專利名稱：一種單克隆抗體涂層生物支架的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物支架制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種單克隆抗體 涂層生物支架的制備方法。
背景技術(shù)：
1976年德國學(xué)者安德里亞'格隆茨戈首次提出了動脈內(nèi)安裝支架 的設(shè)想，到90年代冠狀動脈支架已廣泛地應(yīng)用于臨床治療。血管支 架是心血管及外周血管阻塞病變進行介入治療的主要手段，其特點是 能通過細小管道進入預(yù)定的部位，釋放后能膨脹至設(shè)定的直徑大小， 對管腔起到支撐作用，使管腔保持通暢。血管支架按照表面狀態(tài)可分 為裸支架、藥物洗脫支架、聚合物包被支架、金屬涂層支架、放射性 支架和人造血管覆蓋支架，最先使用的支架基本為裸支架。由于支架 相對血管或其它肌體管道來說是一種異源性物質(zhì)，安放后刺激血管內(nèi) 膜引起反應(yīng)性增生，使血管發(fā)生再狹窄。再狹窄的發(fā)生率高達 30%-35%,尤其是病變較長的血管和直徑較小的血管。為解決再狹窄 的問題，人們隨后開發(fā)出放射性支架和藥物洗脫支架，其中藥物洗脫 支架已被公認為在冠心病的介入治療中，是能夠解決冠脈血管內(nèi)再狹 窄問題的最有效的方法。
現(xiàn)有的藥物洗脫支架多釆用聚合物作為載體來攜帶藥物并控制 其釋放，典型的作法是將活性藥物和聚合物混合涂覆在裸支架部分 或全部表面上，聚合物一般最少要占涂層質(zhì)量的70%以上才能起到載 體的作用，支架本體上涂覆一層包含活性藥物的聚合物涂層，聚合物 涂層上又涂覆一層多聚物涂層。這種含有聚合物涂層的藥物支架在臨 床應(yīng)用中可以將再狹窄發(fā)生率降低到10%以下，這種支架在植入人體 后，由于藥物的不斷減少而聚合物濃度相應(yīng)的不斷增高，可能導(dǎo)致血
栓的形成。
現(xiàn)有的藥物洗脫支架的藥物多釆用雷帕霉素或者紫杉醇作為支 架上所攜帶藥物，但該種帶有聚合物涂層的藥物洗脫支架，但仍不能 從根本上很好的解決支架內(nèi)血栓形成和再狹窄問題，存在手術(shù)后再狹 窄率高、血栓源性強等缺陷，遠期效果不理想，目前研究表明這種藥 物洗脫支架的還存在10%左右再狹窄率，為了減少再狹窄率，本發(fā)明 研究人員開發(fā)了一種單克隆抗體生物支架。該生物支架具有很好的促 進血管內(nèi)皮化和抑制血栓形成，以及抑制血管平滑肌的生長和增值的 作用，單克隆抗體或單克隆抗體和其它藥物治療劑聯(lián)合支架具有二種 藥物的優(yōu)點，在預(yù)防血管再狹窄，血栓形成，促進內(nèi)皮化和抑制平滑 肌再生都具有優(yōu)良的性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單克隆抗體涂層生物支架的制備方法。 本發(fā)明所提供的單克隆抗體涂層生物支架的制備方法，以支架本 體為陽極，通過靜電噴涂或陽極極化的方式使得抗#^溶液帶負電，在 電場力的作用下，向陽極移動，均勻地涂覆在生物支架的表面。所述
支架本體的表面還可制成有直徑100-800nm的孔洞。
上述釆用靜電噴涂的方式涂覆生物支架，其包括如下步驟
(1) 支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 28-100 KHz，清洗時間為5-15min;使用去離子水進行清洗三次；
(2) 抗體涂覆液的配制以純水或者濃度為0.01-1.0mo1/1、 pH 值為9.6的碳酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.01-1.0mg/ml的抗體
(3) 靜電噴涂以抗體溶液為陰極，接上電源負高壓，以支架 本體為陽極，接地，兩極形成高壓靜電場，由于在陰極產(chǎn)生電暈放電， 使噴出的抗體溶液介質(zhì)帶電，并進一步霧化，沿電力線定向地流向帶 正電的被涂物支架本體表面，中和沉積成一層均勻、附著牢固的抗體 涂層。
靜電噴涂的原理以抗體溶液作為陰極，接上電源負高壓，而支 架接地，這樣在兩極就形成了高壓靜電場。由于在陰極產(chǎn)生電暈放電， 可使噴出的抗體溶液介質(zhì)帶電，并進一步霧化。按"照同性相斥，異 性相吸"的原理，已帶電的溶液介質(zhì)受電場力(F-qE)作用，沿電力線 定向地流向帶正電的被涂物支架表面，就可中和沉積成一層均勻、附 著牢固的抗體涂層。
