專利名稱：殼聚糖含鈣膠體支架材料的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種骨再生、骨缺損修復用的體內骨生物反應器誘導成骨材料，特別涉及一 種可吸收可注射的殼聚糖含鈣膠體支架材料。
背景技術：
先天、外傷、炎癥及腫瘤等原因造成的長骨及扁骨缺損的修復是長期困擾臨床醫(yī)師的難題。如何獲得足夠量的供骨以用于移植充填骨缺損，同時滿足缺損受區(qū)骨質的塑形、強度和/或承重等形態(tài)功能的長期要求，且不引起免疫排斥是一直以來的研究熱點。自體骨移植是臨床常用的傳統(tǒng)骨缺損移植修復法，供骨區(qū)有髂骨、腓骨、肋骨、顱骨等，可提供松質骨、皮質骨和全骨。因為自體移植，故無移植免疫排斥反應，若受區(qū)血供良好， 有健康的軟組織覆蓋，則骨愈合速度快；但供骨來源有限，供骨量常不足，且塑形欠佳，對 缺損受區(qū)骨質強度及承重等功能要求也不能很好滿足，還有移植骨術后吸收及供區(qū)增加額外 創(chuàng)傷等問題。異體/種骨移植骨量充足，經過物理或化學方法處理減弱了免疫原性，也不增加 額外創(chuàng)傷，但仍易發(fā)生免疫排斥，并可有術區(qū)感染、骨延遲愈合軟骨鈣質沉著、骨瘤、骨代 謝疾病和炎癥性關節(jié)炎等并發(fā)癥，且有潛在的傳染病原體的危險。組織工程指"應用生命科學與工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理 兩種狀態(tài)下的組織結構與功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于修復、維護、促進人體各種組 織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的學科"。骨組織工程通過將具有成骨潛能的種子 細胞(如骨髓基質干細胞和脂肪間充質干細胞)與能提供細胞依附并可引導細胞生長的基質 支架復合體外培養(yǎng)，在能夠誘導細胞增殖和分化的細胞因子(如骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP)的作 用下，誘導成骨，較之傳的自體骨移植修復方法而言，創(chuàng)傷小，供骨量大；但體外培養(yǎng)操 作復雜，耗時長，在力學、細胞因子等三維微環(huán)境方面與體內實際環(huán)境差距較大，亦增加供 細胞區(qū)二次損傷。近來發(fā)展的生物反應器是組織工程中的重要方法，可模擬體內環(huán)境便于組織替代物的長 入，為系統(tǒng)研究活組織對不同機械和生化環(huán)境的反應提供了便利條件。文獻報道多為體外構 建，如將干細胞與有良好生物相容性的多孔或液態(tài)可生物降解支架體外復合共培養(yǎng)后回植體 內，具體細胞培養(yǎng)方式有灌注、三維培養(yǎng)、旋轉培養(yǎng)等，較之傳統(tǒng)的骨組織工程構建方法而 言，能更近似的模擬體內環(huán)境；但其研發(fā)需特制設備，且構建過程中必須考慮的參數亦較多，如環(huán)境的溫度、酸堿度、營養(yǎng)物質和代謝廢物的出入途徑、細胞的種植密度和分布、力學參 數等，往往不能同時兼顧；對體內物理、化學生物環(huán)境的也僅只是近似模擬。近來發(fā)展的生 物反應器是組織工程中的重要方法，可模擬體內環(huán)境便于組織替代物的長入，為系統(tǒng)研究活 組織對不同機械和生化環(huán)境的反應提供了便利條件。文獻報道多為體外構建，如將干細胞與 有良好生物相容性的多孔或液態(tài)可生物降解支架體外復合共培養(yǎng)后回植體內，具體細胞培養(yǎng) 方式有灌注、三維培養(yǎng)、旋轉培養(yǎng)等，較之傳統(tǒng)的骨組織工程構建方法而言，能更近似的模 擬體內環(huán)境；但其研發(fā)需特制設備，且構建過程中必須考慮的參數亦較多，如環(huán)境的溫度、 酸堿度、營養(yǎng)物質和代謝廢物的出入途徑、細胞的種植密度和分布、力學參數等，往往不能 同時兼顧；對體內物理、化學生物環(huán)境的也僅只是近似模擬。