專利名稱：：一種新的探針?biāo)幬锝M合、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種新的"cocktail"探針?biāo)幬锝M合物，通過其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化來評價(jià)肝缺血預(yù)適應(yīng)和肝缺血再灌注損傷對大鼠CYP亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4體內(nèi)藥物代謝活性的影響。
背景技術(shù)：
：許多外源性物質(zhì)(xenobiotics)在體內(nèi)需經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化過程，肝臟是人體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化I相反應(yīng)的主要場所。參與生物轉(zhuǎn)化的酶類是由一個(gè)龐大的基因家族編碼調(diào)控的依賴細(xì)胞色素P450的混合功能氧化酶系統(tǒng)，其中主要成分是細(xì)胞色素P450(CYP)酶系。CYP在人類分為17個(gè)基因家族，42個(gè)亞家族，64個(gè)酶。其中與肝臟藥物代謝密切相關(guān)的功能酶有CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP2D6禾卩CYP3A4。在人體中許多因素如遺傳因素、年齡、性別、疾病和環(huán)境等都可以影響CYP酶的活性，因此對CYP的研究在臨床藥理學(xué)中具有重要的意義，它可以指導(dǎo)臨床合理用藥，提高藥物治療水平1.由藥物所致藥物代謝酶的活性增強(qiáng)/減弱或數(shù)量增多/減少，引起聯(lián)合用藥中藥物相互作用問題，為臨床制定合理的給藥方案提出要求。2.在分子水平研究藥物在不同種族或個(gè)體體內(nèi)的代謝規(guī)律，為實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化用藥提供指導(dǎo)。3.肝臟疾病狀態(tài)下，以CYP為主的肝臟藥物代謝酶活性和/或含量發(fā)生改變，導(dǎo)致藥物代謝功能的變化，往往與許多臨床用藥方案的重新調(diào)整息息相關(guān)。而且，目前歐美各國已經(jīng)把對CYP的活性測定用于新藥篩選及代謝研究，并把它列為新藥申報(bào)必須進(jìn)行的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。我國頒布的《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中也已積極倡導(dǎo)對CYP活性進(jìn)行研究。目前，用于研究CYP活性的方法主要分為體內(nèi)和體外研究兩大類。體外研究常用的方法有肝微粒體孵化，基因重組P450酶系，肝細(xì)胞培養(yǎng)和肝臟組織切片法。體外研究一般可以作為確定體內(nèi)試驗(yàn)研究方向的預(yù)試驗(yàn)而應(yīng)用，因?yàn)轶w外與體內(nèi)真實(shí)的生理環(huán)境還是有很大不同，如酸堿度、輔助因子等，另外，體內(nèi)還有II相代謝酶的存在，因此藥物的代謝可能會(huì)有所差異，這也限制了體外研究方法的廣泛應(yīng)用。體內(nèi)研究方法主要有基因分型法和4探針?biāo)幬锓??；蚍中头ㄊ侵苯訙y定特定的DNA的變異來評價(jià)藥物代謝酶的活性。但是個(gè)體代謝酶基因變異發(fā)生頻率較低，有很多還未被認(rèn)定而且是非特征性，再加上基因型檢測費(fèi)用高，并不是所有的基因型變異都導(dǎo)致表現(xiàn)型改變等都限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。因此現(xiàn)在最常使用的是直接測定體內(nèi)酶的活性(表現(xiàn)型)的方法即探針?biāo)幬锓?，它不僅考慮了基因而且還考慮了環(huán)境等因素對代謝酶活性的影響。目前探針?biāo)幬锓ㄓ种饕譃閮煞N。其中一種是單獨(dú)使用一種探針?biāo)幬?，即選用只被一種特定的酶亞型催化或者即使被幾種亞型酶催化但已確知其代謝途徑及其產(chǎn)物的物質(zhì)，通過測定其體內(nèi)的代謝速率，如在尿中、血中或者唾液中的原型物與代謝產(chǎn)物濃度的比值來作為評價(jià)該酶的活性的指標(biāo)；另外一種是"cocktail"法，即"雞尾酒"法，因?yàn)橥庠次镔|(zhì)的代謝需要多種酶共同參與，而且酶多具有底物特異性，單一的探針?biāo)幬镏荒芊从骋粋€(gè)或部分CYP酶亞型的活性，沒有一種藥物可以同時(shí)評價(jià)幾種酶的活性。實(shí)踐中又常需要有選擇性地了解多個(gè)CYP亞型酶的活性，于是發(fā)展出了同時(shí)給予多個(gè)探針?biāo)幬锏姆椒ǎ?cocktail"探針?biāo)幬锓?，該方法可以明顯減少分析周期，提高分析效率，更重要的是這種方法可以減少個(gè)體內(nèi)的差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。但同時(shí)"cocktail"探針?biāo)幬锓ㄒ灿泻芏嗖蛔阒?，如?gòu)成該cocktail的幾種藥物在代謝方面可能存在著相互作用，而且它對分析方法的敏感性和特異性要求較高，這樣就會(huì)提高分析成本。但有研究指出在滿足分析方法的各種要求前提下，潛在的相互作用可以通過控制藥物的劑量來降低，而且隨著現(xiàn)在許多高特異性和高靈敏度方法的使用，如液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法，相信對于"cocktail"建立一個(gè)有效的分析方法將不再是限制其應(yīng)用的主要因素。良好的血液循環(huán)是組織細(xì)胞獲得充足的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)并排除代謝產(chǎn)物的基本保證。各種原因造成組織器官血流灌流量減少時(shí)發(fā)生缺血性損傷，而恢復(fù)血液灌流后，細(xì)胞功能代謝及結(jié)構(gòu)破壞反而加重，出現(xiàn)缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury,IR)。肝移植或復(fù)雜的肝臟外科手術(shù)時(shí)不可避免的發(fā)生肝缺血再灌注損傷。肝缺血損傷和再灌注損傷是密切相聯(lián)的病理過程。目前認(rèn)為，肝臟再灌注損傷經(jīng)歷兩個(gè)階段再灌注初期，由活化的枯否氏細(xì)胞釋放的大量氧自由基和TNF-a、IL-1等細(xì)胞因子對肝細(xì)胞的直接損害；后期是由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的損傷。同時(shí)，有報(bào)道指出在肝缺血再灌注后，肝臟中CYP450的含量和活性明顯下降。隨著肝缺血再灌注損傷機(jī)制的逐漸成熟，各種預(yù)防及治療措施閂益增多，其中缺血預(yù)適應(yīng)(ischemicpreconditioning,IPC)即事先給予短時(shí)間缺血和再灌注，可以保護(hù)器官耐受隨后的長時(shí)間的缺血再灌注損傷。