專利名稱：：一種土鱉蟲的仿生酶解產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥土鱉蟲的仿生酶解產(chǎn)物及其在心腦血管疾病中的應(yīng)用。屬中藥領(lǐng)域。技術(shù)背景土鱉蟲系鱉蠊科昆蟲地鱉(E叩olyphagasinesisWalker)或冀地鱉(Steleophageplancyi(Boleny))的雌蟲干燥體，為一種傳統(tǒng)中藥，最早記載于秦漢著作《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒、味咸，有微毒。具有散血瘀、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經(jīng)等功效。土鱉蟲作為傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用很廣泛，在入藥的方式上通常采用原藥材粉碎后直接服用，或水提或醇提或水提醇沉后服用，其所采取的提取方法比較傳統(tǒng)。現(xiàn)在研究表明，小分子的寡肽類物質(zhì)和氨基酸是很容易被小腸吸收的，而大分子的蛋白類在小腸里很難被吸收。傳統(tǒng)的原粉直接服用，原藥粉中大分子蛋白，只有少量在體內(nèi)經(jīng)過胃腸道的分解，變成小分子的寡肽而被吸收，由于藥材粉碎的細(xì)度、胃腸道pH的變化造成水解的不完成，有效成分被吸收利用的少，造成大量藥材的浪費(fèi)療效大大降低。水提、水提醇沉的提取工藝使得有大部分不溶入水、醇的蛋白被濾過除去，造成大量的藥材浪費(fèi)，療效同樣大大降低。隨著人們對(duì)動(dòng)物藥的認(rèn)識(shí)深入，有人從土鱉蟲中提取的單一的蛋白制成制劑，但制成口服制劑，由于經(jīng)過胃腸道，容易被胃酶、胰酶酶解掉，其活性損失；若制成注射液，由于大分子的蛋白類容易引起免疫原性，存在一定的安全隱患。應(yīng)用酶解法水解動(dòng)物蛋白，獲得具有一定生理活性的生物活性肽是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。由于不同的酶水解的部位不一樣，得到的酶解產(chǎn)物也大不相同，比如胃蛋白酶主要酶解的部位為苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸組成的肽鍵，胰蛋白酶主要酶解的部位為精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸組成的肽鍵，用單一的胃蛋白酶、胰酶或其他蛋白酶來酶解，均不能使蛋白被有效的吸收利用，這樣就迫切的需要一種新的酶解方法——在動(dòng)物或人體生物進(jìn)化過程中已被證實(shí)、療效確切的、模擬人體的消化過程的仿生酶解方法，將動(dòng)物藥中有效成分更容易吸收，更加安全的利用，同時(shí)更加充分利用原藥材。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的在于提供一種更有效的，安全的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物；本發(fā)明的第二目的是提供該提取物在活血化瘀及治療心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。發(fā)明人提供一種土鱉蟲的酶解產(chǎn)物，該藥物采用仿生酶解的方法制備取土鱉蟲，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至L03.0，加入胃蛋白酶于3545。C保溫酶解0.54小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入胰酶或胰蛋白酶于4050。C保溫酶解28小時(shí)，即得。進(jìn)一步優(yōu)化為取土鱉蟲，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入土鱉蟲量0.5%5%的胃蛋白酶于3545'C保溫酶解13小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入土鱉蟲量O.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于4050'C保溫酶解36小時(shí)，即得。較優(yōu)的制備方法為-取土鱉蟲，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入土鱉蟲量1%2%的胃蛋白酶于40°(:保溫酶解13小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入土鱉蟲量1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50°0保溫酶解36小時(shí)，即得。發(fā)明人經(jīng)過試驗(yàn)篩選，土鱉蟲藥材加水勻漿加水倍量在2倍以上即可能達(dá)到較好的勻漿效果，由于勻漿時(shí)加少量的水即可達(dá)到較好的效果，故勻漿后、酶解前可再加入適量水，使酶解后的寡肽等成分能全部溶于水液中。勻漿液可預(yù)先加熱至8010(TC，保溫1530分鐘，再放冷至酶解所需溫度，按以上操作方法酶解，其效果更強(qiáng)。按本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行酶解，當(dāng)胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白轉(zhuǎn)化力達(dá)到25.0時(shí)，酶解效果較為充分；酶活力越高，酶解速度越快、效果越好。