得到杏香兔耳風濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，先用石油醚萃取6次，再用乙酸乙酯萃取6次，分別合并萃取液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B，過大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用90%乙醇洗，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位。實施例2-3杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材粗粉，加入15倍量的40%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮至藥材量的6倍，得到杏香兔耳風濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，先用石油醚萃取4次，再用乙酸乙酯萃取4次，分別合并萃取液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B，過大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用50%乙醇洗，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位。實施例3-1杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有1%的總酚酸。實施例3-2杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有80%的總酚酸。實施例3-3杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有55%的總酚酸。實施例4-1杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有總酚酸類具體為含0.05%%的綠原酸和50%的3，5-二咖啡酰基奎寧酸及4，5-二咖啡酰基奎寧酸。實施例4-2杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有總酚酸類具體為含20%的綠原酸和0.5%的3，5-二咖啡?；鼘幩峒?，5-二咖啡?；鼘幩?。實施例4-3杏香兔耳風有效部位的制備方法，杏香兔耳風有效部位含有總酚酸類具體為含3.9%的綠原酸和18%的3，5-二咖啡?；鼘幩峒?,5-二咖啡酰基奎寧酸。實施例5-1杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(1)中杏香兔耳風藥材滲漉時間為1天，加熱回流次數為l次，加熱回流時間為l小時。步驟(2)中減壓濃縮溫度是30'C。步驟(3)中所使用的干燥方法為常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。其余同實施例2-l。實施例5-2杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(1)中杏香兔耳風藥材滲漉時間為15天，加熱回流次數為4次，加熱回流時間為3小時。步驟(2)中減壓濃縮溫度是7(TC。步驟(3)中所使用的干燥方法為常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。其余同實施例2-2。實施例5-3杏香兔耳風有效部位制備方法，步驟(1)中杏香兔耳風藥材滲漉時間為10天，加熱回流次數為2次，加熱回流時間為2小時。步驟(2)中減壓濃縮溫度是40'C。步驟(3)中所使用的干燥方法為常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。其余同實施例2-3。實施例6-1杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括AB-8大孔吸附樹脂。其余同實施例2-l。實施例6-2杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括NKA-9、大孔吸附樹脂。其余同實施例2-2。實施例6-3杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括HPD-700、大孔吸附樹脂。其余同實施例2-3。