體內生物反應器是一種更先進的方法，是在體內骨膜下腔形成骨生物反應器，將含鈣膠 體材料注射于骨生物反應器內逐步形成骨組織。目前國內外均有研究，主要問題在于；含鈣 膠體材料配制復雜、不成熟。發(fā)明內容根據上述需求，本發(fā)明提供一種配制簡單、可注射、可吸收的殼聚糖含鈣膠體支架材料。 本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，采用以下步驟配制1) 電子天平精確稱量并分裝的殼聚糖顆粒經10K Gy的CcT照射1000分鐘，滅菌化處理；2) 以O. 1%乙酸為溶劑，制成1.2%的水溶液；3) 6(TC水浴中，磁轉子持續(xù)攪拌下，加入O. 108g磷酸三鈣粉末及5。/。的明膠顆?；靹?；4) 靜置交聯(lián)1. 5小時后，加入1M NaOH溶液酸堿滴定至pH中性。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其中所述殼聚糖的脫乙酰度91.2%， 1XHC1濃 度2(TC時粘度為150卿a,s。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其中所述磷酸三鈣的平均孔徑為380um。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其中所述0. 1%乙酸溶劑用分子量60. 05的分析 純冰醋酸配制。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其中所述1M NaOH溶液用分子量40. 00的分析 純氫氧化鈉配制。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，膠體可注射，以注射于體內骨膜下腔骨生物反應 器用，生物相容性好，具有良好的可塑性，滿足密閉骨膜下腔的力學支撐和對骨膜細胞的機 械刺激需要；體內可吸收，吸收降解的速率與體內新骨形成的速度相匹配，體內脛骨和顱骨4骨生物反應器的成骨質量好，作為移植用供骨的潛力大。另外，此法操作簡單，不需采取自 體細胞體外培養(yǎng)，成本低，也可避免因體外細胞培養(yǎng)帶來的污染可能；不額外添加異體或異 種細胞/生長因子，造價低，更無免疫排斥等危險；殼聚糖膠體的代謝終產物葡萄糖還可為系 列成骨反應供能。為骨生物反應器提供了良好的支架材料。
具體實施方式
為進一步闡述本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，下面結合實施例作更詳盡的說明。 殼聚糖(Chitosan)，化學名為0 (1， 4) 2—氨基2 —脫氧一D匍聚糖，是甲克素脫乙?；a物，在天然高分子中的含量僅次于纖維素，也是唯一的天然堿性多糖，具有獨特的分子結構、化學性質和生物活性。既往文獻資料顯示殼聚糖具有良好的生物相容性，也即不會產生全身或局部毒性反應、 不致溶血、不引起炎性和排斥反應、不致突變，有利于骨組織迅速長入材料孔內并與材料緊 密結合。將多孔殼聚糖支架植入小鼠體內，分別于l、 2、 4、 8和12周處死小鼠，組織學檢 查見有一過性的中性粒細胞聚集，膠原纖維長入孔隙，對于殼聚糖特異的細胞免疫和體液免 疫水平極低。毒理學研究進一步表明，殼聚糖無毒、無刺激性、無免疫原性、無熱源反應、 不溶血、無致突變及致死性突變反應，組織相容性好，安全性高。另外，殼聚糖還具有抗菌、 止血等作用，符合體內應用的需要和要求。在殼聚糖支架的成骨功用上，文獻記載顯示，將 膠囊化的軟骨細胞和骨蛋白(BP)與2。/。(w/v)殼聚糖凝膠溶液混合，通過背部皮下注射的方式, 注射入老鼠體內，發(fā)現(xiàn)有成骨現(xiàn)象。