按本發(fā)明的方法操作，土鱉蟲的抗凝血、溶血栓、抗菌等活性大大增強(qiáng)，優(yōu)于以往常用的土鱉蟲原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。參考臨床效果，土鱉蟲現(xiàn)已制成各種劑型口服應(yīng)用，療效較好。經(jīng)現(xiàn)代研究證明，土鱉蟲中的肽類成分為確切的有效部位。人體經(jīng)口服土鱉蟲后，經(jīng)胃蛋白酶及胰酶或胰蛋白酶的酶解、消化，以小分子肽類成分吸收而發(fā)揮療效。發(fā)明人根據(jù)人體口服土鱉蟲等動(dòng)物藥的過程，創(chuàng)造性的在體外采用人體仿生酶解的方法，先后對(duì)原料進(jìn)行胃蛋白酶、胰蛋白酶或胰酶酶解，和人體直接口服藥材原粉比較，所得被小腸吸收消化的有效物質(zhì)群相同，但體外酶解選擇較優(yōu)的試驗(yàn)條件，酶解的更充分，進(jìn)一步口服所得的藥效更強(qiáng)，注射或粘膜、皮膚等途徑用酶解成寡肽或小分子的活性部位群應(yīng)用更有效。經(jīng)過試驗(yàn)篩選，單獨(dú)以胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解土鱉蟲，效果均優(yōu)于原粉直接口服，但都低于本發(fā)明的仿生酶解方法。原粉直接服用，蛋白水解的不充分；水提、水提醇沉、乙醇提取使蛋白質(zhì)受熱變性而不溶于水，被濾過除去。仿生酶解是取土鱉蟲采用胃蛋白酶酶解，酶解后，繼續(xù)用胰蛋白酶或胰酶酶解，這是完全模擬人體仿生酶解法能得到更多小分子小肽、寡肽類物質(zhì)，療效更高。采用體外酶解得到的小分子寡肽可以通過小腸粘膜，也可以透過陰道粘膜及皮膚，直接進(jìn)入血液，發(fā)揮其藥效作用；若經(jīng)注射給藥，小分子寡肽發(fā)揮作用更直4接、迅速，同時(shí)沒有引入異蛋白，減小了毒副作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地將本發(fā)明小分子寡肽物質(zhì)群，配合適當(dāng)?shù)妮o料，制備成各種制成注射劑、口服制劑或外用制劑，如a、將酶解液直接噴霧干燥，加入適量的常規(guī)輔料如淀粉、乳糖、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉等制成膠囊劑、顆粒劑、片劑等制劑。b、將酶解液加熱至85'C殺酶后，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，可加入等滲調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑等制成小針或輸液；也可加入甘露醇、乳糖等凍干制成凍干粉針劑。c、將酶解液濾過，濾液以超濾膜超濾，截留分子量10kD以下的溶液，或?yàn)V液直接加卡波姆、殼聚糖等常規(guī)藥用輔料，制成凝膠劑、濕敷劑、噴霧劑等制劑。本發(fā)明提供的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物可以單獨(dú)使用，也可以與其他藥物成分聯(lián)合使用，艮P:在藥物活性成分中，可以只有該產(chǎn)物，還可以是其與其他藥物的混合物，達(dá)到配合治療、輔助治療的目的。本發(fā)明土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物可以在活血化瘀藥物中廣泛應(yīng)用，可用于治療心腦血管疾病，包括中風(fēng)、冠心病、心絞痛、腦血栓等；也可用于治療癌癥、跌打損傷等疾病，還可作為抗凝藥使用。有益效果為進(jìn)一歩驗(yàn)證本發(fā)明產(chǎn)物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)步效果，發(fā)明人進(jìn)行了動(dòng)物藥效學(xué)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中的"仿生酶解組"即為按本發(fā)明技術(shù)方案制得的土鱉蟲酶解產(chǎn)物一、體外抗凝血活性試驗(yàn)1、材料1.l動(dòng)物Wister大鼠，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。1.2藥品未酶解組取土鱉蟲藥材細(xì)粉(80目)40g，加入10倍量生理鹽水，勻漿30分鐘，攪勻，取l/4量，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；胃蛋白酶酶解組取l/4勻漿液，加入W胃蛋白酶(酶活力為1200U/g),同時(shí)調(diào)節(jié)pH至2.0,溫度為4(TC士2。C,保溫同時(shí)攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45pm)濾過，即得；胰蛋白酶酶解組取l/4勻漿液，加入1%胰蛋白酶(酶活力為2500U/mg)，同時(shí)調(diào)節(jié)pH至8.0，溫度為50'C土2。C，保溫同時(shí)攪拌酶解4h，85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45nm)濾過，即得；仿生酶解組取l/4勻漿液，加入1%胃蛋白酶(酶活力為1200U/g)，同時(shí)調(diào)節(jié)pH至2.0，溫度為40。C士2。C，保溫同時(shí)攪拌酶解4h，然后調(diào)pH至8.0，加入1%胰蛋白酶(酶活力為2500U/mg)，溫度為50。