專利名稱：細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及復(fù)合物及制備方法，尤其涉及一種細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因 載體組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
樹(shù)枝狀聚合物作為一種人工合成的新型納米材料，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了日益廣泛的關(guān)注，在藥物釋放、基因傳遞和醫(yī)療診斷等
方面具有廣闊的應(yīng)用前景[高分子學(xué)報(bào),2006， (4): 574-580]。樹(shù)枝狀聚合物作為一 種新型納米級(jí)基因載體，具有無(wú)免疫原性及遺傳毒性的優(yōu)點(diǎn)，成為該領(lǐng)域的研 究熱點(diǎn)之一[Adv. Drug Deliv. Rev， 2005, 57: 2106- 2129]。
目前，聚酰胺-胺(PAMAM)樹(shù)枝狀聚合物是基因載體領(lǐng)域中受到廣泛關(guān) 注的樹(shù)枝狀聚合物之一。PAMAM-DNA復(fù)合物可保護(hù)DNA避免酶的降解，且 PAMAM分子結(jié)構(gòu)外表面具有大量的官能團(tuán)，可以進(jìn)行多重修飾。生物相容性 和溶解性能是影響基因載體應(yīng)用的因素之一。研究發(fā)現(xiàn)[國(guó)外醫(yī)學(xué)兒科學(xué)分冊(cè)， 2004，31:96~98]， PAMAM表現(xiàn)出濃度及大小依賴的毒性，其分子代數(shù)和濃度越 高，細(xì)胞毒性越強(qiáng)。G5代PAMAM在10 Umol/L濃度時(shí)顯示出細(xì)胞毒性，而 G7代PAMAM在5 u mol/L濃度下即可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。隨著研究的深入，人們 開(kāi)始關(guān)注樹(shù)枝狀聚合物的表面功能化修飾。Jevp Rasesphant等[Int J Pharm , 2003, 252: 263-266]的研究結(jié)果表明，用月桂?；騊EG鏈對(duì)PAMAM樹(shù)枝狀聚合物 進(jìn)行表面修飾，可以明顯降低其細(xì)胞毒性，提高其生物相容性。
模擬生物膜結(jié)構(gòu)的新型生物相容性材料的研究引起了極大的關(guān)注。研究表 明，細(xì)胞膜外層具有雙性電荷結(jié)構(gòu)的磷酸膽堿極性頭部可以與水分子形成非常 牢固的水合層，減弱蛋白與其的相互作用，可以有效地改善材料的血液相容性。 近年來(lái)，將細(xì)胞膜仿生的磷酸膽堿設(shè)計(jì)用于納米材料的表面改性和設(shè)計(jì)，為解 決納米材料在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中所面臨的溶解性、穩(wěn)定性和生物相容性等問(wèn)題提 供了良好的思路。與以聚氧乙烯為親水段的聚合物膠束相比，以磷酸膽堿聚合 物為親水段的聚合物膠束顯示出更為優(yōu)異的生物相容性[J Contro Release, 2005, 107 (3): 502-512]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞膜仿生修飾的納米基 因載體組合物及其制備方法。
細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物由仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物 與基因通過(guò)靜電作用復(fù)合而成，仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物與基因的重量
比為1:10 10:1，基因?yàn)楹芯幋a遺傳標(biāo)記的DNA序列，遺傳標(biāo)記選自熒光蛋 白基因。
所述的仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物是表面同時(shí)含有氨基和磷酸膽堿基 團(tuán)的聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物，氨基與磷酸膽堿基團(tuán)的摩爾比為1:10 100:1。 細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物的制備方法包括如下步驟
1) 1重量份末端含氨基的0 6代聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和0.01 100重量 份細(xì)胞膜仿生單體甲基丙烯酸磷酸膽堿酯或丙烯酸磷酸膽堿酯加入到10-10000 重量份水中，加熱到20 200'C，反應(yīng)0.5 100小時(shí)，以透析袋透析1 100小 時(shí)，冷凍真空干燥10 100小時(shí)后得到細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺；
2) 細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物用5毫摩爾/升pH 5.5醋酸一醋 酸鈉緩沖溶液溶解，配成0.1 10毫克/毫升的溶液，用孔徑0.22微米濾膜將 溶液過(guò)濾；
3) 熒光蛋白基因用4.3毫摩爾/升硫酸鈉溶液溶解配制成50 250ug/ml 的溶液；
4) 將細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和熒光蛋白基因溶液分別預(yù)熱 至55°C，然后按載體與熒光蛋白基因溶液體積比1: 1在渦旋混合儀上混合1分 鐘，室溫靜置0.5 1小時(shí)，細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和熒光蛋白 基因通過(guò)靜電作用復(fù)合成納米復(fù)合物溶液。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果
1) 經(jīng)細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表面含有的磷酸膽堿基團(tuán)為細(xì)胞膜的組成 部分，使得載體具有良好的生物相容性；
2) 細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表面含有豐富的正電荷性氨基，能與基因通過(guò) 靜電作用進(jìn)行有效的復(fù)合；