上述釆用陽極極化的方式涂覆生物支架，其包括如下步驟
(1) 支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 28匪100KHz,清洗時間為5-15min;使用去離子水進行清洗三次；
(2) 抗體涂覆液的配制以純水或者濃度為0.01-1.0mo1/1、 pH 值為9.6的碳酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.01-1.0mg/ml的抗體
(3) 陽極極化以支架本體作為陽極，溶液中釆用單克隆抗體 溶液時，該抗體電離變?yōu)殛庪x子，通電后抗體向陽極支架本體處移動， 使單克隆抗體與支架本體表面牢固均勻地結(jié)合，附著牢固的抗體涂 層。
陽極極化的原理電化學(xué)中的極化現(xiàn)象是指極化作用一經(jīng)開始， 在陽極，電子流走了，溶液中的陰離子向陽極移動；在陰極，電子流 入快，溶液中的陽離子向陰極移動。當把支架作為陽極，溶液中采用 單克隆抗體溶液時，該抗體電離變?yōu)殛庪x子，通電后抗體向陽極支架 處移動，在陰陽相吸作用下，克服支架表面的液面張力，使單克隆抗 體與支架表面牢固均勻的結(jié)合，與電鍍的原理基本相同。
所述支架本體可先經(jīng)過表面清洗和防腐處理后，進行靜電噴涂或 陽極極化的涂覆處理；所述涂覆后的生物支架自然晾干，經(jīng)預(yù)冷凍后， 放入真空冷凍干燥機干燥。
支架本體的表面清洗過程為
(1) 用砂帶打磨支架本體表面，用于去除表面的氧化物，調(diào)整
表面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為28-100 KHz，清洗時間為5-15 min;
(3) 將支架本體放入15-60 g/L、 70-100。C的氫氧化鈉溶液中浸 泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在 30-40°C，干燥30-60min后取出。
支架本體的防腐處理釆用化學(xué)氧化處理或陽極氧化處理的方法 進行。
化學(xué)氧化處理的過程為將支架本體浸入含重鉻酸鉀15-20 g/L、 硝酸15-25g/L、氯化鈉0.75-L25g/L的混合溶液中，在70-8(TC下，氧 化0.5-2.0min,在支架本體表面生成氧化膜。
陽極氧化處理的過程為釆用交流電氧化，在兩電極上分別安裝 完全相同的支架本體，陽極氧化處理用槽液為高錳酸鉀15-20 g/L、磷 酸三鈉15-55g/L、氟化鉀25-55 g/L、氫氧化鉀65-165 g/L、氫氧化鉬 15-65 g/L的混合液，在20-60'C下，電流密度為O.l-lO A/dm2,交流電 壓為50-90V下，氧化10-50min，支架本體表面生成氧化膜。
除上方法外，還可釆用離子注入、激光表面處理、熱擴散、金屬 鍍層、氣相沉積、有機涂層等方式中的一種或多種對支架本體表面進 行防腐處理。
此外，在支架本體表面涂覆抗體前，可先涂覆治療性藥物，涂覆 的治療性藥物與抗體的比例為50:1-100:1。所述治療性藥物為肝素、 阿司匹林、水蛭素、秋水仙堿、抗血小板GPIIb/IIIa受體結(jié)抗劑、白 甲氨蝶呤、嘌呤類、嘧啶類、植物堿類和埃坡破霉素(Epothilone) 類、雷公藤系列化合物、抗生素、激素、抗體治癌藥物、環(huán)孢霉素、 他克莫司及同系物(FK506)，脫精胍菌素(15-deoxyspergualin),霉 酚酸脂(MMF),雷帕霉素(Rapamycin)及其衍生物，F(xiàn)R900520， FR 900523, NK 86-1086,戊酰胺(depsidomycin)， 康樂霉素C (kanglemycin C )， 斯博格埃林 (spergualin )， 靈菌紅素 25c(prodigiosin25-c)，曲尼斯特(tranilast)，多球殼菌素(myriocin ) ， FR 651814， SDZ214-104,環(huán)孢霉素C，布雷青霉素(bredinin)，麥考酴 酸、布雷菲得菌素A， WS9482,糖皮質(zhì)類固醇、替羅非班(tirofiban)、 埃替非巴肽(eptifibatide)、紫杉醇、放線菌素-D等中的一種或多種。 上述治療性藥物溶液的涂覆處理，其過程為以甲醇作溶劑，加 入濃度為l-15ng/ml的上述治療性藥物的溶液對支架本體表面進行 定向超聲噴涂，勻速旋轉(zhuǎn)支，根據(jù)支架本體表面藥物含量要求噴涂 1-15次；