實施例6-4杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括HPD-600大孔吸附樹脂。其余同實施例2-l。實施例6-5杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括HPD-600大孔吸附樹脂。其余同實施例2-2。實施例6-6杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括HPD-500大孔吸附樹脂。其余同實施例2-3。實施例6-7杏香兔耳風有效部位制備方法，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括HPD-400大孔吸附樹脂。其余同實施例2-4。實驗例l:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉2.5kg，裝入圓筒內，室溫下加30%乙醇滲漉，流速控制在5ml/min左右，共收集滲漉液20L，減壓濃縮原生藥量5倍，即12.5L，濃縮液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物①55g，總酚酸含量51%，其中含3%的綠原酸和35%的3，5-二咖啡?；鼘幩帷嶒灷?:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉2.5kg，裝入圓筒內，室溫下加30%乙醇滲漉，流速控制在5ml/min左右，共收集滲漉液20L，減壓濃縮至原生藥量3倍，即7.5L，離心，取上清液，上已預處理好的大孔吸附樹脂柱(NKA-9)，先用水洗至無色或顏色較淺，再用55%乙醇洗，收集酒精洗脫液約20L，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物②50g，總酚酸含量45%，其中含1%的綠原酸和32%的3，5-二咖啡?；鼘幩帷嶒灷?:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉500g，加入15倍量30%乙醇加熱回流提取1小時，提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至原生藥量5倍，即2500ml，濃縮液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物③15g,總酚酸含量50%，其中含5%的綠原酸和30%的3，5-二咖啡?；鼘幩帷嶒灷?:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉500g，加入15倍量70%乙醇加熱回流提取1小時，提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至原生藥量5倍，即2500ml，濃縮液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物④14g，總酚酸含量55%，其中含2%的綠原酸和38%的3，5-二咖啡?；鼘幩?。實驗例5:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉500g，加入15倍量30%乙醇加熱回流提取1小時，提取三次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至原生藥量3倍，即1500ml，離心，取上清液，上已預處理好的大孔吸附樹脂柱(NKA-9)，先用水洗至無色或顏色較淺，再用30%乙醇洗，收集酒精洗脫液約5000ml，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物⑤10g，總酚酸含量40%，其中含8%的綠原酸和18%的3，5-二咖啡?；鼘幩?。實驗例6:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉500g，裝入圓筒內，室溫下加70%乙醇滲漉，流速控制在5ml/min左右，共收集滲漉液5000ml，減壓濃縮至原生藥量3倍，即1500ml，離心，取上清液，上已預處理好的大孔吸附樹脂柱(NKA-9)，先用水洗至無色或顏色較淺，再用55%乙醇洗，收集酒精洗脫液約5000ml，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物⑥9g，總酚酸含量55%，其中含5%的綠原酸和40%的3，5-二咖啡?；鼘幩?。