有研究指出，IPC可以抑制枯否氏細(xì)胞釋放TNF-a，而且可以在缺血后期誘導(dǎo)使有活性的AMP-K增加，這些都可以減少消耗ATP，從而減少乳酸在缺血過程中的蓄積，緩解灌注后期的肝損傷。雖然目前臨床上用于檢査肝功能的指標(biāo)有很多，卻不能特異性的反映肝臟的藥物代謝能力，因此采用"cocktail"法對體內(nèi)代謝酶活性進(jìn)行定量測定，研究肝臟疾病狀態(tài)對藥物代謝酶活性的影響，可以估計(jì)傳統(tǒng)的藥物劑量可能引起的毒性反應(yīng)，調(diào)整臨床用藥方案，對減輕藥物的不良反應(yīng)指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。一個(gè)理想的用于體內(nèi)藥物代謝酶活性測定的"cocktail"探針?biāo)幬镆缶邆湎铝袟l件(1)可得而且易得，并且只被一種特定的功能酶催化或即使被幾種功能酶催化但已確知其各條代謝途徑及其產(chǎn)物。(2)其代謝不受肝血流和蛋白結(jié)合的影響。(3)給藥和采樣應(yīng)簡單和無損傷，在給藥劑量下應(yīng)確保安全性。(4)在給予的劑量下應(yīng)對所檢測的功能酶的活性無影響。(5)對相應(yīng)的CYP功能酶活性或狀態(tài)的改變高度敏感。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種新的探針?biāo)幬锝M合物，研究了IPC和IR狀態(tài)下大鼠CYP五個(gè)主要亞型功能酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4體內(nèi)藥物代謝活性，旨在考察肝損傷時(shí)該五種主要亞型功能酶代謝功能活性的變化，建立評價(jià)肝臟藥物代謝功能的有效指標(biāo)，為臨床合理用藥提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的"cocktail"探針?biāo)幬锝M合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該藥物組合物的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的就是提供該藥物組合物在制備測定肝藥酶活性藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的探針?biāo)幬锝M合物，是由下列重量百分比的原料藥組成咖啡因5-15%、美托洛爾20-50%、氯唑沙宗10-30%、甲苯磺丁脲5-15%、咪達(dá)唑侖10-30%。優(yōu)選本發(fā)明的探針?biāo)幬锝M合物，由下述重量百分比的原料藥組成咖啡因3-12%、美托洛爾30-50%、氯唑沙宗15-25%、甲苯磺丁脲3-12%、咪達(dá)唑侖15-25%。最佳的本發(fā)明的探針?biāo)幬锝M合物，是由下述重量百分比的原料藥組成咖啡因10%、美托洛爾40%、氯唑沙宗20%、甲苯磺丁脲10%、咪達(dá)唑侖20%。本發(fā)明的探針?biāo)幬锝M合物的制備方法，包括以下步驟(1)稱取探針?biāo)幬锟Х纫?、美托洛爾溶于生理鹽水備用，(2)稱取氯唑沙宗和甲苯磺丁脲溶于無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入上述生理鹽水中(3)再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸?yōu)選本發(fā)明探針?biāo)幬锝M合物的制備方法，包括以下步驟(1)稱取探針?biāo)幬锟Х纫?0%、美托洛爾40%溶于生理鹽水備用；(2)取氯唑沙宗20%和甲苯磺丁脲10%溶于無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入上述生理鹽水中(3)再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖20%加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰?。上述所述的咖啡因原料?caffeine)、氯唑沙宗原料藥(chlorzoxazone)、美托洛爾原料藥(metoprolol)、甲苯磺丁脲原料藥(tolbutamide)、咪達(dá)唑侖原料藥優(yōu)選為咪達(dá)唑侖注射劑(midazolaminjection),均可以在上市購買。本發(fā)明的探針?biāo)幬锝M合物，其藥物制劑形式可以是任何口服制劑或注射劑。其中口服制劑包括但不限于片劑，糖衣片劑，薄膜衣片劑，腸溶衣片劑，膠囊劑，硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含片、口崩片、顆粒劑。沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、滴丸劑，微丸劑、栓劑、霜?jiǎng)婌F劑等；注射劑包括但不限于靜脈注射劑，粉針劑、皮下注射劑等。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e—環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物組合物制劑優(yōu)選溶液劑，特別是在給藥前要新鮮配置，配好后立即使用。肝臟微粒體混合功能氧化酶系統(tǒng)，有稱為依賴于細(xì)胞色素P450的單氧化酶系統(tǒng)，是一種多酶電子傳遞系統(tǒng)，是體內(nèi)重要的氧化一還原酶系，可以催化眾多的內(nèi)源性物質(zhì)如脂肪酸、膽固醇、膽汁酸及類固醇激素和外源性物質(zhì)如藥物的代謝。其中涉及體內(nèi)大多數(shù)藥物代謝的主要有3個(gè)基因家族(CYP1、CYP2、CYP3)。CYP1A2:人類CYP1家族中被發(fā)現(xiàn)的P450氧化酶有CYP1Al、CYP1A2和CYP1B1。其中CYP1A2與藥物代謝關(guān)系最為密切，它占肝臟總P450氧化酶含量的13%，參與許多藥物、類固醇激素及前致癌物的代謝。人體內(nèi)咖啡因卯％的消除是由CYP1A2介導(dǎo)的，CYP1A2在咖啡因的代謝過程中占絕對主導(dǎo)作用，所以咖啡因是首選的安全用于測定體內(nèi)CYP1A2活性的最理想的探針?biāo)幬?。CYP2C9:CYP2C9約占P450含量的20X，僅次于CYP3A。它能代謝許多不同性質(zhì)的藥物，并在前致癌物、前毒物和致突變劑的活化中也起一定作用。CYP2C9代謝的藥物包括但不限于，甲苯磺丁脲、苯妥英、華法林、托拉賽米、阿米替林、氟西汀、磺胺甲基異惡唑、睪酮和洛沙坦等。優(yōu)選苯妥英、華法林、甲苯磺丁脲作為CYP2C9代謝的藥物。最佳為甲苯磺丁脲，因?yàn)榧妆交嵌‰逶谌梭w內(nèi)幾乎僅以單一途徑代謝，甲基羥基化形成羥基甲苯磺丁脲，隨后由醇和醛脫氫酶氧化羥基甲苯磺丁脲為羧基甲苯磺丁脲，其中第一步反應(yīng)是限速步驟。此途徑能清除多達(dá)人體內(nèi)多達(dá)80%100%的甲苯磺丁脲，尿中甲苯磺丁脲主要以羧基化產(chǎn)物的形式存在。CYP2D6代謝藥物包括但不限于異喹胍、司巴丁、右美沙芬和美托洛爾等，優(yōu)選美托洛爾作為CYP2D6的探針?biāo)幬铩YP2E1:在CYP2E亞家族中，CYP2E1相對重要，它的底物較多，其中大部分為前致癌物和前毒物，少部分為藥物。優(yōu)選氯唑沙宗可作為CYP2E1的探針?biāo)幬?。CYP3A:CYP3A參與5060n/。臨床常用藥物的氧化代謝。CYP3A的底物廣泛性及其活性的高度差異直接關(guān)系其底物的臨床合理應(yīng)用和療效評價(jià)。