上述治療性藥物的涂覆處理，其過程也可為以四氫吹喃作有機 溶劑，加入濃度為l-15jug/ml的藥物，將支架本體浸泡在上述溶液中 5-10分鐘，重復(fù)浸涂4次。
本發(fā)明的單克隆抗體涂層生物支架的制備方法中，所述支架本體 釆用316醫(yī)用不銹鋼材質(zhì)或鈷絡(luò)合金材質(zhì)；所述單克隆抗體為單克隆 抗體CD34、單克隆抗體CD133、單克隆抗體CD105、單克隆抗體 CD117、單克隆抗體CD123、單克隆抗體CD9+、達利珠單抗 (daclizumab )、或阿昔單抗等中的一種或多種。
本發(fā)明所提的單克隆抗體涂層生物支架的制備方法，其具有如下 有益效果
1. 在支架本體原材料的表面，即直接與人體病變組織接觸的表 面上制備有孔洞或者沒有孔洞分布。無需額外制備載藥涂層，無明顯 界面，能夠在支架本體全部或者部分表面通過靜電作用均勾包被一層
抗體；
2. 支架本體全部或者部分表面包被抗體后，支架本體上抗體包 被量穩(wěn)定性較好，經(jīng)過直接或者超聲清洗生物支架，生物支架上抗體
量均沒有損失，這預(yù)示著該抗體支架能夠耐受更長時間的血液沖刷， 抗體主要是通過靜電吸附作用或者特殊的孔洞結(jié)構(gòu)結(jié)合到支架本體
表面；
3. 使用安全，滿足臨床需要?？贵w包被所使用的藥品器材都是比 較安全的醫(yī)用級藥品和器材，本身產(chǎn)品就比較安全，所使用的抗體為 治療性抗體，能夠直接作用于人體；
4. 工業(yè)實用性強。該種抗體包被方式能夠進行大規(guī)模的工業(yè)化 生產(chǎn)，且操作簡單，成本較低。


圖1為本發(fā)明支架本體的掃描電鏡圖。
圖2為本發(fā)明表面帶有納米孔的支架本體表面的掃描電鏡圖。 圖3為本發(fā)明表面帶有納米孔的支架本體上的抗體分布掃描電 鏡圖。
圖4為靜電噴涂設(shè)備示意圖中1、儲液器；2、泵；3、噴嘴；4、高壓發(fā)生器；5、導(dǎo)電 桿；6、噴液室；7、霧滴；8、電極板。 圖5為陽極極化涂覆過程示意圖中A、操控電腦B、陽極極化儀C、儲液容器D、電極。
具體實施例方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明 的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步 驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
圖1所示的支架本體是醫(yī)用316不銹鋼，也可以為鈷絡(luò)合金材質(zhì)， 通過激光雕刻或機械加工而成的，除可制成血管支架外，還可制成骨 縫合線、骨釘、骨連接件，脊推骨盤，縫合用錨，止血鉗、止血螺絲、 止血板、止血夾，以及組織粘合劑、密封劑，人造骨等醫(yī)療設(shè)備。
圖2所示的表面帶有納米孔的支架本體是醫(yī)用316不銹鋼合金，
也可以為鈷絡(luò)合金材質(zhì)，經(jīng)拋光后，用激光雕刻成血管支架；支架表 面通過化學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧氧化、微弧氮化等 方法或這些方法的結(jié)合。并且在器械本體原材料的局部表面直接制備 形成孔洞，孔洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑為100-800nm。 實施例l
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步驟制得單克隆抗體CD34涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為lOOKHz,清洗時間為10min;
(3) 將支架本體放入30g/L、 8(TC的氫氧化鈉溶液中浸泡10min， 去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在40 °C,干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理將支架本體浸入到重鉻酸鉀15 g/L、硝酸15g/L、氯化鈉1.0g/L溶液中，在8(TC下氧化1 min,支 架本體表面即可生成氧化膜。
3、 支架本體表面單克隆抗體CD34溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 100KHz,清洗時間為10min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳 酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD34溶液；