3) 聚酰胺-胺表面的磷酸膽堿基團(tuán)為兩性離子結(jié)構(gòu)，使得納米基因載體組合物 在寬pH范圍和鹽濃度下都具有優(yōu)異的分散性和穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明利用聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物外層的部分氨基與細(xì)胞膜仿生磷酸膽堿 單體發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚酰胺-胺的表面仿生修飾，獲得細(xì)胞膜仿生 修飾的聚酰胺-胺，控制細(xì)胞膜仿生磷酸膽堿單體的接枝率，獲得表面含有剩余 氨基的仿生修飾的聚酰胺-胺，該仿生修飾的聚酰胺-胺表面含有正電荷，可以與
基因進(jìn)行復(fù)合，仿生修飾聚酰胺-胺和基因所形成的納米基因載體組合物能實(shí)現(xiàn) 基因的有效締合、保護(hù)、傳遞與釋放。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1:
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成
以外層為氨基的第5代聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物(PAMAM)與細(xì)胞膜仿生 單體丙烯酸磷酸膽堿酯(APC)作為原料，制備磷酸膽堿修飾的聚酰胺-胺樹(shù)枝
狀聚合物，具體制備步驟如下
在lOOmL三口燒瓶中加入APC (4g,0.014mo1)的甲醇溶液(20mL)，通 氮?dú)獗Ｗo(hù)，在0"C逐滴加入第五代PAMAM (G5， 1 g, 4.85X10—5 mol)的甲醇溶 液(10 mL)，滴加完畢后反應(yīng)體系在0i:下繼續(xù)攪拌30 min，然后在室溫下反 應(yīng)72 h。反應(yīng)完畢后經(jīng)透析除去未反應(yīng)單體，凍干得到粉末狀固體產(chǎn)物。核磁 和紅外證實(shí)所獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，4電位的測(cè)定表明仿生修飾的聚酰 胺-胺表面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備
質(zhì)粒DNA用4.3 mmol/L硫酸鈉溶液溶解配制成100 y g/ml的溶液；細(xì)胞膜 仿生修飾聚酰胺-胺溶于5 mmol/L pH 5.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，用孔徑0.22 微米濾膜將溶液過(guò)濾；將細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺和質(zhì)粒DNA溶液分別預(yù)熱 至55'C，在N/P值為IO的條件下，將細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺溶液加入到等 體積的DNA溶液中，在渦旋混合儀上混合1分鐘，室溫靜置0.5小時(shí)。
動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效 的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染:
將HEK293細(xì)胞種植到24孔聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞種植密度為1 X 1()S細(xì)胞/ L。置于5 % C02， 37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間使細(xì)胞融合率達(dá)到70% 左右。去除培養(yǎng)基，每孔加入100"L基因締合體溶液(含10ugpEGFP質(zhì)粒) 與卯0uL新鮮培養(yǎng)基溶液(含10%胎牛血清)，繼續(xù)培養(yǎng)，使pEGFP質(zhì)粒在 細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)綠色熒光蛋白。培養(yǎng)72h后，采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形 貌，定性研究綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍 然具有較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例2
(1)磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成除了反應(yīng)原料采用第4代聚酰胺
-胺樹(shù)枝狀聚合物外，其他實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。核磁和紅外證實(shí)所獲得的產(chǎn)物 具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，^電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表面仍然帶正 電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備同實(shí)施例1。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡
結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例3
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成除了反應(yīng)原料采用甲基丙烯酸磷 酸膽堿酯外，其他實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例l。核磁和紅外證實(shí)所獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期 的結(jié)構(gòu)，C電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備同實(shí)施例1。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡
結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例4
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成同實(shí)施例l。核磁和紅外證實(shí)所
獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，c電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表
面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備除N/P調(diào)整為5外其他實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例
1。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的