咪達(dá)唑侖是短效鎮(zhèn)靜催眠藥，CYP3A4和CYP3A5都參與其體內(nèi)代謝反應(yīng)，主要代謝產(chǎn)物為l'-羥基咪達(dá)唑侖，其次為4-羥基咪達(dá)唑侖和1,4-二羥基咪達(dá)唑侖。咪達(dá)唑侖的肝臟萃取率較低(約為34%)。因此，優(yōu)選咪達(dá)唑侖作為CYP3A代謝藥物。本發(fā)明的五種探針?biāo)幬锟梢宰鳛橐粋€(gè)新的組合來同時(shí)檢測五種功能酶的活性，且不會(huì)發(fā)生探針?biāo)幬镩g代謝過程中的相互作用。下面通過3個(gè)試驗(yàn)例進(jìn)一步說明新的探針?biāo)幬锝M合物測定肝酶活性的作用。試驗(yàn)例1—3所涉及的探針?biāo)幬锝M合物均按照實(shí)施例制備。試驗(yàn)例一l.材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雌雄各半，體重200i20g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證0006909號。1.2藥品與試劑(1)咪達(dá)唑侖注射劑(midazolaminjection),5mg/lml/支，批號1614441，印度蘭伯西實(shí)驗(yàn)室有限公司生產(chǎn)，印度。(2)氯唑沙宗原料藥(chlorzoxazone)，山東魯南制藥廠，中國。(3)美托洛爾原料藥(metoprolol)，上海定康生物醫(yī)藥材料有限公司，中國。(4)甲苯磺丁脲原料藥(tolbutamide)，上海普康藥業(yè)有限公司，中國。9(5)咖啡因原料藥(caffeine)，山東新華制藥廠，中國。(6)地西泮原料藥(diazepam)，大同制藥廠，中國。(7)無水乙醇(dehydratedalcohol)，分析純，500ml/瓶，批號20040818，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，中國。(8)磷酸氫二銨(ammoniumphosphatedibasic)，分析純，500g/瓶，批號20040401，天津市北方化玻采購銷售中心，中國。(9)磷酸(phosphonicacid)，分析純，500ml/瓶，批號20040912，石家莊化工廠，中國。(10)甲醇(methanol)，分析純，500ml/瓶，批號20041030，江蘇淮陰塑料制品廠精細(xì)華工研究所，中國。(11)氯仿(chloroform)，分析純，500ml/瓶，批號20030331，天津化學(xué)試劑有限公司，中國。1.3儀器a)WZ-C型微量注射機(jī)，浙江醫(yī)科大學(xué)醫(yī)療儀器廠，中國b)Agilent1100HPLC工作系統(tǒng)，Agilent公司，美國c)CAY-1型液體快速混合器，北京長安儀器廠，中國d)B600型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，白洋離心機(jī)廠，美國e)K-550-GE漩渦混合器，ScientificIndustriesInc，美國f)CSF-1B超聲波發(fā)生器，上海超聲波儀器廠，中國g)PB153-S精密分析天平，METTLERTOLEDO，瑞士h)TN-100型托盤扭力天平，上海第二天平儀器廠，中國i)微量加樣器，HOMECHIOBA-KM，閂本2.方法2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2丄1探針?biāo)幬锶芤旱呐渲迫?shí)施例(1)的探針?biāo)幬锝M合物。2.2.2動(dòng)物模型的建立及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、缺血預(yù)處理組和缺血再灌組，每組18只，禁食過夜后用25%烏拉坦麻醉，固定在手術(shù)臺(tái)上，腹正中切口，分離肝十二指腸韌帶，充分暴露肝門部，仔細(xì)分出支配肝左、中葉的門靜脈、肝動(dòng)脈以及膽管。2.2.2.1正常組不做手術(shù)處理，其他處理相同，按照給藥方案項(xiàng)下內(nèi)容給藥。2.2.2.2缺血預(yù)適應(yīng)組(IPC組)用無損傷小動(dòng)脈夾阻斷5min后，再灌注5min，重復(fù)兩次，再阻斷45min，開放再灌注2小時(shí)h后給藥。2.2.2.3缺血再灌組(IR組)用無損傷動(dòng)脈夾阻斷45min,開放再灌注2小時(shí)h后給藥。2.3給藥方案尾靜脈注射混合探針?biāo)幬锶芤?，給藥量為0.5ml/100g，給藥速度為4ml/h，劑量分別為咖啡因、甲苯磺丁脲2.5mg/kg，氯唑沙宗、咪達(dá)唑侖5mg/kg，美托洛爾10mg/kg。2.4血漿樣品采集分別于注射探針?biāo)幬锖?、5、10、20、30、45min和1、1.5、2、3、5、8、10、22h股靜脈取血至含肝素的離心管中，3500卬m離心10min，分離血漿，按文中下述"血漿樣品預(yù)處理"程序操作，測定。血漿樣品采集方案見表l:2.5組織樣品采集于缺血再灌注24小時(shí)h后取肝組織少量，甲醛固定，切片，HE染色后于光鏡下行病理學(xué)檢査。2.6血清ALT的測定缺血再灌注24小時(shí)h后下腔靜脈取血lml，離心，取血清100pl，采用賴氏微量法，按照試劑盒的說明書進(jìn)行血清ALT的測定。2.7血漿藥物濃度的測定表1血槳樣品采集方案11菜錄時(shí)l、il動(dòng)物編號7K汗n、j|。j1~67~1213~182min△5min△10minA20min△30min△45min△lh△1.5h△2h△3h△5h△8h△10h△22h△注A代表采樣點(diǎn)。3.數(shù)據(jù)處理.3.1全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，以S士SD表示。3.2應(yīng)用中國藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)編制的實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)程序(3P97)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。各參數(shù)計(jì)算公式如下(1)01=2.303><斜率(2)(3-2.303x斜率(3)A^a與縱軸截距(4)B-p與縱軸截距(5)K2尸爭Ba(6)A+BK21(7)K12=a+(i-K21-Ke(8)CLs=^~,、t0.693,、0.693(9)IV鄰二""^(10)T1/2a=——(11)Vd=Vc&(12)VcD(3A+BAB(13)AUC=，+三a(33.3各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用One-WayANOVA進(jìn)行組間均值比較。當(dāng)總體上存在顯著性差異，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane'sL法，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。P<0.05表示有顯著差異，PO.01有高度顯著差異。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.5軟件計(jì)算。3.4采用SPSS11.5軟件，將血漿ALT與總體清除率CLs進(jìn)行相關(guān)性分析。