(3) 、靜電噴涂如圖4所示，將電極板8接上高壓靜電負極， 電壓為0-10KV,連續(xù)可調(diào)。將配制好的抗體涂覆液注入靜電噴涂裝 置的抗體溶液儲存容器l中，抗體溶液容器1與泵2相連，泵將溶液增 壓，增壓后的溶液經(jīng)溶液輸送管送至噴嘴3處，溶液從噴嘴急速噴出，
瞬間降壓，劇烈膨脹霧化成極細小的霧滴7，并由靜電發(fā)生器4放電而 帶上電荷，在電極板8與血管支架之間形成靜電場，支架穿到接地的
可以轉(zhuǎn)動的金屬導(dǎo)桿5上，支架與噴嘴的距離是5cm，帶電涂料在電 場引力和高壓推力的共同作用下，吸附于血管支架內(nèi)外表面上，并形 成一層均勻的抗體涂層，噴涂的時間為6秒，抗體涂層的量為1/4000 的支架重量；
(4)、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4h。 實施例2
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步驟制得單克隆抗體CD133涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為28KHz,清洗時間為15min;
(3) 將支架本體放入60g/L、 70。C的氫氧化鈉溶液中浸泡5min, 去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在30 。C,干燥60min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理釆用交流電氧化，在兩電極上安 裝完全相同的圖l所示的支架本體或者圖2所示的支架本體，陽極氧 化處理用槽液成份為高錳酸鉀15g/L、磷酸三鈉15g/L、氟化鉀25 g/L、氫氧化鉀65g/L、氫氧化鋁15g/L;在25'C，氧化10min,電流 密度為0.1A/dm2,交流電壓為50V，支架本體表面即可生成氧化膜。
3、 支架本體表面單克隆抗體CD133溶液的涂覆處理
(1)、支架本體的預(yù)處理用四氫^^喃超聲清洗，超聲波頻率為
28KHz,清洗時間為15min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳 酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD133溶液；
(3) 、靜電噴涂如圖4所示，將電極板8接上高壓靜電負極，電 壓為0-10KV,連續(xù)可調(diào)。將配制好的抗體涂覆液注入靜電噴涂裝置 的抗體溶液儲存容器l中，抗體溶液容器1與泵2相連，泵將溶液增壓， 增壓后的溶液經(jīng)溶液輸送管送至噴嘴3處，溶液從噴嘴急速噴出，瞬 間降壓，劇烈膨脹霧化成極細小的霧滴7，并由靜電發(fā)生器4放電而帶 上電荷，在電極板8與血管支架之間形成靜電場，支架穿到接地的可 以轉(zhuǎn)動的金屬導(dǎo)桿5上，支架與噴嘴的距離是5cm，帶電涂料在電場 引力和高壓推力的共同作用下，吸附于血管支架內(nèi)外表面上，并形成 一層均勻厚度的抗體涂層，噴涂的時間為6秒，抗體的量為l/4000的 支架重量；
(4) 、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4h。
實施例3
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通過化學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧
氧化、微弧氣化等方法或這些方法的結(jié)合在器械本體原材料的局部表 面直接制備形成孔洞，孔洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑為
100-800 nm。按照如下步驟制得單克隆抗體CD105涂層生物支架 1、支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為50KHz，清洗時間為13min;
(3) 將支架本體放入15g/L、10(TC的氫氧化鈉溶液中浸泡8min，
去除油脂和氧化皮；
