專利名稱：：一種紫花苜蓿皂苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種紫花苜?？傇碥盏闹苽浞椒?，屬于制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：紫花苜蓿(Medcagos加'raLinn.)為一種豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Faboideae)苜蓿屬植物。除作為優(yōu)良的牧草外，紫花苜蓿在抗旱、抗風(fēng)沙、改良土壤、防止水土流失、保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面同樣具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。紫花苜蓿含有黃酮、三萜皂苷、生物堿、香豆素等多種次生代謝產(chǎn)物，在抗血栓、鎮(zhèn)痛、消炎、抗氧化、抗菌、抗蟲、化感等方面具有廣泛的生物活性。紫花苜蓿中三萜成分主要為齊墩果烷(Oleanane)型五環(huán)三萜及其配糖體。根據(jù)苷元類型可將苜蓿三萜化合物細(xì)分為苜蓿酸(Medicagenicacid)型、常春藤皂苷元(Hederagenin)型、貝萼皂苷元(Bayogenin)型、大豆皂苷元B(SoyasapogenolB)型、大豆阜苷元E(SoyasapogenolE)型、Zanhicacid型。大孔吸附樹脂(Macroporousadsorptionresin)是吸附性和分子篩性原理相結(jié)合的分子材料，具有很好的吸附和分離性能，己廣泛應(yīng)用于制藥和天然活性成分提取。利用水醇交替洗脫，能夠很好地將天然提取物水分散液中的目標(biāo)產(chǎn)物提取出來。本發(fā)明采用80%乙醇在80°C下回流提取，濃縮后獲得乙醇提取物(浸膏)，經(jīng)石油醚脫脂后，用AB-8大孔吸附樹脂純化獲得總皂苷。本發(fā)明的目的是提供一種能夠滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要的苜?？傇碥罩苽浞椒ǎ捎迷摲椒ǖ玫降目傇碥针s質(zhì)少，純度高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及苜蓿皂苷的提取、純化和水解，提供如下的技術(shù)方法。1、苜蓿乙醇提取物的制備采用80"M)乙醇在80。C下回流提取苜蓿材料，濃縮后獲得乙醇提取物，得率為19.03%(g/g干重)。2、苜蓿皂苷的全水解和水解系數(shù)將苜?？傇碥赵谒嵝詶l件下進(jìn)行全水解，獲得苷元，總皂苷量和苷元量的比值(即水解系數(shù))為2.03。3、苜蓿皂苷相對含量的測定以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，通過化學(xué)反應(yīng)，采用分光光度法，建立含量分析的線性方程(r=10.572^-0.0073)，得出皂苷元的量，通過總皂苷量和苷元量的比值可得出苜蓿皂苷的相對含量。4、AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿皂苷的靜態(tài)吸附率和解吸率AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿皂苷的靜態(tài)吸附率和解吸率分別為11.38mg/gdw和50.61%。5、在AB-8大孔吸附樹脂柱中30%乙醇和卯％乙醇對苜蓿皂苷的解吸率在AB-8大孔吸附樹脂柱中低濃度(30%)乙醇和高濃度(卯％)乙醇對苜蓿皂苷的解吸率分別為25.98mg/gdw禾卩95.11mg/gdw。6、AB-8大孔吸附樹脂最大吸附量隨著上樣量的增加，AB-8大孔吸附樹脂的吸附量也在增加，當(dāng)上樣量樹脂量(dw)=1.0:U(g/g)時(shí)，吸附量達(dá)到最大值。7、AB-8大孔吸附樹脂過量上樣分析當(dāng)上樣量達(dá)到AB-8大孔吸附樹脂最大吸附量后，再增加上樣量，即開始出現(xiàn)泄漏，故對泄漏的水層洗脫物進(jìn)行第二次上樣，觀察上樣量與吸附量之間的關(guān)系。兩次合計(jì)90%乙醇洗脫物與總上樣量比值的平均值為0.0925，即苜蓿粗皂苷量(采用重短法求得)占總浸膏的9.25%。采用比色法測定，粗總皂苷的純度為40%,總浸膏中皂苷含量為3.7%。8、AB-8大孔吸附樹脂洗脫動(dòng)態(tài)通過重量法和比色法分別測定不同洗脫梯度下洗脫物和皂苷量，兩種方法測定的結(jié)果類似。15%-35%乙醇洗脫量較低，當(dāng)用45%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫物量明顯增加，在55°/。-65%乙醇洗脫梯度下，洗脫量達(dá)到最大，隨后洗脫量逐漸減小。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明將獲得的苜蓿乙醇提取物用水混懸后，經(jīng)石油醚脫脂，直接過大孔吸附樹脂，與傳統(tǒng)的用正丁醇萃取后再過大孔吸附樹脂相比，減少了工藝流程，節(jié)約了成本。