PO.05表示有顯著差異，PO.01有高度顯著差異。4、結(jié)果4.1肝組織病理結(jié)果從附圖l一3病理切片中可見對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈清晰向外呈放射狀走行，肝細(xì)胞索呈單層相互連接成網(wǎng)狀，肝細(xì)胞胞漿豐富。肝缺血預(yù)適應(yīng)組表現(xiàn)為肝小葉大體結(jié)構(gòu)存在，中央靜脈清晰，肝板排列疏松，部分細(xì)胞膜界不清，局部肝細(xì)胞輕度水腫伴肝竇擴(kuò)張，肝竇內(nèi)枯否氏細(xì)胞增生，并見少行淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。缺血再灌組小葉結(jié)構(gòu)尚存，中央靜脈擴(kuò)張，中央靜脈內(nèi)大量肝細(xì)胞氣球樣變，部分細(xì)胞發(fā)生液化性壞死。部分肝竇擴(kuò)張，其內(nèi)見大量淋巴細(xì)胞和枯否氏細(xì)胞增生。4.2血清ALT水平表2不同實(shí)驗(yàn)組血清ALT濃度(IU/L)(n=6)分組對照組IPC組IR組ALT17.21±2.8633.88士6.86"72.91±14.42**AA注表示與對照組比P0.05，表示PO.01;A表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比P<0.05，M表示PO.Ol。試驗(yàn)例二藥物濃度的測定1.色譜條件l.l色譜柱C!8反相色譜柱(250x4.6mm，5pm)1.2流動(dòng)相甲醇0.05mol/L磷酸氫二銨緩沖液(pH=3.4;65:35，v/v)1.3流速1.0ml/min1.4檢測波長230nm1.5柱溫30°C1.6進(jìn)樣量4(^12.溶液配制2.1磷酸氫二銨緩沖液的配制稱取磷酸氫二銨2.64g，以400ml雙蒸水溶解，加85%磷酸1.4ml,調(diào)節(jié)pH值為3.4。2.2地西泮內(nèi)標(biāo)溶液(IS)的配制精密稱取地西泮10mg，以無水甲醇溶解并定容至10ml容量瓶中，得lmg/ml內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。分別精密吸取適量內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，以無水甲醇定容為濃度100pg/ml和200嗎/ml的內(nèi)標(biāo)工作液，置4'C冰箱中保存。142.3各探針?biāo)幦芤号渲梅謩e制備濃度為lmg/ml的咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖的儲(chǔ)備溶液，除咪達(dá)唑侖用水溶解外其余的全部以甲醇作為溶劑。然后采用倍半稀釋法以水作為溶劑稀釋各探針?biāo)幬锏膬?chǔ)備液，咖啡因配制成濃度分別為250、100、50、25、10、5、2.5、lpg/ml的工作液、氯唑沙宗配制成濃度分別為500、250、100、50、25、10、5、2.5、lpg/ml的工作液，甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖配制成濃度分別為250、100、50、25、10、5、2.5嗎/ml的工作液。3、樣品預(yù)處理準(zhǔn)確吸取空白血漿200W，加入含濃度為200pg/ml的地西泮內(nèi)標(biāo)溶液2(Vl，渦旋振蕩30s，加入2ml提取溶劑氯仿，于快速液體混合器混勻2min后3500rpm，離心10min。取上層有機(jī)相18(^1置玻璃離心管中，置40'C水浴中以氮?dú)獯蹈伞堅(jiān)?8(^1流動(dòng)相復(fù)溶，40^1進(jìn)樣，記錄色譜圖。4.血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備按表2分別取咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖工作液各4(V1混勻，氮?dú)庀麓蹈?，加入大鼠空白血漿200ji1，制備成濃度為100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1)ag/ml的混合探針?biāo)幬镅獫{標(biāo)準(zhǔn)液，按"樣品預(yù)處理"項(xiàng)下操作。以咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為橫坐標(biāo)，藥物濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液配置取液量血漿標(biāo)準(zhǔn)液體積探針?biāo)幬锕ぷ饕簼舛?pg/ml)目標(biāo)濃度(^g/ml)(Hl)(nl)1402000.22,5402000.55402001104020022540200504020010勵(lì)40200202504020050500402001006、探針?biāo)幬镅獫{濃度測定結(jié)果6.1五種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別以咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖與內(nèi)標(biāo)地西泮峰面積比為橫坐標(biāo)，以藥物濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在濃度范圍內(nèi)，各探針?biāo)幬锓迕娣e/峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系。得到的五種探針?biāo)幬锏难獫{標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)見表4一8。表4咖啡因血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)()±SD，n=3)血漿濃度(Hg/ml)峰面積比(R)RSD(%)0.20.00569±0.0006711.740.50.01080±0.0014813.6610.024IO土O.OO1295.3420.05120±0.002224.3350.13341土0.002752.06100.25309±0.016206.40<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表6甲苯磺丁脲血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)(X±SD，n=3)血漿濃度Og/ml)峰面積比(R)RSD(%)0.50.01043±0.0012511.9910.01361±0週6312.0120.02822±0.002087.360.09039±0.007918.75100.19449±0.015978.217.31200.40755±0.029777.75501.02580±0.07951Y=48.345X+0.4151R=0.9999表7美托洛爾血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)((土SD，n=3)血漿濃度(Hg/ml)峰面積比(R)RSD(%)0.50.01166士0細(xì)169.9810.02066±0.000371.8110.6020週94±0.004134.4950.12050±0.005417.19100.24722±0.017