實驗例7:杏香兔耳風有效部位的制備取杏香兔耳風全草粗粉500g，裝入圓筒內，室溫下加70%乙醇滲漉，流速控制在5ml/min左右，共收集滲漉液5000ml，減壓濃縮至原生藥量5倍，即2500ml，濃縮液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶劑，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，減壓濃縮、水浴上蒸干、真空干燥溫度不能高于6(TC，即得杏香兔耳風有效部位提取物⑦llg，總酚酸含量65%，其中含5%的綠原酸和45%的3，5-二咖啡酰基奎寧酸，萃余液部位濃縮、干燥后得杏香兔耳風提取物⑧25g,總酚酸含量18%，其中含10%的綠原酸和1%的3，5-二咖啡?；鼘幩?。實驗例8:杏香兔耳風有效部位提取物體內抗炎實驗的研究1、杏香兔耳風有效部位提取物對角菜膠致大鼠足跖腫脹反應的影響Wistar大鼠50只，按體重隨機分組，每組10只，實驗組大鼠分別給予杏香兔耳風有效部位提取物⑦(T)50200mg/kg;陽性藥對照組和溶煤對照組大鼠分別給予阿斯匹林100mg/kg和同體積蒸餾水，1.0ml/100g體重容積灌胃給藥，24小時(土2小時)l次，連續(xù)5次。末次給藥后立即以lQ/。角叉菜0.1ml注射于大鼠右后足跖皮下致炎；自制毛細管放大測量裝置測定大鼠致炎足外踝突出處平面以下部位致炎前和致炎后15小時的容積，計算大鼠足跖腫脹率(％)和腫脹抑制率(%)。足跖腫脹率(％)=-致炎后足跖容積—致炎前足跖容積致炎前足跖容積xioo%腫脹抑制率(％)=-對照組腫脹率一給藥組腫脹率對照組腫脹率xioo%t檢驗比較組間足跖腫脹率(％)的顯著性差異，實驗結果見表l,表l杏香兔耳風有效部位提取物(T)對角叉菜致大鼠足跖急性炎癥(腫脹)反應的影響(x士s)(n二8)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。結果表明，50200mg/kg杏香兔耳風有效部位提取物⑦灌胃給藥對角叉菜致大鼠足跖急性炎癥反應有不同程度的抑制作用。其中，大劑量組13小時、中劑量組1小時、小劑量組5小時與溶媒對照組差異有高度顯著性或顯著性(P<0.01或P<0.05)。2、杏香兔耳風有效部位提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹反應的影響雄性昆明種小鼠50只，26~30g，隨機分組，實驗組小鼠分別給予杏香兔耳風有效部位提取物(T)65260mg/kg;陽性藥對照組和溶煤對照組小鼠分別給予阿斯匹林100mg/kg和同體積蒸餾水，0.2ml/10g體重容積灌胃給藥，24小時(±2小時)l次，連續(xù)5次。末次給藥后60min,以棉球蘸取二甲苯50pl接觸試驗小鼠右耳雙面5秒，15min脫頸椎處死小鼠，用直徑6mm打孔器將雙耳同部位等面積切下，稱取左右耳片重量，計算耳廓腫脹率(％)和腫脹抑制率(％)。耳廓腫脹率(％)腫脹抑制率(％)二-右耳片重量一左耳片重量-xioo%左耳片重量對照組腫脹率一給藥組腫脹率對照組腫脹率X100%t檢驗比較組間耳廓腫脹率(％)組間差異的顯著性，實驗結果見表2。表2杏香兔耳風有效部位提取物⑦(T)對二甲苯致小鼠耳廓急性炎癥的抑制作用(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注與溶媒對照組比較，**P<0.01。結果表明，65~260mg/kg杏香兔耳風有效部位提取物⑦灌胃給藥對二甲苯所致小鼠耳廓急性炎癥反應有不同程度的抑制作用。其中，大劑量組260mg/kg杏香兔耳風有效部位提取物與溶媒對照組差異有高度顯著性(P<0.01)。實驗例9:杏香兔耳風有效部位提取物體外抗HBV實驗研究藥物及試劑杏香兔耳風有效部位提取物②、⑦、⑧，DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，胰蛋白酶，MTT，DMSO。細胞株HBV-DNA克隆轉染的人肝癌細胞HepG2-2.2.15細胞株實驗方法采用共轉染法將克隆的HBV-DNA及抗G418質粒同時轉入人肝癌細胞株HepG2建立HepG2-2.2.15細胞株，該細胞株能長期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，而且還能產生大量的病毒復制中間體，是目前體外抗HBV藥物篩選和評價較好的細胞模型。