本發(fā)明首次明確了苜蓿皂苷和苜蓿皂苷元的比值關(guān)系為2.03,同時(shí)研究了AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿皂苷的吸附動(dòng)態(tài)，制備的苜蓿粗總皂苷中，皂苷含量達(dá)到40%以上。目的是充分利用苜蓿植物資源，大規(guī)模獲得高純度的皂苷活性成分，為苜蓿皂苷類活性成分的開發(fā)與利用提供依據(jù)。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l:苜蓿乙醇提取物的制備稱取500g苜蓿地上部分干粉，置于5000mL圓底燒瓶中，按料液比1:8(g:mL)加入80%乙醇4000mL進(jìn)行提取，先浸泡過夜，然后在80。C下回流提取3h(重復(fù)3次)。將提取液合并，濃縮至小體積同時(shí)無醇味，加入適量蒸餾水定容至500mL，再加入等體積的石油醚(沸程為60-90°0進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3次。分別將石油醚層和水層提取物濃縮蒸干，石油醚層為19.55g,得率為3.91°/。水層75.61g，得率為15.12%;乙醇提取物得率為19.03%。實(shí)施例2:苜蓿皂苷的全水解和水解系數(shù)的獲得取一定量的純苜蓿總皂苷(含量95%)約450mg-500mg(重復(fù)3次)，加入100mL用50%乙醇配制的10%鹽酸溶液，80。C下水解4h后，在冰浴中冷卻，用100mL氯仿萃取，重復(fù)3次，合并氯仿萃取部分，水洗氯仿層(每次300mL蒸餾水，重復(fù)3次)，在40。C下減壓濃縮氯仿部分，稱重，結(jié)果見表l，水解物用薄層層析(TLC)檢測，表明水解徹底，水解產(chǎn)物中主要苷元有3個(gè)，Rf值分別為0.537、0.426和0.370。薄層檢測條件如下正相硅膠(青島海洋化T.有限公司)；展開系統(tǒng)為氯仿甲醇=20:1(v/v):顯色劑為甲醇:醋酸酐:濃硫酸=50:5:5(v/v)?？傇碥樟亢涂傇碥赵康谋戎禐?.03(w/w)。表l苜蓿皂苷量和總皂苷元量的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例3:苜?？傇碥盏暮繙y定精密稱取5.01mg齊墩果酸(Oleanolicacid)標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)，溶于5.0mL容積的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。分別吸取40nL、50pL、60)aL、70pL、80^iL、卯^L、100和120nL置于lOmL具塞試管中，水浴(40。C)揮千甲醇，試管中齊墩果酸的量分別為0.04008mg、0.05010mg、0.06012mg、0.07014mg、0.08016mg、0.09018mg、0.1002mg和0.12024mg,待冷卻后分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL，振搖溶解后分別加入0.8mL高氯酸，搖勻后置于70。C水浴中加熱15min，然后用冰迅速冷卻，再各加入冰醋酸5mL,充分振搖，靜止10min后于545rnn處測定吸光度。得回歸方程7=10.572X-0.0073(相關(guān)系數(shù)及=0.99201;K為545nm處的光吸收值；義為每管中的齊墩果酸的量，單位為mg/tube)。為了檢測苜蓿樣品(提取物、粗總皂苷)中總皂苷的含量，取一定量樣品^mg,溶于5.0mL容積的容量瓶中，取一定體積SnL于10mL具塞試管中(重復(fù)3次)，操作步驟同于上述齊墩果酸的含量測定，將545nm處的光吸收值F代入方程J^10.572^-0.0073,即可求出X(即每管中的皂苷元量，mg/tube),從而得出每管中總皂苷量為2.03%mg,首蓿樣品中總皂苷含量計(jì)算公式如下2.03x義x5000苜蓿樣品中總皂苷含量(Q/。)=_x100jx丑實(shí)施例4:大孔吸附樹脂及其預(yù)處理采用的AB-8大孔吸附樹脂系天津市海光化丄有限公司生產(chǎn)，是苯乙烯型弱極性共聚體，為乳白色顆粒，粒徑范圍為0.3-1.25mm(60-16目)，比表面積為480-520m2/g,孔徑為13.0-14.0nm。稱取20g鮮重(折算成干重12g)的AB-8大孔吸附樹脂，浸泡于95%乙醇中，再將其加入到內(nèi)徑為1.6cm的玻璃柱(柱高13cm，徑高比為1:8)內(nèi)，使乙醇液面高于樹脂約2cm,浸泡24h,充分溶脹。然后用2BV/h的流速淋洗樹脂，至流出液加入少量蒸餾水后不出現(xiàn)白色渾濁為止。然后用2BV的5%HC1溶液浸泡2-4h后淋洗，再用2BV的2%NaOH溶液浸泡2-4h后淋洗，最后用蒸餾水淋洗至pH為中性。