788,94200.50482±0.045132.41501.26994±0.03061Y=39,178X+0.253R=0.9999表8咪達(dá)唑侖血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)(S±SD，n=3)血漿濃度(Hg/ml)峰面積比(R)RSD(%)0.50.00689±0,0009313.5610.01736±0.0018910.8920.03435±0,002547.390.07589±0.004596.04100.1876士0.0246013.148.66200.37642±0.032597.68500.79053±0.06069Y=24.947X+0.2081R=0.99996.2咖啡因正常對照組和缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌組給予探針?biāo)幬锟Х纫虻难獫{濃度測定結(jié)果見表9，血漿濃度-時(shí)間曲線比較見附圖4:表9各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿咖啡因濃度(ng/ml)(;士SD，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>濃度相差倍數(shù)分別為12、8.5和6.5倍，三組曲線在02h時(shí)間段重疊，2h后開始分離，最大差別的百分比為90.91%。6.2氯唑沙宗J下常對照組和缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌組給予探針?biāo)幬锫冗蛏匙诘难獫{濃度測定結(jié)果見表IO，血漿濃度-時(shí)間曲線比較見附圖5:表IO各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿氯唑沙宗濃度(pg/ml)(x士SD，n=6)時(shí)間(h)正常組IPC組IR組0扁12.10±1.1211.34±1,4711.26±0.910.0831.76±1.1410.35±1.5710.34±0.730.16710.51±0.689.14士1.109.39士0.630,3339.45±0.527.70±1.088.38±0,450.57.90±0.497.10±0.987.43±0.510.756,36±0.486.30±1.156.75±0.4715.64±0.245,35±0,795.89±0.321.54.70±0.614.73±0.204.23±0.3522.55±0.363.17±0.493.82土0.3631.63±0.322.13士0.283.05±0.4550.84±0.101.47±0.222.75±0.3821根據(jù)以上表和附圖5中的數(shù)據(jù)可以觀察到大鼠靜脈注射氯唑沙宗(5mg/kg)后的血漿濃度一時(shí)間半對數(shù)圖是一條曲線。曲線變化的拐點(diǎn)時(shí)間是2h，正常組、IPC組和IR組首末濃度相差倍數(shù)分別為14.5、8和4倍，三組曲線在02h時(shí)間段重疊，2h后開始分離，最大差別的百分比為227.38%。6.3甲苯磺丁脲正常對照組和缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌組給予探針?biāo)幬锛妆交嵌‰宓难獫{濃度測定結(jié)果見表ll，血漿濃度-時(shí)間曲線比較見附圖6:表11各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿甲苯磺丁脲濃度(pg/ml)(;士SD，n=6)時(shí)間正常組IPC組IR組(h)0.03325.89±2.3025.15±3.8425.41±2.90.08324.78±2.5924.45±3.8224.34±3,120.16721.59±2.3522.48±3.6822.27±3.700.33318.88±0.5420.14±3.3419.54±3.660.516.77±0.8018.46土3.3618.48±3.380.7514.50士0.8114.97±3.0817.40±2.78113.25±0.3112.97±1,7814.87±1.381.511,41±1.1111.38±0.6312.85±1.4829.90±0.9410.16±0.8710.60±1.438.39±0.748.67±0.789.33±1.5657.38±0.567.44士0.447.50±U686.27土0,426.24士0.616.77±1.18103.38±0.524,12±0.485.11±0.80222.28±0.232.26土0.542.80±0.45根據(jù)以上表和附圖6中的數(shù)據(jù)可以觀察到大鼠靜脈注射甲苯磺丁脲(2.5mg/kg)后的血漿濃度一時(shí)間半對數(shù)圖是一條曲線。曲線變化的拐點(diǎn)時(shí)間是3h，正常組、IPC組和IR組首末濃度相差倍數(shù)分別為11、11和9倍，三組曲線在05h時(shí)間段重疊，5h后開始分離，最大差別的百分比為51.18%。6.4美托洛爾正常對照組和缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌組給予探針?biāo)幬锩劳新鍫柕难獫{濃度測定結(jié)果見表12，血漿濃度-時(shí)間曲線比較見附圖7:表12各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿美托洛爾濃度(嗎/ml)(S士SD，n=6)時(shí)間正常組IPC組IR組(h)0.0333.85土0.233.93±0.303.95±0.370.0833.65±0.273.67±0,203.70±0.310.1673.38±0.233.42±0.273.38±0.280.3332.78土0J02.96±0.183.17±0.290.52.41±0.112.66±0.082.69±0.19230.752.06±0.202.36±0.172.43±0.1511Z77士0.222.03士0.162.10±0.121.51.56±0.211.69±0.161.93±0.2521.07±0.081.29±0.091.52±0.130.85±0.181.00±0.101.24±0.10根據(jù)以上表和附圖7中的數(shù)據(jù)可以觀察到大鼠靜脈注射美托洛爾(10mg/kg)后的血漿濃度一時(shí)間半對數(shù)圖是一條曲線。曲線變化的拐點(diǎn)時(shí)間是lh，正常組、IPC組和IR組首末濃度相差倍數(shù)分別為4.5、4禾H3.2倍，三組曲線在00.167h時(shí)間段重疊，0.167h后開始分離，最大差別的百分比為45.88%。6.5咪達(dá)唑侖正常對照組和缺血預(yù)適應(yīng)、缺血再灌組給予探針?biāo)幬镞溥_(dá)唑侖的血漿濃度測定結(jié)果見表13，血漿濃度-時(shí)間曲線比較見圖8:表13各實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿咪達(dá)唑侖濃度(ug/ml)(工土SD，n=6)時(shí)間正常組IPC組IR組(h)0.0333.33±0.203.29±0.283.51±0.140.0832.67±0.252.86±0.213.05±0.260.1672.31±0.282.39±0.172.56±0.230.3332.03±0.082.12±0.112.24±0.240.51.67±0.091.88±0.101.99±0.240.751.45±0.101,65±0.091.70±0.1811.11±0.121.26±0.111.47土0.101.50.63±0.080.90±0.101.23±0.1120.40±0.100.6±0.100.92±0.17根據(jù)以上表和附圖8中的數(shù)據(jù)可以觀察到大鼠靜脈注射咪達(dá)唑侖(5mg/kg)后的血漿濃度一時(shí)間半對數(shù)圖是一條曲線。