C土2。C，保溫同時(shí)攪拌酶解4h,85。C保溫20min，放冷，微孔濾膜(0.45—濾過，即得；空白對(duì)照組即生理鹽水組。1.3試劑胃蛋白酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20070914;胰蛋白酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20071228;胰酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20071025;牛纖維蛋白原，供凝血酶效價(jià)測(cè)定用，購(gòu)自中檢所，批號(hào)140626-200608;凝血酶，購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)20071101。2、方法與結(jié)果2.l試驗(yàn)方法大鼠腹腔靜脈取血，3.8%枸櫞酸鈉(1:9)抗凝，混合后，以3000r/min離心15分鐘，取上清液，得到貧血小板血漿(PPP)。取血漿O.lml，加入土鱉蟲不同酶解液0.lml，混勻，37。C保溫3min，再加入已預(yù)溫的凝血酶(10U/ml)0.2ml,混勻，記錄出現(xiàn)絮狀沉淀所需時(shí)間，即為凝血酶原時(shí)間(PT)。2.2試驗(yàn)結(jié)果土鱉蟲不同酶解工藝對(duì)應(yīng)的凝血酶原時(shí)間測(cè)定結(jié)果見表l。表l凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定結(jié)果(『5)組別凝血酶原時(shí)間(s)未酶解組48±1.43胃蛋白酶酶解組81±2.08胰蛋白酶酶解組99±3.15*仿生酶解組228±1.15**生理鹽水組14±2.29注與空白對(duì)照組比較，'P〈0.05，**P<0.01。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，仿生酶解工藝大大增加了土鱉蟲的抗凝血活性，均比其余酶解工藝?yán)硐耄^未酶解樣品具有極顯著性差異。二、體外溶栓活性試驗(yàn)1、材料1.l藥品各供試品溶液的制備方法同上。L2試劑瓊脂糖，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)20080204;考馬斯亮藍(lán)R-250，購(gòu)自上海展云化工有限公司，批號(hào)0708019;胃蛋白酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20070914;胰蛋白酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20071228;6胰酶，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20071025;牛纖維蛋白原，供凝血酶效價(jià)測(cè)定用，購(gòu)自中檢所，批號(hào)140626-200608;凝血酶，購(gòu)自珠海經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)20071101。2、方法與結(jié)果2.l試驗(yàn)方法取0.08g瓊脂糖，加入磷酸鹽緩沖液(PH7.6)10ml，加熱使溶解，冷卻至55'C，加入纖維蛋白原溶液(7mg/ml)0.8ml及凝血酶溶液(5U/ml)0.5ml,混勻，立即倒入已預(yù)熱的培養(yǎng)皿中，待基本冷卻后轉(zhuǎn)移至7'C冰箱中放置20min，用直徑O.5厘米打孔器打孔，即得。每個(gè)孔中均加入20nl對(duì)應(yīng)樣品液，以生理鹽水做對(duì)照。于37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22h。取出，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2030min，脫色液脫色，觀察纖維蛋白溶圈，記錄溶圈直徑。2.2試驗(yàn)結(jié)果土鱉蟲不同酶解工藝對(duì)應(yīng)的纖溶活性測(cè)定結(jié)果見表2。表2纖維蛋白溶圈測(cè)定結(jié)果(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與空白對(duì)照組比較承P〈0.05，**P<0.01;絕對(duì)纖溶活性均與空白組對(duì)比，以空白組為l。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，仿生酶解工藝大大增加了土鱉蟲的纖溶活性，均比其余酶解工藝?yán)硐耄^未酶解樣品具有顯著性差異。三、對(duì)大鼠凝血時(shí)間及靜脈血栓形成的影響1、材料1.l動(dòng)物Wister大鼠50只，雌雄各半，體重200土20g。購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。L2藥品各供試品溶液的制備方法同上。2、方法與結(jié)果2.l試驗(yàn)方法取Wistar大鼠50只，雌雄各半，體重200士20g，隨機(jī)分為5組，每組10只未酶解樣品組、胃蛋白酶酶解樣品組、胰蛋白酶酶解樣品組、仿生酶解樣品組、空白對(duì)照組，灌胃給藥每天l次，給藥劑量分別為10ml/kg，空白對(duì)照組灌胃給予同體積生理鹽水，連續(xù)7天。末次給藥后lh，各組動(dòng)物腹腔注射3.5%戊巴比妥鈉麻醉，剖腹分離下腔靜脈，于左腎靜脈下穿一絲線結(jié)扎下腔靜脈管，造成淤血，關(guān)閉腹腔。