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，采用以下步驟配制-1) 電子天平精確稱量并分裝的殼聚糖顆粒經10KGy的Co,照射1000分鐘，滅菌化處理；2) 以O. 1%乙酸為溶劑，制成1.2%的水溶液；3) 6(TC水浴中，磁轉子持續(xù)攪拌下，加入0.108g磷酸三鈣粉末及5y。的明膠顆?；靹颍?) 靜置交聯(lián)1. 5小時后，加入1M NaOH溶液酸堿滴定至pH中性。其中殼聚糖采用青島海匯生物工程有限公司產的殼聚糖脫乙酰度91.2%， 1%濃度 (HC1)20。C時粘度為150卿a. s;磷酸三鈣采用武漢華威生物材料工程開發(fā)公司產的磷酸三鈣(e—TCP)，平均孔徑 380 um;0. 1%乙酸溶劑用乙酸溶液選用北京化工廠產分析純、分子量為60. 05的冰醋酸配置；1M NaOH溶液用天津化學試劑三廠產分子量40. 00的分析純氫氧化鈉配制。 CcT照射采用英國瑞維斯公司鈷棒(規(guī)格4)11咖，長450咖，活度3.7X10'5Bq)。 明膠的引入可增加復合物的粘度；屏蔽殼聚糖過高的正電荷密度而利于細胞遷移，使細 胞盡快進入DNA合成期，抑制材料觸發(fā)的細胞凋亡；且明膠本身具有細胞膜整合素結合區(qū) 精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸一蘇氨酸序列(RGDT)和天冬氨酸一甘氨酸一谷氨酸一丙氨酸 序列(DGEA)，易于粘附多種細胞，對細胞的生長、分化和遷移都具有促進作用；明膠亦具 良好的生物相容性，無毒、無熱源反應、不致突、不溶血，體內可完全吸收。膠體中引入的磷酸三鈣(e-TCP)亦具有良好的細胞相容性，無骨誘導性，但有骨傳導 性，也為成骨過程提供原料。特別是，本實驗中采用e-TCP的平均孔徑為38(Him，滿足磷酸 鈣陶瓷利于骨組織長入的理想孔徑要求(150—500^im);此e -TCP的孔隙率為46.4—70.0% ， 使得此顆粒材料可作為支架為組織長入提供較大接觸面，同時，也有一定位移能力，為骨基 質的形成提供空間；而此e-TCP材料的大孔內壁又有貫通孔和微細小孔，可形成三維多孔結 構，這樣相互貫通的空隙結構有利于組織的長入和界面支持。殼聚糖可生物降解，也即是可吸收的，在組織形成中逐漸分解，不影響新生成組織的結 構和功能。它在體內可被溶菌酶水解，終產物葡萄糖可被人體吸收。其分子鏈中含2—乙酰 氨基匍聚糖和2—氨基匍聚糖兩種單元結構，此二者比例隨脫乙酰化程度不同而異，乙酰化 程度越高，材料的機械強度越大，炎性反應越弱，降解速度越慢；脫乙酰度高于60%或低于 40%的產物不溶于水；分子量越大，粘度越高，降解越慢。這樣，可根據殼聚糖的脫乙酰度， 及與其余兩成分的構成比等控制調整膠體的體內降解速度，使之與成骨速度相一致。因此， 本發(fā)明選用脫乙酰度為91.2%的殼聚糖，將殼聚糖含麪液態(tài)膠體支架材料(簡稱為CS)調制 濃度為1.2%，與5X明膠和0.108g磷酸三鈣(e-TCP)共混制成可注射的膠體，體溫37。C下 控制膠體粘度在47500cPs，可滿足骨生物反應器的力學支撐要求；膠體在室溫下亦可無障礙 通過25G (0.5X20)針頭，其流變學性能適合注射；因復合物中含有水分，結構多孔，更適 合細胞的黏附和增殖；進一步通過調整TCP的晶體構型及復合體的孔隙率，可控制降解速率 在12周左右，與體內新骨形成的速度相匹配。因此，材料吸收前為成骨提供密閉腔隙的支撐， 對表面富含細胞的骨膜的持續(xù)機械刺激，還可提供成骨的鈣質原料；而材料吸收后形成新骨 的塑型不再受材料影響，新骨塑型后的強度還優(yōu)于新骨與材料的結合強度?？勺⑸淠z體材料的作用在于(1)作為支架機械支撐，在其注射入體內后，將骨膜與其下 的骨皮質分隔開來，形成密閉的骨膜下腔，為細胞遷移、成骨等生物行為提供空間和相對穩(wěn)定的微環(huán)境；其逐步降解的過程與亦可與成骨反應在時間上相適應；(2)具有一定體積的支 架對淺層骨膜持續(xù)的機械刺激可產生成骨細胞增殖的生物學效應支架材料產生的力學負荷 可傳導到成骨細胞并使其表面受到牽張，此生物材料/細胞交接面的變形可被成骨細胞附著位 點感知，而骨細胞對機械變形刺激的感受又比其它類型的細胞敏感得多，從而使外來的機械 力刺激對成骨細胞的增殖、定向及基因活性等細胞行為有明顯的刺激作用。