曲線變化的拐點(diǎn)時(shí)間是lh，正常組、IPC組和IR組首末濃度相差倍數(shù)分別為8.3、5.4和3.8倍，三組曲線在(M).333h時(shí)間段重疊，0.333h后開始分離，最大差別的百分比為130%。試驗(yàn)例三探針?biāo)幬镏饕幋鷦?dòng)力學(xué)參數(shù)應(yīng)用3P97藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件對試驗(yàn)例2中五種探針?biāo)幬镅獫{濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，經(jīng)AIC、F檢驗(yàn)綜合判斷，選擇權(quán)重為1"2進(jìn)行計(jì)算，所得結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，藥物代謝基本符合一級動(dòng)力學(xué)過程二房室模型。其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別見表14一18:表14大鼠靜脈注射咖啡因(2.5mg/kg)后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(X士SD，n=6)主要參數(shù)單位對照組肝缺血預(yù)適應(yīng)組肝缺血再灌組V(c)L/kg0.468±0.0620.454±0.0460.445±0.055T曙h7.472±2.4018.33U2.3859.021±1細(xì)K10/h0.147±0.0400.124±0.0380.108±0.026AUC嗎/ml/h38.182±6.82149.712士8,210"58.180±1.855"'25CLsL/kg/h0.067±0.012丁l/2(a)K21/hK12/h0.409士0.3602.452±2.2281.011±1.1600.060±0.0140.197±0.2054.725±3.1361.564±1.151MRT,(o-t)9.926士3.0906.628±0.64511.309±3.4647.135±0.7680.044±0.0020.122±0細(xì)4.296±2.2421.530±1.114AUC(o,嗎/ml/h40.310±6.55549.379±9.56755.832士6.913AUC(o.t)嗎/ml/h35.107±2.83341.411±4.565"46.247±3.406*'12.063±2.5597.528±0.544注AUC為積分法計(jì)算數(shù)據(jù)，AUC(o.oo)和AUC(o-t)為梯型法計(jì)算數(shù)據(jù),'表示與對照組比P〈0.05，"表示PO.01;a表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比P<0.05，m表示P<0.01。表15大鼠靜脈注射氯唑沙宗(5mg/kg)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(X士SD，n=6)主要參數(shù)單位對照組肝缺血預(yù)適應(yīng)組肝缺血再灌組V(c)L/kg0.395±0.0370.464±0.059Tww)h2.208±0.6096.892士1.480"K10/h0.658±0.0450.355±0.034*:0,445土0.0367.247±2.222*'0.234±0.050**zAUCng/ml/h19.338±0.99730.874土3.758"49.747士9.109'CLsL/kg/h0.259±0.0130.164±0.0190.103±0.0201/2(a)h0.494±0.1940.779士0.1340.472±0.136''K.■21/h0.970±0.8040.277±0.1100.708±0.275K12/h0.417±0.2470.385±0.082Q.732土0.210AUC(o."嗎/ml/h19.600±1.63727.683士2.988"47.955士7.321'AUC(o.t)嗎/ml/h17.753±1.49122.355士1.946"33.703±2.883*MRT,(O-oo)1.908±0.1414.498±0.7668.102±1.596MRT,(o-t)1.356±0.0722.325±0.193;.546±0.223注AUC為積分法計(jì)算數(shù)據(jù)，AUC(o—和AUC(o.t)為梯型法計(jì)算數(shù)據(jù),'表示與對照組比P〈0.05，"表示PO.01;'表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比P0.05，^表示P0.01,主要參數(shù)單位對照組肝缺血預(yù)適應(yīng)組肝缺血再灌組V(c)L/kg0.103±0.0120.099±0.0160.102±0.013T1/2(p)h10.968±1.7089.999±1.84512.219±2.539■K10/h0.167±0.0210.171±0.0340.133±0.012*AAUC嗎/ml/h147.475±14.428154.134±21.016187.697±23.986*CLsL/kg/h0.017±0.0020.017士0.0021/2(a)K211/hK121/h0.725±0.2990.521±0.1020.417±0.1590.584±0.1480.556±0.2190.696士0.1860.014±0.0020.704士0.1000.444±0.0980.481±0.070AUC(")嗎/ml/h151,611±14.526158.802±22.870189.877±24.316*AUC,)嗎/ml/h118.271±9.162124.581士6.916140.304±18.541*MRT,(O管oo)MRT'(o-t)13.456±1.75713.312±3.4036.989士0.2417.038±0.54215.881±3.5107.415±0.334注AUC為積分法計(jì)算數(shù)據(jù)，AUC(")和AUC(。-t)為梯型法計(jì)算數(shù)據(jù)c'表示與對照組比P0.05，"表示PO.01;A表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比P<0.05,M表示PO.01。表17大鼠靜脈注射美托洛爾(10mg/kg)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(X±SD，n=6)主要參數(shù)單位對照組肝缺血預(yù)適應(yīng)組肝缺血再灌組V(c)L/kg2.430±0.1792.551±0.1812.452±0.245T1/2(wh1.70U0.5442.772±0.3413.332±0.923K10/h0.615±0.0750.400±0.0710.357±0.071AUC嗎/ml/h6.791±0.84510.064±1.579'*11.753±1.637"ACLsL/kg/h1.491±0.1771.045±0.086"0.864±0.111"八T1/2(a)h0.168±0,0600.520土0.154"0.348±0.218K211/h3.503±1.9400.810±0.2551.991±1.556K121/h1.070±0.6040.445±0.1600.