實(shí)施例S:AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿粗皂苷的靜態(tài)吸附率和解吸率稱取預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂2.0g鮮重(折算為1.20g干重)于50mL容積三角瓶中，加入20mL苜蓿乙醇提取液(提取物濃度為19.6mg/mL)。封口后將三角瓶置于恒溫(25。C)振蕩器中，振蕩24h，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。充分吸附后，過濾，濾液濃縮，稱重，AB-8樹脂的吸附率見表2。向吸附飽和的樹脂中加入40mL95。/o乙醇，封口后將三角瓶置于恒溫(25。C)振蕩器中，振蕩24h,轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。充分解吸后，過濾，濾液濃縮，稱重，AB-8樹脂的解吸率見表2。吸附率和解吸率計(jì)算公式如下吸附前后溶液中粗皂苷濃度之差(mg/mL)x溶液體積(mL)吸附率(mg/gdw)=_大孔吸附樹脂質(zhì)量(gdw)解析液中粗皂苷濃度(mg/mL)x解析液體積(mL)解吸率(％)=_大孔吸附樹脂質(zhì)量(gdw)x吸附率(mg/gdw)表2AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿皂苷的靜態(tài)吸附率及解吸率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例6:在AB-8大孔吸附樹脂柱中30%乙醇和卯％乙醇對苜蓿皂苷的解吸率稱取苜蓿提取浸膏10g,溶于100mL水中(濃度為100mg/mL),加入AB-8大孔吸附樹脂柱中，樹脂鮮重20g(折算成干重12g),柱高13cm,柱內(nèi)徑1.6cm,以2BV/h的流速，逐次用5BV水、5BV30%乙醇、5BV90。/。乙醇進(jìn)行洗脫。棄水洗脫液，分別收集30%乙醇洗脫液、90%乙醇洗脫液，濃縮，稱取干重，分別計(jì)算30%乙醇和90%乙醇洗脫液的解吸率，結(jié)果見表3。在吸附樹脂柱中AB-8大孔吸附樹脂對苜蓿皂苷的解吸率計(jì)算公式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>表3在吸附樹脂柱中AB-8大孔吸附樹脂的解吸率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例7:AB-8大孔吸附樹脂最大吸附量取預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂20.0g(折算成12g干重)若干份，分別裝柱。然后依次用不同濃度的苜蓿乙醇提取物上柱，考察AB-8大孔吸附樹脂吸附量動(dòng)態(tài)。在初步確定最大吸附量后，選擇最大吸附量的50%-80%苜蓿提取液上樣，再依次用5BV水、5BV30%乙醇、5BV90%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮后稱重，并對不同洗脫液的濃縮物重量進(jìn)行比較，從而考察AB-8大孔吸附樹脂最大吸附量，結(jié)果見表4。隨著上樣量的增加，AB-8大孔吸附樹脂的吸附量也在增加，當(dāng)上樣量樹脂量(dw)=1.0:1.1(g/g)時(shí)，吸附量達(dá)到最大值，此時(shí)卯％乙醇解吸率為108.375mg/gdw,之后隨著上樣量增加，吸附量不再明顯增加，說明這時(shí)樹脂已達(dá)到飽和。對飽和前的上樣量進(jìn)行趨勢分析，上樣量與卯％乙醇解吸率(mg/gdvv)的線性關(guān)系為r=0.0077AT-0.2446,W=0.9918;JT為90%乙醇解吸率(mg/gdw),JT為每次上樣量(mg)，/為相關(guān)系數(shù)。由于上樣量與90。/。乙醇層解吸率具有較好的線性關(guān)系，從而可以預(yù)測在不同上樣量情況下，90%乙醇解吸率。表4AB-8大孔吸附樹脂最大吸附量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例8:AB-8大孔吸附樹脂過量上樣分析取預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂20.0g(折算成12g干重)4份，分別裝柱。當(dāng)上樣量(苜蓿乙醇提取物)達(dá)到AB-8最大吸附量后，再增加上樣量，即開始出現(xiàn)泄漏，故對泄漏的水層洗脫物進(jìn)行第二次上樣，觀察上樣量與吸附量之間的關(guān)系。兩次合計(jì)卯。/。乙醇洗脫物與總上樣量比值的平均值為0.0925,即苜蓿粗皂苷量占總浸膏的9.25%(注總浸膏中純皂苷含量為3.7%)，結(jié)果見表5。采用比色法，測定粗總皂苷中的皂苷濃度為40。/。。表5AB-8大孔吸附樹脂過量上樣分析<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注第二次上樣量為對應(yīng)的第一次水洗脫部分。