HepG2-2.2.15細胞采用含10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，將HepG2-2.2.15細胞以3X105/mL的細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔O.lmL，置37'C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;根據預實驗結果，將杏香兔耳風有效部位提取物②、⑦、⑧原液用維持液(含2%胎牛血清的DMEM)分別配制成10，5，2.5，1.25，0.625，0,312，0.156，0.078mg/mL8個濃度的稀釋液，加入上述細胞中(0.1mL/L)，每個濃度重復6孔，同時設空白對照組和細胞對照；繼續(xù)置37'C，5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作用lld后，吸取培養(yǎng)上清液采用ELISA法檢測HBsAg和HBeAg，余下細胞用MTT法測定藥物對細胞生長的半數毒性濃度，向培養(yǎng)孔中加入400ug/mLMTT，O.lmL/孔，37°C，5。/oC02孵育4h，棄去MTT液，加入100%DMSO0.1mL/孑L，充分振蕩10min，用酶標儀570nm波長測定OD值，空白對照設6孔，加100%DMSO0.1mL/孔。按下式計算半數毒性濃度(TC50)。扯+丁^A古，。八細胞對照OD值一藥物實驗組OD值破壞百分率(％)=-X100%細胞對照OD值一空白對照組OD值50-<50%破壞百分率TC50=Antilog(B+-xc)>50%破壞百分率-<50%破壞百分率A=log>50%破壞百分率B=log<50%破壞百分率C=A_BHBsAg、HBeAg的檢觀L采用ELISA測定盒檢測，用酶標儀450/630nm雙波長測定每孔OD值，并計算藥物的半數有效濃度(IC50)。細胞對照OD值一藥物實驗組OD值。破壞百分率(％)=細胞對照OD值一空白對照組OD值X1(K)°50-<50%破壞百分率XC)TC5o=Antilog(B+>50%破壞百分率-<50%破壞百分率A=log>50%破壞百分率B=log<50%破壞百分率C=A—B治療指數(TI)=TC5Q/IC50結果見表3:表3杏香兔耳風有效部位提取物對HepG2-2.2.15細胞株作用評價藥物HBsAgHBeAgIC50(mg/ml)TIIC50(mg/ml)TI提取物②0.3851.580.5138.4319.60提取物⑦0.3068.270.4248.7620.48提取物⑧0.4620.980.6016.089.65結果表明，杏香兔耳風有效部位提取物⑦對HepG2-2.2.15細胞株的治療指數最高，其次是杏香兔耳風有效部位提取物②，杏香兔耳風有效部位提取物⑧對HepG2-2.2.15細胞株的治療指數最小。實驗例10:杏香兔耳風有效部位提取物體外抗HIV實驗研究藥物及試劑杏香兔耳風有效部位提取物②、⑦、⑧，AZT(疊氮胸苷)，RPMI-1640，MTT，DMSO細胞及病毒HIV-1IIB病毒，MT4細胞實驗方法1、杏香兔耳風有效部位提取物對MT4細胞的毒性測定MT4細胞按2X1()S個/mL接種于96孔板中，每孔O.lmL，加入杏香兔耳風有效部位提取物②、⑦、⑧(分別以DMSO連續(xù)2倍稀釋成10007.8ug/mL)，陽性對照藥AZT(疊氮胸苷)2倍稀釋為10007.8ug/mL,每個濃度接種6孔，同時設正常細胞對照，匿S0溶劑對照及空白MT4細胞對照(不加病毒)，置37°C，5。/oC02培養(yǎng)箱內培養(yǎng)6d，MTT法測定細胞活性，記CCso值。2、杏香兔耳風有效部位提取物對HIV誘導MT4細胞的抑制作用病毒毒力測定用10倍稀釋8個濃度HIV，在培養(yǎng)液RPMI-1640中觀察MT4細胞病變，計算TCID5Q為10—6，將MT4細胞2X105個/mL接種于96孔板中,每孔為O.lmL，分別加入1000TCIDso的HIV病毒100ul，同時設正常細胞對照和病毒對照，然后分別加入2倍稀釋5個濃度的杏香兔耳風有效部位提取物②、⑦、⑧及AZT100ul，每個樣品濃度均設3個平行孔，置37。C，5%002培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，72h后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)。CPE判定標準無合胞體形成"一"，無合胞體形成但細胞不規(guī)則"±"，有合胞體形成"+"。ECso的判定(1)只1孔為"+"，另兩孔為"一"或"一"與"±"，此藥物濃度可視為EC50。(2)3孔分別為"+"，"一"與"±"，此藥物濃度可視為EC50。(3)3孔均為"±"，此藥物濃度可視為EC50。(4)3孔均為"+"，下一個濃度作用下的3孔均為"一"，兩個濃度的中間值可視為EC50。選擇指數(SI)=CC5Q/EC50。