卯0±0.612AUC(")嗎/ml/h6.837±0.7309.677士0.954"11.272±1.070**AAAUC,嗎/ml/h5.007±0.1797.217士0.458"8,119±0.327"AAMRT—)h2.261±0.5773.573士0.57廣3.856土0.568"MRT附、h1.093±0.0421.727士0.049"1.839±0.065**A注AUC為積分法計(jì)算數(shù)據(jù)，AUC(o一和AUC(o.t)為梯型法計(jì)算數(shù)據(jù)。'表示與對照組比P〈0.05，"表示P〈0.01;a表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比P<0.05，aa表示PO.Ol。表18大鼠靜脈注射咪達(dá)唑侖(5mg/kg)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(；士SD，n=6)主要參數(shù)單位對照組肝缺血預(yù)適應(yīng)組肝缺血再灌組V(c)L/kg0.435±0.2411.271士0.535'1.304士0.099"T曙h0.745±0.1181.307±0.6121.641±0.528*K10/h1.698±0.4451.537士1.5380.720±0.134*AUC嗎/ml/h2.990±0.1153.939士0.528'5.467±0.836"A29CLsL/kg/h1.289士0,1790.966±0.1130.769±0.177T1/2(a)0.026±0扁0,235±0.2570.151±0.130K..211/h12.695±6.714U.453土11.6025.298±4.357K121/h27.722±33.52718.575±36.3683.108±2.782AUC(")嗎/ml/h2.919±0.2193,866±0.3985.423±0.755AUC(o.t)嗎/ml/h2.492±0.0963.379±0.2064.081±0.202*MRT,h1.014±0.1601.395±0.2872.109±0.559MRT,(o-t)h0.670士0.0440.954±0.0491.089±0.065注AUC為積分法計(jì)算數(shù)據(jù)，AUC(o,和AUC(o-t)為梯型法計(jì)算數(shù)據(jù)。^表示與對照組比P0.05，"表示P〈0.01;a表示與肝缺血預(yù)適應(yīng)組比PO.05，aa表示PO.01。試驗(yàn)例四血清ALT與各探針?biāo)幬顲Ls進(jìn)行相關(guān)性分析以三個(gè)實(shí)驗(yàn)組血清ALT與各探針?biāo)幬镉?jì)算出的總體清除率CLs進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示ALT與CLs具有高度相關(guān)性，見附圖9一12。本試驗(yàn)例1一4中，各探針?biāo)幬飳φ战M、IPC組和IR組相比，血漿清除率CLs依次降低，AUC依次增加，而且藥物各組間都具有顯著性差異。在消除相，丁1/2依次延長，K10依次減小。本實(shí)驗(yàn)血清ALT水平測定和肝組織病理切片結(jié)果也表明IR造成較嚴(yán)重的肝細(xì)胞損傷，而IPC對該損傷有一定的緩解和保護(hù)作用。而且通過對三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的ALT與藥物的CLs進(jìn)行相關(guān)性分析得出各藥物的CLs與ALT呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明了，隨著損傷程度的加重，CYP五個(gè)主要功能酶的體內(nèi)的藥物代謝能力降低，從而使得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)生相應(yīng)變化。這些結(jié)果都提示，五種特異性探針?biāo)幬锟Х纫?、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖，采用"cocktail"探針?biāo)幬锓?，由血藥濃度推算得到的各藥物的藥代?dòng)力學(xué)參數(shù)變化可以作為評價(jià)IPC和IR對肝臟CYP五個(gè)主要功能酶的體內(nèi)藥物代謝功能的有效指標(biāo)，為臨床上定量評價(jià)不同疾病狀態(tài)下肝微粒體酶藥物代謝功能并以其為依據(jù)制定個(gè)體化給藥方案提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。通過進(jìn)一步的分析還可以發(fā)現(xiàn)，IR損傷對CYP五個(gè)主要功能酶藥物代謝能力影響的程度和速度是不同的，CYP2D6和CYP3A在IR后代謝能力降低出現(xiàn)的較快，而CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4代謝能力降低幅度較大。而對CYP2E1的影響較小。本發(fā)明的有益效果1、本發(fā)明采用"cocktail"探針?biāo)幬锝M合物，使用五種特異性探針?biāo)幬锟Х纫?、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖，研究了IPC和IR狀態(tài)下大鼠CYP五個(gè)主要功能酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A體內(nèi)藥物代謝活性，考察肝損傷時(shí)該五種主要功能酶代謝活性的變化，建立評價(jià)肝臟藥物代謝功能的有效指標(biāo)，為臨床合理用藥提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)2、本發(fā)明的五種特異性探針?biāo)幬锝M合物咖啡因、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、美托洛爾和咪達(dá)唑侖，其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以作為評價(jià)IPC和IR對肝臟CYP酶系五個(gè)主要功能酶的體內(nèi)藥物代謝功能的有效指標(biāo)。3、本發(fā)明中的IR使肝臟CYP酶系五個(gè)主要功能酶的體內(nèi)藥物代謝活性明顯降低，而IPC對上述影響具有一定的緩解和保護(hù)作用。4、本發(fā)明中的ALT可以粗略地、定性地、間接地估計(jì)肝損傷藥物代謝情況。附圖1大鼠正常對照組給五種探針?biāo)?4h后肝組織病理切片(HE染色x200)附圖2大鼠肝缺血預(yù)適應(yīng)組給五種探針?biāo)?4h后肝組織病理切片(HE染色x200)附圖3大鼠缺血再灌組給五種探針?biāo)?4h后肝組織病理切片(HE染色x200)附圖4血漿咖啡因濃度-時(shí)間半對數(shù)曲線圖附圖5血漿氯唑沙宗濃度-時(shí)間半對數(shù)曲線圖附圖6血漿甲苯磺丁脲濃度-時(shí)間半對數(shù)曲線圖附圖7血漿美托洛爾濃度-時(shí)間半對數(shù)曲線圖附圖8血漿咪達(dá)唑侖濃度-時(shí)間半對數(shù)曲線圖附圖9咖啡因CLS與肝臟ALT相關(guān)性分析(11=-0.646,PO.01)附圖10氯唑沙宗CLS與肝臟ALT相關(guān)性分析(R--0.875,PO.01)附圖11甲苯磺丁脲CLS與肝臟ALT相關(guān)性分析(R;0.552，PO.05)附圖12美托洛爾CLS與肝臟ALT相關(guān)性分析(R二0.744,PO.05)附圖13咪達(dá)唑侖CLS與肝臟ALT相關(guān)性分析(R二0.677,PO.01)具體實(shí)施例下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而對本發(fā)明并沒有限制。