(4)將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在35 °C，干燥50min后取出。
2、支架本體表面的防腐處理將支架本體浸入到重鉻酸鉀20 g/L、硝酸25g/L、氯化鈉1.25g/L溶液中，在70°C下氧化0.5min，
支架本體表面即可生成氧化膜。
3、支架本體表面單克隆抗體CD105溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 50KHz,清洗時間為13min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳 酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD105溶液；
(3) 、靜電噴涂如圖4所示，將電極板8接上高壓靜電負極，電 壓為0-10KV,連續(xù)可調(diào)。將配制好的抗體涂覆液注入靜電噴涂裝置 的抗體溶液儲存容器l中，抗體溶液容器1與泵2相連，泵將溶液增壓， 增壓后的溶液經(jīng)溶液輸送管送至噴嘴3處，溶液從噴嘴急速噴出，瞬 間降壓，劇烈膨脹霧化成極細小的霧滴7，并由靜電發(fā)生器4放電而帶 上電荷，在電極板8與血管支架之間形成靜電場，支架穿到接地的可 以轉(zhuǎn)動的金屬導(dǎo)桿5上，支架與噴嘴的距離是5cm，帶電涂料在電場 引力和高壓推力的共同作用下，吸附于血管支架內(nèi)外表面上，并形成 一層均勻的厚度的抗體涂層，噴涂的時間為6秒，抗體的量為1/4000 的支架重量；
(4) 、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4h。
實施例4
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通過化學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或這些方法的結(jié)合在器械本體原材料的局部表面直接制備形成孔洞，孔洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑為
100-800 nm。按照如下步驟制得單克隆抗體CD117涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為100KHz，清洗時間為5min;
(3) 將支架本體放入30g/L、 8(TC氫氧化鈉溶液中浸泡10min,
去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在40 °C，干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理釆用交流電氧化，在兩電極上安 裝完全相同的圖l所示的支架或者圖2所示的支架，陽極氧化處理用 槽液成份為高錳酸鉀20g/L、磷酸三鈉35g/L、氟化鉀55 g/L、氫氧 化鉀100g/L、氫氧化銷30 g/L;在40'C，氧化25min，電流密度為 5A/dm2，交流電壓為70V,支架本體表面即可生成氧化膜。
3、 支架本體表面單克隆抗體CD117溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 100KHz,清洗時間為5min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳 酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD117溶液；
(3) 、靜電噴涂如圖4所示，將電極板8接上高壓靜電負極，電 壓為0-10KV，連續(xù)可調(diào)。將配制好的抗體涂覆液注入靜電噴涂裝置 的抗體溶液儲存容器l中，抗體溶液容器1與泵2相連，.泵將溶液增壓， 增壓后的溶液經(jīng)溶液輸送管送至噴嘴3處，溶液從噴嘴急速噴出，瞬 間降壓，劇烈膨脹霧化成極細小的霧滴7，并由靜電發(fā)生器4放電而帶 上電荷，在電極板8與血管支架之間形成靜電場，支架穿到接地的可
以轉(zhuǎn)動的金屬導(dǎo)桿5上，支架與噴嘴的距離是5cm，帶電涂料在電場 引力和高壓推力的共同作用下，吸附于血管支架內(nèi)外表面上，并形成 一層均勾的厚度的抗體涂層，噴涂的時間為6秒，抗體的量為1/4000 的支架重量；
(4)、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4 h。 實施例5