6h后，用內(nèi)徑為lnun的玻璃毛細(xì)管插入鼠內(nèi)眥靜脈叢取血，至毛細(xì)管血柱達(dá)5mm，每隔30s折斷毛細(xì)管一段，檢査有無出現(xiàn)凝血絲，計(jì)算毛細(xì)管采血到出現(xiàn)血凝絲時(shí)間，即為凝血時(shí)間。再次打開腹腔，于結(jié)扎下方2cm處夾閉血管，縱行剖開，取出血栓，記錄血栓有無并稱重。2.2試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見表3。表3對(duì)大鼠凝血時(shí)間及靜脈血栓形成的影響(^士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>與空白對(duì)照組比較(t檢驗(yàn))，'P<0.05,"P<0.01，***P<0.001。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，仿生酶解樣品組、胃蛋白酶酶解樣品組、胰蛋白酶酶解樣品組均可明顯延長(zhǎng)凝血時(shí)間，且仿生酶解樣品組優(yōu)于其余兩組，與空白對(duì)照組'比較具有顯著性差異，較未酶解樣品組效果好；仿生酶解樣品組、胃蛋白酶酶解樣品組、胰蛋白酶酶解樣品組均可明顯減小血栓濕重，且仿生酶解樣品組優(yōu)于其余兩組，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異，較未酶解樣品組效果好。四、對(duì)高脂血癥大鼠血清TC、TG、HDL-C的影響1、材料1.l動(dòng)物Wistar大鼠，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。1.2藥品與試劑仿生酶解樣品組、未酶解樣品組制備方法同上。陽(yáng)性對(duì)照藥取洛伐他汀2g,以水混懸至100ml。高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)試盒，總膽固醇(TC)測(cè)試盒，甘油三酯(TG)測(cè)試盒。1.3儀器ZS-3型半自動(dòng)生化測(cè)定儀。2、方法與結(jié)果2.l動(dòng)物模型的建立用1%膽固醇，0.2%甲基硫氧嘧啶，0.3%膽鹽，7.5%豬油，10%蛋黃粉，81%基礎(chǔ)飼料制成高脂飼料，喂飼大鼠。2.2試驗(yàn)方法大鼠適應(yīng)性詞養(yǎng)5天，禁食12h，檢測(cè)血清TC和TG，按體重和血脂水平將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、仿生酶解樣品組、未酶解樣品組、洛伐他汀組。除空白對(duì)照組喂飼甚礎(chǔ)飼料外，其金各細(xì)故喂髙脂飼料，平均毎鼠毎天18g，不足給予普通詞料補(bǔ)充。在給予高脂飼料的同時(shí)，灌胃給藥劑量均為10ml/kg，空白組和模型組灌胃給予同體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥30天，末次給藥后，禁食12h，下腔靜脈取血，酶法測(cè)定TC、TG、HDL-C。2.3試驗(yàn)結(jié)果對(duì)高脂血癥大鼠血清TC、TG、HDL-C的影響見表4。表4對(duì)高脂血癥大鼠血清TC、TG、HDL-C的影響(raraol/L，X±S,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，"P<0.01。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組大鼠血中TC、TG水平顯著高于空白對(duì)照組(P〈0.01)，HDL-C顯著低于空白對(duì)照組(P〈0.01)，提示造模成功；與模型對(duì)照組比較，仿生酶解樣品組和洛伐他汀組均能顯著降低TC、TG，并升高血HDL-C水平未酶解樣品組與模型對(duì)照組比較，能降低TC、TG，升高血HDL-C水平。五、對(duì)糖尿病大鼠模型高血糖的影響1、材料1.l動(dòng)物Wistar大鼠，購(gòu)自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。1.2藥品與試劑仿生酶解樣品組、未酶解樣品組的制備方法同上。陽(yáng)性對(duì)照藥取優(yōu)降糖3g，以水混懸至100ml。1.3儀器血糖分析儀。2、方法與結(jié)果2.l試驗(yàn)方法選取健康大鼠100只，體重200土20g，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)l周，室溫18。C24'C。造糖尿病模型前禁食12h后，從大鼠尾靜脈取血，使用血糖分析儀測(cè)血糖值，選取血糖值在5.0咖ol/L6.0mraol/L范圍內(nèi)大鼠以55mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射；72h后禁食2h并取血測(cè)血糖，選擇血糖值相近的大鼠50只，隨機(jī)分為5組模型組、優(yōu)降糖組、仿生酶解樣品組、未酶解樣品組，另取血糖值在5.0咖ol/L6.0咖ol/L范圍內(nèi)大鼠10只作為空白對(duì)照組，各組灌胃給藥劑量均為10ml/kg，空白組灌胃給予同體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)14d，9分別于給藥期間第3天、第7天、第14天禁食12h取血，測(cè)血糖值。