實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?mg、美托洛爾20mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗10mg和甲苯磺丁脲5mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液2ml(10mg)加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸Ｈ芤河诮o藥前新鮮配制，配好后立即使用。實(shí)施例2準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?mg、美托洛爾50mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗30mg和甲苯磺丁脲5mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液2ml(10mg)加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰?。溶液于給藥前新鮮配制，配好后立即使用。實(shí)施例3準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?5mg、美托洛爾20mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗20mg和甲苯磺丁脲15mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液30mg加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸Ｈ芤河诮o藥前新鮮配制，配好后立即使用。實(shí)施例4準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?mg、美托洛爾35mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗25mg和甲苯磺丁脲12mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液25mg加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸Ｈ芤河诮o藥前新鮮配制，配好后立即使用。實(shí)施例5準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?2mg、美托洛爾45mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗15mg和甲苯磺丁脲3mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液25mg加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸Ｈ芤河诮o藥前新鮮配制，配好后立即使用。實(shí)施例6準(zhǔn)確稱取探針?biāo)幬锟Х纫?5mg、美托洛爾50mg溶于6ml生理鹽水，稱取氯唑沙宗15mg和甲苯磺丁脲15mg溶于2ml無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入生理鹽水中，再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖注射液5mg加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸Ｈ芤河诮o藥前新鮮配制，配好后立即使用。權(quán)利要求1、一種探針?biāo)幬锝M合物，其特征在于，所述的組合物是由下述重量百分比的原料藥組成咖啡因5-15％、美托洛爾20-50％、氯唑沙宗10-30％、甲苯磺丁脲5-15％、咪達(dá)唑侖10-30％。2、如權(quán)利要求1所述的探針?biāo)幬锝M合物，其特征在于所述的組合物是由下述重量百分比的原料藥組成咖啡因3-12%、美托洛爾30-50%、氯唑沙宗15-25%、甲苯磺丁脲3-12%、咪達(dá)挫侖15-25%。3、如權(quán)利要求1所述的探針?biāo)幬锝M合物，其特征在于所述的組合物是由下述重量百分比的原料藥組成咖啡因10%、美托洛爾40%、氯唑沙宗20%、甲苯磺丁脲10%、咪達(dá)唑侖20%。4、一種探針?biāo)幬锝M合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)稱取探針?biāo)幬锟Х纫?、美托洛爾溶于生理鹽水備用，(2)稱取氯唑沙宗和甲苯磺丁脲溶于無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入上述生理鹽水中(3)再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸?、如權(quán)利要求4所述的一種探針?biāo)幬锝M合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)稱取探針?biāo)幬锟Х纫?0%、美托洛爾40%溶于生理鹽水備用；(2)取氯唑沙宗20%和甲苯磺丁脲10%溶于無水乙醇，將無水乙醇緩緩加入上述生理鹽水中(3)再準(zhǔn)確吸取咪達(dá)唑侖20%加入上述混合液，配制成"cocktail"探針?biāo)幰骸?、如權(quán)利要求l一3所述的任意探針?biāo)幬锝M合物制成藥學(xué)上可接受的制劑。7、如權(quán)利要求6所述的探針?biāo)幬锝M合物制劑，其特征在于所述的制劑為溶液劑。8、如權(quán)利要求l一3任意一項(xiàng)探針?biāo)幬锝M合物在制備測定肝藥酶活性藥物上的應(yīng)用。9、如權(quán)利要求6所述的制劑在制備測定肝藥酶活性藥物上的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的“cocktail”探針?biāo)幬锝M合物，是由咖啡因、美托洛爾、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達(dá)唑侖組成，通過組合物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化來評價(jià)肝缺血預(yù)適應(yīng)和肝缺血再灌損傷對大鼠CYP亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4體內(nèi)藥物代謝活性的影響。文檔編號A61K49/00GK101596321SQ20081011043公開日2009年12月9日申請日期2008年6月3日優(yōu)先權(quán)日2008年6月3日發(fā)明者穎劉,婁建石,張才麗,焦建杰申請人:婁建石