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成 血管支架，按照如下步驟制得單克隆抗體CD123涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為lOOKHz，清洗時間為10min;
(3) 將支架本體放入30 g/L、 80 'C的氫氧化鈉溶液中浸泡10 min，去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在40 。C，干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理釆用交流電氧化，在兩電極上安 裝完全相同的圖l所示的支架或者圖2所示的支架，陽極氧化處理用 槽液成份為高錳酸鉀18g/L、磷酸三鈉55g/L、氟化鉀40g/L、氫氧 化鉀165g/L、氫氧化鋁65 g/L;在60°C,氧化50min，電流密度為 10A/dm2，交流電壓為90V,支架本體表面即可生成氧化膜。
3、 支架本體表面單克隆抗體CD123溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 lOOKHz，清洗時間為10min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳
酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD123溶液；
(3) 、陽極極化涂覆如圖5所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化 儀的陽極4上，將配制好的抗體溶液注入陽極極化的抗體儲存容器3 中，調(diào)節(jié)陽極電壓為400mv，進行極化，極化時間為600s,通電后抗 體離子向陽極支架處移動，在陰陽相吸作用下，克服支架表面的液面 張力，使單克隆抗體與支架表面牢固均勻的結(jié)合。并在支架表面形成 一層均勻的抗體涂層，抗體的量為l/4000的支架重量；
(4) 、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4h。
實施例6
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通過化學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或這些方法的結(jié)合在器械本體原材料的局部表 面直接制備形成孔洞，孔洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑為
100-800 nm。按照如下步驟制得單克隆抗體CD9+涂層生物支架
1、 支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表
(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為lOOKHz，清洗時間為10min;
(3) 將支架本體放入30g/L、 80 。C氫氧化鈉溶液中浸泡10min,
去除油脂和氧化皮；
(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在40 。C,干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理采用交流電氧化，在兩電極上安 裝完全相同的圖l所示的支架或者圖2所示的支架，陽極氧化處理用 槽液成份為高錳酸鉀15g/L、磷酸三鈉15g/L、氟化鉀25g/L、氫氧
化鉀65g/L、氫氧化鋁15 g/L;在25°C,氧化10min，電流密度為 0.1A/dm2，交流電壓為50V，支架本體表面即可生成氧化膜。 3、支架本體表面單克隆抗體CD9+溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 lOOKHz，清洗時間為10min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH值為9.6的碳 酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1mg/ml單克隆抗體CD9+溶液；