2.2試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5對(duì)糖尿病大鼠模型高血糖的影響(又土S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與模型組比較，'P<0.05，**P<0.01。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，以55mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射后可使大鼠血糖明顯升高，仿生酶解樣品組及優(yōu)降糖組，第7天血糖明顯降低，第14天其降糖作用更為明顯；未酶解樣品組第14天降糖作用較為明顯，仿生酶解樣品組優(yōu)于未酶解樣品組。六、對(duì)荷瘤小鼠的影響1、材料1.1試驗(yàn)動(dòng)物Sw。腫瘤腹水傳代小鼠，購(gòu)自吉林省腫瘤研究所；昆明種小鼠，SPF級(jí)，安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(皖)2005-0001號(hào)。1.2受試藥物仿生酶解樣品組、未酶解樣品組的制備方法同上。陽(yáng)性對(duì)照藥取環(huán)磷酰胺2g，以水混懸至100ml。2、方法與結(jié)果2.l實(shí)驗(yàn)方法取昆明種小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性藥組、仿生酶解樣品組、未酶解樣品組。選取移植腫瘤7天，腫瘤生長(zhǎng)良好，腹部膨隆明顯的腹水傳代小鼠，腹部皮膚消毒，用一次性無菌采血器經(jīng)腹壁剌入腹腔，抽取腹水放入無菌燒杯中以生理鹽水稀釋成1:3的癌細(xì)胞混懸液，于各組每只試驗(yàn)昆明種小鼠的右腋下接種0.2ml。各組小鼠于接種腫瘤次日開始每天灌胃給予相應(yīng)供試品0.25ml/10g，空白對(duì)照組灌胃給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥30天。給藥結(jié)束次日，將各組試驗(yàn)小鼠稱重后處死，剝離出皮下腫塊稱重，比較各組腫瘤生長(zhǎng)情況。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。表6對(duì)小鼠(接種S湖)腫瘤生長(zhǎng)的影響(X±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與對(duì)照組比較，*P<0.05，"P<0.01。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，仿生酶解樣品組具有明顯的抗腫瘤作用，對(duì)S,8。小鼠移植性腫瘤的抑瘤率較高；而未酶解樣品組與對(duì)照組相比仍具有一定的顯著性差異(P<0.05)，可見本發(fā)明制得的仿生酶解樣品具有明顯的抗腫瘤作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)論，提示本發(fā)明酶解產(chǎn)物對(duì)于中風(fēng)、冠心病、心絞痛、腦血栓、腫瘤、跌打損傷等疾病具有較好的治療效果，還可以作為抗凝藥使用。具體實(shí)施例方式下面列舉實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明，各實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明-實(shí)施例l取土鱉蟲500g，加10倍量水勻漿，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，加入5g胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2小時(shí)，以lX氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加入5g胰酶于5(TC保溫酶解4小時(shí)，噴霧干燥，加入適量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填裝膠囊。實(shí)施例2取土鱉蟲500g，力n8倍量水勻漿，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.6，加入10g胃蛋白酶于37'C保溫酶解3小時(shí)，以l^氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，加入10g胰蛋白酶于4(TC保溫酶解6小時(shí)，噴霧干燥，加入適量的微晶纖維素，制粒，干燥，整粒，壓制成片。實(shí)施例3取土鱉蟲500g，加15倍量水勻漿，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.0，加入25g胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2小時(shí)，以lX氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5,加入25g胰蛋白酶于45。C保溫酶解5小時(shí)，加熱至85'C保溫15分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，制成注射液。實(shí)施例4取土鱉蟲500g，加15倍量水勻漿，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.5，加入2.5g胃蛋白酶于40。