結果見表4:表4杏香兔耳風有效部位提取物對在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對HIV-1誘導細胞病變作用評價藥物EC50(ug/mL)CC50(ug/mL)SIAZT0.15005000提取物②5.21000提取物⑦3.91000提取物⑧2.81000357結果表明，杏香兔耳風有效部位提取物⑦對在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對HIV-1誘導細胞病變的抑制作用最高，其次是杏香兔耳風有效部位提取物②，杏香兔耳風有效部位提取物⑧對在HIV-1/MT4培養(yǎng)系對HIV-1誘導細胞病變的抑制作用最小。實驗例11:杏香兔耳風有效部位提取物體外抗人乳頭瘤病毒實驗研究藥物及試劑杏香兔耳風有效部位提取物⑦，HPV核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒細胞及病毒尖銳濕疣混懸液實驗方法1、尖銳濕疣混懸液的制備人乳頭瘤病毒(HPV)感染是引起尖銳濕疣(CA)的主要病因，從江西省中醫(yī)院皮膚科采集來自于尖銳濕疣患者外陰部位的疣體標本(經鑒定為HPV6/11型)，集中到一只離心管中，稱重30mg，用玻璃勻漿器勻漿，再加入5ml生理鹽水，配成6mg/mL的離體CA混懸液，備用。2、杏香兔耳風有效部位提取物處理疣體的方法將杏香兔耳風有效部位提取物⑦原液稀釋成10，5,2.5，1.25,0.625，0.312，0.156，0.078mg/mL8個濃度的樣品液，用移液槍吸取25yl樣品液和25y1CA混懸液至1.5mL離心管中，振搖均勻，使樣品與疣體能充分作用，置37'C水浴箱培養(yǎng)，另設生理鹽水對照、溶媒對照，在樣品處理疣體l、3、5、7天后，各取一組進行以下試驗。3、HPV-DNA的提取從溫浴箱中取出經樣品處理的CA混懸液，按試劑盒步驟提取DNA:加入50nl生理鹽水，混勻后再加入100ylDNA提取液l，振搖均勻，1200r/min離心IOmin，棄去上清液，再加入25iilDNA提取液2，充分混勻，IOO'C沸水煮IOmin，1200r/min離心IOmin，上清液即為HPVDNA。4、定量標準曲線用熒光探針檢測定量，按照檢測試劑盒要求，設立4個系列濃度的HPV-DNA定量陽性標準品，依次為5Xl()7/mL，5X106/mL,5X105/mL，5X104/mL，經PCR檢測(其檢測靈敏度為lX10〃mL,結果小于該濃度者判定為陰性)。以起始拷貝數的自然對數為橫坐標，循環(huán)閾值為縱坐標，得到的回歸直線為標準曲線，據此對樣品的擴增倍數進行定量。5、DNA擴增取檢測試劑盒中的PCR反應液37.6lU，TaqDNA聚合酶O.4n1，UNG0.03ul于PCR反應管中，再加入HPV-DNA模板2ul，扣嚴管蓋，置于定量PCR儀上循環(huán)擴增。HPV-DNA經高溫變性、低溫退火及延伸進行循環(huán)擴增，循環(huán)程序設置為37°C，5min;94°C，1min;95°C，5sec;60。C，30sec，循環(huán)40次。結果見表5:表5杏香兔耳風有效部位提取物對HPV-DNA作用的評價培養(yǎng)時間(d)組別濃度(mg/mL)-135710————5———2.5---提取物⑦1.250.6250.3120.1562.2X1073.0X10fi一0.0781.8X1072.0X1065.8Xl(f6.4X10:5生理鹽水組\7.3X1073.2X1073.0X1076.2X107溶媒組\5.4X1071.4X1072.6X1075.0X107實驗結果表明，HPV經各樣品作用后，FQ-PCR檢測所測得的DNA數值，"一"代表檢測結果為陰性，病毒DNA被破壞而擴增受到抑制；陽性結果以DNA擴增的定量對數平均值表示(單位為"拷貝/mL")，病毒沒受到破壞，其DNA大量擴增。實驗例12:杏香兔耳風有效部位提取物對大鼠實驗性動脈血栓形成的影響取Wistar大鼠，按體重隨機分組，每組10只，對照組大鼠靜脈注射生理鹽水；給藥組靜脈注射杏香兔耳風有效部位提取液⑦4、8、16mg/kg，給藥體積均為0.1ml/100g。實驗時腹腔注射20%烏拉坦lg/kg麻醉，仰臥位固定，分離頸總動脈，將實驗性體內血栓形成儀的剌激電極和溫度探頭掛于頸總動脈上，給藥后10min開始刺激，刺激強度為2mA，刺激5min后關閉刺激開關，取下電極，3min后調節(jié)控溫表至零位，記錄動脈血栓形成時間。結果表明，大鼠靜脈注射杏香兔耳風有效部位提取液⑦4、8、16mg/kg后，與對照組比較，動脈血栓形成時間分別推遲15%(p>0.05)、70%(p<0.05)、90%(pO.Ol)，表明杏香兔耳風有效部位提取液⑦中、高劑量能明顯推遲大鼠實驗性動脈血栓形成時間。