(3) 、陽極極化涂覆如圖5所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化 儀的陽極4上，將配制好的抗體溶液注入陽極極化的抗體儲存容器3 中，調(diào)節(jié)陽極電壓為400mv，進行極化，極化時間為600s,通電后抗 體離子向陽極支架處移動，在陰陽相吸作用下，克服支架表面的液面 張力，使單克隆抗體CD9+與支架表面牢固均勻的結(jié)合。并在支架表 面形成一層均勾的抗體涂層，抗體的量為l/4000的支架重量；
(4) 、生物支蘋干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4h。
實施例7
選用316不銹鋼合金或者鈷絡(luò)合金材質(zhì)經(jīng)拋光后，用激光雕刻成
血管支架；支架表面通過化學(xué)或物理方法，如腐蝕、陽極氧化、微弧
氧化、微弧氮化等方法或這些方法的結(jié)合在器械本體原材料的局部表 面直接制備形成孔洞，孔洞可以是載藥槽或孔結(jié)構(gòu)，孔洞的直徑為
100-800 nm。按照如下步驟制得達利珠單抗涂層生物支架 1、支架本體表面的清洗
(1) 砂帶打磨支架本體表面，機械去除表面的氧化物，調(diào)整表 面粗糙度；
(2) 利用超聲波，依次用75°/。的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為lOOKHz,清洗時間為10min;
(3) 將支架本體放入30g/L、 80 。C氫氧化鈉溶液中浸泡10min，
去除油脂和氧化皮；
(4)將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在40 。C,干燥45min后取出。
2、 支架本體表面的防腐處理釆用交流電氧化，在兩電極上安 裝完全相同的圖l所示的支架或者圖2所示的支架，陽極氧化處理用 槽液成份為高錳酸鉀15g/L、磷酸三鈉15g/L、氟化鉀25g/L、氫氧 化鉀65g/L、氫氧化鋁15 g/L;在25°C,氧化10min,電流密度為 0.1A/dm2，交流電壓為50V，支架本體表面即可生成氧化膜。
3、 治療性藥物溶液的涂覆處理以四氫呋喃作溶劑，加入濃度 為15ng/ml的雷帕霉素對支架表面進行定向超聲噴涂，勻速旋轉(zhuǎn)支， 噴涂4次，使支架表面藥物含量達到1/80支架重量。
4、 支架本體表面達利珠單抗溶液的涂覆處理
(1) 、支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為 lOOKHz，清洗時間為10min;使用去離子水清洗三次；
(2) 、抗體涂覆液的配制以濃度為0.05mo1/1、 pH為9.6的碳酸 鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.1 mg/ml達利珠單抗溶液；
(3) 陽極極化涂覆如圖5所示，將支架本體串聯(lián)到陽極極化儀 的陽極4上，將配制好的抗體溶液注入陽極極化的抗體儲存容器3中， 調(diào)節(jié)陽極電壓為400mv，極化時間為600s，通電后抗體離子向陽極支 架處移動，在陰陽相吸作用下，克服支架表面的液面張力，使單克隆 抗體與支架表面牢固均勻的結(jié)合。并在支架表面形成一層均勻的抗體 涂層，抗體的量為l/4000的支架重量；
(4) 、生物支架干燥將支架自然稍晾干后，冰箱中預(yù)冷凍后放 入真空冷凍干燥機中干燥4 h。
權(quán)利要求
1、一種單克隆抗體涂層生物支架的制備方法，其特征在于，通過靜電噴涂或陽極極化的方式，以支架本體為陽極，在電場力的作用下，帶負電的抗體離子向陽極移動，均勻地涂覆在生物支架的表面。
2、 如權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于，所述支架本體表 面制成有直徑100-800nm的孔洞。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，釆用靜電噴涂的方式涂覆生物支架，其包括如下步驟(1) 支架本體的預(yù)處理用四氫呋喃超聲清洗，超聲波頻率為28-100KHz,清洗時間為5-15min;使用去離子水進行清洗三次；(2) 抗體涂覆液的配制以純水或者濃度為0.01-1.0mo1/1、 pH 值為9.6的碳酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.01-1.0mg/ml的抗體(3) 靜電噴涂以抗體溶液為陰極，接上電源負高壓，以支架 本體為陽極，接地，兩極形成高壓靜電場，由于在陰極產(chǎn)生電暈放電， 使噴出的抗體溶液介質(zhì)帶電，并進一步霧化，沿電力線定向地流向帶 正電的被涂物支架本體表面，中和沉積成一層均句、附著牢固的抗體 涂層。