C保溫酶解1小時(shí)，以l^氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加入2.5g胰酶于5(TC保溫酶解3小時(shí)，加熱至95'C保溫30分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量5kD以下的溶液，加入甘露醇，11冷凍干燥，制成凍干粉針劑。實(shí)施例5取土鱉蟲250g、水蛭250g，加15倍量水勻漿，以稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，加入2.5g胃蛋白酶于4(TC保溫酶解2小時(shí)，以lX氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，加入2.5g胰蛋白酶于50'C保溫酶解4小時(shí)，加熱至85'C保溫15分鐘，濾過，濾液以超濾膜超濾，分取截留分子量10kD以下的溶液，加卡波姆，潤(rùn)脹12小時(shí)，加三乙醇胺調(diào)pH8，攪勻，放置12h，攪勻，制成凝膠劑。實(shí)施例6取實(shí)施例3所制得注射劑治療腦中風(fēng)患者48例，男37例，女ll例，年齡最小的45歲，最大的77歲；病程最短5h，最長(zhǎng)4天，48例中合并高血壓、冠心病、糖尿病17例，有其它合并癥24例，無合并癥7例。全部病例均經(jīng)頭顱CT或頭顱核磁共振(MRI)證實(shí)為顱內(nèi)動(dòng)脈或椎基底動(dòng)脈系統(tǒng)的血栓形成。治療方案注射，每次10ml，每日1次。用藥30天后復(fù)查，基本痊愈和顯著進(jìn)步患者例數(shù)38例，占79.2%,癥狀明顯改善患者例數(shù)7例，占14.6%。權(quán)利要求1、一種土鱉蟲的仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取土鱉蟲，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.0～3.0，加入胃蛋白酶于35～45℃保溫酶解0.5～4小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至7.5～8.5，加入胰酶或胰蛋白酶于40～50℃保溫酶解2～8小時(shí)，即得。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的取土鱉蟲，加水勻漿，調(diào)節(jié)pH至1.52.5，加入土鱉蟲量0.5%5%的胃蛋白酶于3545'C保溫酶解13小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至7.58.5，加入土鱉蟲量0.5%5%的胰酶或胰蛋白酶于405(TC保溫酶解36小時(shí)，即得。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于該產(chǎn)物是按以下方法制備的1取土鱉蟲，加水勻槳，調(diào)節(jié)pH至2.0，加入土鱉蟲量1%2%的胃蛋白酶于4(TC保溫酶解13小時(shí)，再調(diào)節(jié)pH至8.0，加入土鱉蟲量1%2%的胰酶或胰蛋白酶于50匸保溫酶解36小時(shí)，即得。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于將土鱉蟲加水勻漿后先加熱至80100'C并保溫1530分鐘后，再放冷至所需溫度進(jìn)行酶解。5、根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物，其特征在于所用的胃蛋白酶的酶活力不低于1200U/g，胰蛋白酶的酶活力不低于2500U/mg，胰酶的酪蛋白轉(zhuǎn)化力不低于25.0。6、權(quán)利要求1至5中任一所述的土鱉蟲仿生酶解方法。7、權(quán)利要求1至5中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物在制備用于活血化瘀的藥物中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求1至5中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物在制備用于治療心腦血管和腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1至5中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物在制備用于抗凝的藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求1至5中任一所述的土鱉蟲仿生酶解產(chǎn)物在制備用于治療跌打損傷的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種土鱉蟲的仿生酶解產(chǎn)物及其用途，屬中藥領(lǐng)域。其技術(shù)方案是采用仿生酶解的方法，取土鱉蟲，加水勻漿后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，先以胃蛋白酶保溫酶解，再以胰酶或胰蛋白酶保溫酶解，所得的酶解物按不同的制劑要求制成制劑。本發(fā)明產(chǎn)物在治療心腦血管疾病及跌打損傷等方面具有良好效果。文檔編號(hào)A61K35/56GK101647822SQ200810118148公開日2010年2月17日申請(qǐng)日期2008年8月13日優(yōu)先權(quán)日2008年8月13日發(fā)明者張加余,魏永利申請(qǐng)人:北京凱瑞創(chuàng)新醫(yī)藥科技有限公司