實(shí)施例9:AB-8大孔吸附樹脂洗脫動(dòng)態(tài)對AB-8大孔吸附樹脂的洗脫動(dòng)態(tài)的考察，可以有效確定洗脫液的乙醇濃度和洗脫范圍，獲得高純度的苜蓿皂苷。取預(yù)處理過的AB-8大孔樹脂20.0g(折算成12g干重)裝柱，采用2.9654g粗皂苷(即90%乙醇洗脫部分，皂苷含量為40%)過量裝柱，用蒸餾水過量洗脫后，分別用5BV15。/。乙醇、5BV25W乙醇、5BV35o/。乙醇、5BV45。/。乙醇、5BV55。/。乙醇、5BV65。/。乙醇、5BV75。/。乙醇、5BV85%乙醇和5BV95%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮稱干重。分別釆用重量法和比色法對不同洗脫梯度苜蓿皂苷含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。通過重量法和比色法分別測定不同洗脫梯度下洗脫物和皂苷含量，兩種方法的測定結(jié)果一致。釆用濃縮后稱量法，可以看出在15%-35%乙醇洗脫物量較低，當(dāng)用45%乙醇進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫物量明顯增加，在55%-65%乙醇洗脫梯度下，洗脫量達(dá)到最大，隨后洗脫量在逐漸減小。采用比色法測定不同洗脫梯度下苜蓿皂苷含量，發(fā)現(xiàn)在55%乙醇層苜蓿皂苷含量最高，在55%-75%乙醇層苜蓿皂苷含量相對較多。綜上所述，采用乙醇提取物上樣量和樹脂干重的比值低于1.0:1.1,先用過量水洗脫，然后用5bv30%乙醇(即本專利所述的低濃度乙醇)洗脫，再用5bv卯。/。乙醇(即本專利所述的髙濃度乙醇)洗脫并收集洗脫液，可獲得純度為40。/。的苜?？傇碥铡１?ab-8大孔吸附樹脂的洗脫動(dòng)態(tài)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征包括以下幾個(gè)步驟(1)苜蓿地上部分粉碎后，采用乙醇同流提取，濃縮后得乙醇提取物。(2)將乙醇提取物用水混懸，除去極性小的成分。(3)過大孔吸附樹脂柱，先用水洗脫，然后用低濃度的乙醇洗脫，最后用高濃度的乙醇洗脫，濃縮高濃度乙醇洗脫液得粗總皂苷。(4)將總皂苷進(jìn)行水解，可獲得皂苷元，從而求出總皂苷與皂苷元的比值。2、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(1)中加入的乙醇濃度為80%。3、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(1)中加入80%乙醇量(mL)與苜蓿干粉(g)的比值為8:1。4、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(1)中獲得的乙醇提取物得率為19.03%，皂苷含量為3.7%。5、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(2)中用沸程為60-90°C的石油醚萃取，去除極性小的成分。6、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(3)用石油醚萃取后，直接過大孔吸附樹脂柱。7、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(3)中的大孔吸附樹脂為AB-8型號，為苯乙烯型弱極性共聚體。8、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(3)中乙醇提取物上樣量(g)和大孔吸附樹脂干重(g)的比值低于1.0:1.1。9、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(3)中獲得的粗總皂苷，皂苷濃度為40%。10、根據(jù)權(quán)利要求1的紫花苜蓿皂苷的制備方法，其特征是，步驟(4)中獲得的皂苷元，總皂苷量與皂苷元量的比值為2.03。全文摘要本發(fā)明涉及一種提純紫花苜蓿皂苷的方法。本發(fā)明所述的皂苷是用80％乙醇從紫花苜蓿的上部分提取，經(jīng)石油醚脫脂，AB-8大孔吸附樹脂純化而來。本發(fā)明首次明確苜蓿總皂苷量和苷元量的比值為2.03，同時(shí)明確了AB-8大孔吸附樹脂的最大皂苷吸附量和洗脫動(dòng)態(tài)，制備的苜蓿總皂苷中，皂苷含量不低于40％，可用于醫(yī)藥、食品等工業(yè)領(lǐng)域。文檔編號A61K36/48GK101361785SQ200810119949公開日2009年2月11日申請日期2008年9月12日優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日發(fā)明者周立剛,柱玉,王薊花,趙江林,韓建國,黃永富申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)