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，釆用陽極極 化的方式涂覆生物支架，其包括如下步驟(1) 支架本體的預(yù)處理用四氫吹喃超聲清洗，超聲波頻率為 28-100 KHz,清洗時間為5-15min;使用去離子水進行清洗三次；(2) 抗體涂覆液的配制以純水或者濃度為0.01-1.0mo1/1、 pH 值為9.6的碳酸鹽緩沖溶液為溶劑，加入濃度為0.01-1.0mg/ml的抗體 溶液；(3) 陽極極化以支架本體作為陽極，溶液中釆用單克隆抗體 溶液時，該抗體電離變?yōu)殛庪x子，通電后抗體向陽極支架本體處移動，使單克隆抗體與支架本體表面牢固均勻地結(jié)合，附著牢固的抗體涂 層。
5、 如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述支架本體經(jīng)過表面清洗和防腐處理后，進行靜電噴涂或陽極極化的涂覆處理；所述涂覆后的生物支架自然晾干，經(jīng)預(yù)冷凍后，放入真空冷凍干燥機干燥。
6、 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述支架本體的 表面清洗過程為(1) 用砂帶打磨支架本體表面，用于去除表面的氧化物，調(diào)整 表面粗糙度；(2) 利用超聲波，依次用75%的醫(yī)用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去離子水清洗，超聲波頻率為28-100 KHz,清洗時間為5-15 min;(3) 將支架本體放入15-60 g/L、 70-100。C的氫氧化鈉溶液中浸 泡5-10min，用于去除油脂和氧化皮；(4) 將清洗后的支架本體放置在真空干燥機中，溫度設(shè)定在 30-40°C，干燥30-60min后取出。
7、 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述支架本體的 防腐處理釆用化學(xué)氧化處理或陽極氧化處理的方法進行。
8、 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述化學(xué)氧化處 理的過程為將支架本體浸入含重鉻酸鉀15-20 g/L、硝酸15-25g/L、 氯化鈉0.75-1.25 g/L的混合溶液中，在70-80。C下，氧化0.5-2.0min; 所述陽極氧化處理的過程為釆用交流電氧化，在兩電極上分別安裝 完全相同的支架本體，陽極氧化處理用槽液為高錳酸鉀15-20g/L、磷 酸三鈉15-55g/L、氟化鉀25-55 g/L、氫氧化鉀65-165 g/L、氫氧化鋁 15-65 g/L的混合液，在20-6(TC下，電流密度為O.l-lO A/dm2,交流電 壓為50-90 V下，氧化10-50 min。
9、 如權(quán)利要求l或2所述的制備方法，其特征在于，在支架本體表面涂覆抗體前，先涂覆治療性藥物，并且所涂覆的治療性藥物與抗體的比例為50:1-100:1。
10、如權(quán)利要求l或2所述的制備方法，其特征在于，所述支架 本體釆用316醫(yī)用不銹鋼材質(zhì)或鈷絡(luò)合金材質(zhì)；所述單克隆抗體為單 克隆抗體CD34、單克隆抗體CD133、單克隆抗體CD105、單克隆抗 體CD117、單克隆抗體CD123、單克隆抗體CD9+、達利珠單抗、或 阿昔單抗中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體涂層生物支架的制備方法，通過靜電噴涂或陽極極化的方式，以支架本體為陽極，在電場力的作用下，帶負電的抗體離子向陽極移動，均勻地涂覆在生物支架的表面。本發(fā)明所提供的制備方法，無需額外制備載藥涂層，無明顯界面，能夠在支架本體全部或者部分表面通過靜電作用均勻包被一層抗體，包被抗體量穩(wěn)定性好，不易洗脫，并且使用安全，適于工業(yè)上大規(guī)模的生產(chǎn)，操作簡單，成本低。
文檔編號A61L31/08GK101337093SQ200810118078
公開日2009年1月7日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者余占江, 張正才, 蒲忠杰, 陳永強 申請人:樂普(北京)醫(yī)療器械股份有限公司