權利要求1、一種杏香兔耳風有效部位的制備方法，其特征在于該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材，加10％～80％乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A；步驟(2)取提取液A，減壓濃縮，得濃縮液B；步驟(3)取濃縮液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B上大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10％～90％乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥得杏香兔耳風有效部位。2、根據權利要求1所述的杏香兔耳風有效部位的制備方法，該制備方法依次包括以下步驟步驟(1)取杏香兔耳風藥材粗粉，加入10~20倍量的10%~80%乙醇進行滲漉或加熱回流提取，即得提取液A;步驟(2)取提取液A，減壓濃縮至藥材量的3~8倍，得到杏香兔耳風濃縮液B;步驟(3)取濃縮液B，先用石油醚萃取36次，再用乙酸乙酯萃取36次，分別合并萃取液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位；或步驟(3)取濃縮液B，過大孔吸附樹脂吸附，先用水洗至無色或顏色較淺，再用10%~90%乙醇洗，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥，即得杏香兔耳風有效部位。3、根據權利要求1或2所述的杏香兔耳風有效部位的制備方法，其特征在于杏香兔耳風有效部位含有1-80%的總酚酸。4、根據權利要求3所述的杏香兔耳風有效部位的制備方法，其特征在于杏香兔耳風有效部位含有綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩岬确铀犷惢衔?。5、根據權利要求4所述的杏香兔耳風有效部位的制備方法，其特征在于總酚酸類成分中含0.05%_20%的綠原酸和0.5%-50%的3，5-二咖啡?；鼘幩峒?，5-二咖啡?；鼘幩岬绕渌铀犷惢衔?。6、根據權利要求1或2所述的杏香兔耳風有效部位制備方法，其特征在于步驟(1)中杏香兔耳風藥材滲漉時間為l-15天，加熱回流次數為1-4次，加熱回流時間為1-3小時。7、根據權利要求l、2所述的杏香兔耳風有效部位制備方法，其特征是步驟(2)中減壓濃縮溫度是30-70°C。8、根據權利要求l、2所述的杏香兔耳風有效部位制備方法，其特征是步驟(3)中所使用的干燥方法為常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。9、根據權利要求1、2所述的杏香兔耳風有效部位，其中所述的大孔吸附樹脂主要包括AB-8、NKA-9、HPD-700、HPD-600、HPD-500、HPD-400等型號的大孔吸附樹脂，其中優(yōu)選NKA-9大孔吸附樹脂。10、根據權利要求l-5所述的杏香兔耳風有效部位，其特征在于具有抑菌、抗炎作用，對乙肝病毒、艾滋病毒、人乳頭瘤病毒等均具有明顯抑制作用，對心血管疾病也有一定的療效，可單獨或與其它藥物配合開發(fā)抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳頭瘤病毒、治療心血管疾病等新型藥物。全文摘要本發(fā)明涉及杏香兔耳風有效部位及其制備方法和應用，本發(fā)明①采用10％～80％乙醇進行滲漉或加熱回流提取；②用乙酸乙酯萃取或大孔吸附樹脂進行純化精制。該法采用水、酒精、乙酸乙酯等一般常用溶媒，具有操作簡單、流程短、成本低、有效成分含量高等優(yōu)點。該杏香兔耳風有效部位主要含綠原酸、3，5-二咖啡?；鼘幩岬确铀犷惓煞?，具有抑菌、抗炎作用，對乙肝病毒、艾滋病毒、人乳頭瘤病毒等均具有明顯抑制作用，對心血管疾病也有一定的療效，可單獨或與其它藥物配合開發(fā)抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳頭瘤病毒、治療心血管疾病等新型藥物。文檔編號A61P31/04GK101293003SQ20081010692公開日2008年10月29日申請日期2008年6月17日優(yōu)先權日2008年6月17日發(fā)明者楊世林,王躍生,暉簡,范玫玫,鄔秋萍,霞錢,毅饒,勇黃申請人:江西天佑藥業(yè)有限公司;江西本草天工科技有限責任公司