雖然諸多文獻報 道機械力對成骨細胞增殖等細胞行為產生顯著效應，但對機械刺激導致成骨細胞增殖及骨特 異性蛋白表達的機理至今尚不清；(3)可注射膠體支架含鈣，其內磷酸三鈣(e-TCP)的鈣 鹽以晶體或離子形式存在，可參與趨化成骨細胞進入反應器，也為成骨過程提供原料，促使 基質鈣化成骨。(4)腔內I型膠原的作用膠體注射4W始，骨鈣素血清濃度升至正常值，局 部組織骨鈣素表達陽性、骨基質I型膠原蛋白染色陽性等結果表明類骨質的形成。類骨質的 出現(xiàn)預示著骨組織開始形成，其中I型膠原是骨基質中的主要膠原，可與鈣鹽結合；游離的 Ca2+沉積到I型膠原上而啟動骨基質的礦化過程。此外，I性膠原還具有底物作用，起粘附 功能，使細胞附著，從而使業(yè)已開始形成的礦化基質連接成片，并不斷擴大；(4)殼聚糖膠 體的代謝終產物葡萄糖還可為系列成骨反應供能。
權利要求
1、一種殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，包括殼聚糖、磷酸三鈣，其特征在于所述殼聚糖含鈣膠體支架材料采用以下步驟配制1)電子天平精確稱量并分裝的殼聚糖顆粒經10K Gy的Co60照射1000分鐘，滅菌化處理；2)以0.1％乙酸為溶劑，制成1.2％的水溶液；3)60℃水浴中，磁轉子持續(xù)攪拌下，加入0.108g磷酸三鈣粉末及5％的明膠顆?；靹颍?)靜置交聯(lián)1.5小時后，加入1M NaOH溶液酸堿滴定至pH中性。
2、 根據權利要求1所述的殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其特征在于所述殼聚糖的脫 乙酰度91. 2%， 1%HC1濃度20。C時粘度為150mpa. s。
3、 根據權利要求2所述的殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其特征在于所述磷酸三鈳的 平均孔徑為380 nm。
4、 根據權利要求3所述的殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其特征在于所述0. 1%乙酸 溶劑用分子量60. 05的分析純冰醋酸配制。
5、 根據權利要求4所述的殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，其特征在于所述lMNaOH溶 液用分子量40. 00的分析純氫氧化鈉配制。
全文摘要
殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，采用以下步驟配制精確稱量并分裝的殼聚糖顆粒經10KGy的Co⁶⁰照射1000分鐘滅菌化處理；以0.1％乙酸為溶劑，制成1.2％的水溶液；60℃水浴中，磁轉子持續(xù)攪拌下，加入0.108g磷酸三鈣粉末及5％的明膠顆粒混勻；靜置交聯(lián)1.5小時后，加入1M NaOH溶液滴定至pH中性。本發(fā)明殼聚糖含鈣液態(tài)膠體支架材料，用以注射于體內骨膜下腔骨生物反應器以誘導成骨，生物相容性好，可塑性強，體內可吸收，成骨質量好，作為移植用供骨的潛力大，操作簡單，不需體外細胞體培養(yǎng)，不需添加細胞因子或生長因子，成本低，無感染，無免疫排斥等危險，代謝終產物葡萄糖還可為系列成骨反應供能。為骨生物反應器提供了良好的支架材料。
文檔編號A61L27/00GK101322854SQ200810117370
公開日2008年12月17日 申請日期2008年7月30日 優(yōu)先權日2008年7月30日
發(fā)明者趙振民, 黃晨昱 申請人:中國醫(yī)學科學院整形外科醫(yī)院