與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例5
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成同實(shí)施例l。核磁和紅外證實(shí)所 獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，C電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表 面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備除N/P調(diào)整為20外其他實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施
例1。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有
效的與DNA復(fù)合。
G)基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例6
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成同實(shí)施例2。核磁和紅外證實(shí)所 獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，；電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表 面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備同實(shí)施例4。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡
結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例7
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成..同實(shí)施例3。核磁和紅外證實(shí)所 獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，^電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表 面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備同實(shí)施例4。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡 結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
實(shí)施例8
(1) 磷酸膽堿仿生修飾聚酰胺-胺的合成同實(shí)施例l。核磁和紅外證實(shí)所
獲得的產(chǎn)物具有預(yù)期的結(jié)構(gòu)，c電位的測(cè)定表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺表 面仍然帶正電荷。
(2) 基因超分子組裝體的制備同實(shí)施例5。動(dòng)態(tài)光散射和原子力顯微鏡 結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺可以有效的與DNA復(fù)合。
(3) 基因轉(zhuǎn)染同實(shí)施例l。結(jié)果表明細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺仍然具有
較高的轉(zhuǎn)染效率。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物，其特征在于它由仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物與基因通過(guò)靜電作用復(fù)合而成，仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物與基因的重量比為1∶10～10∶1，基因?yàn)楹芯幋a遺傳標(biāo)記的DNA序列，遺傳標(biāo)記選自熒光蛋白基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物，其特 征在于所述的仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物是表面同時(shí)含有氨基和磷酸膽堿 基團(tuán)的聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物，氨基與磷酸膽堿基團(tuán)的摩爾比為1:10 100:1。
3. —種根據(jù)權(quán)利要求1所述細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物的制備 方法，其特征在于包括如下步驟1) 1重量份末端含氨基的0 6代聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和0.01 100重量 份細(xì)胞膜仿生單體甲基丙烯酸磷酸膽堿酯或丙烯酸磷酸膽堿酯加入到10-10000 重量份水中，加熱到20 20(TC，反應(yīng)0.5 100小時(shí)，以透析袋透析1 100小 時(shí)，冷凍真空干燥10 100小時(shí)后得到細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺；2) 細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物用5毫摩爾/升pH 5.5醋酸一醋 酸鈉緩沖溶液溶解，配成0.1 10毫克/毫升的溶液，用孔徑0.22微米濾膜將 溶液過(guò)濾；3) 熒光蛋白基因用4.3毫摩爾/升硫酸鈉溶液溶解配制成50 250ug/ml 的溶液；4) 將細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和熒光蛋白基因溶液分別預(yù)熱 至55。C，然后按載體與熒光蛋白基因溶液體積比l: l在渦旋混合儀上混合l分 鐘，室溫靜置0.5 1小時(shí)，細(xì)胞膜仿生修飾聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物和熒光蛋白 基因通過(guò)靜電作用復(fù)合成納米復(fù)合物溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞膜仿生修飾的納米基因載體組合物及其制備方法。利用聚酰胺-胺樹(shù)枝狀聚合物外層的部分氨基與細(xì)胞膜仿生磷酸膽堿單體發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)聚酰胺-胺的表面仿生修飾，獲得細(xì)胞膜仿生修飾的聚酰胺-胺，控制細(xì)胞膜仿生磷酸膽堿單體的接枝率，獲得表面含有剩余氨基的仿生修飾的聚酰胺-胺，該仿生修飾的聚酰胺-胺表面含有正電荷，可以與基因進(jìn)行復(fù)合，仿生修飾聚酰胺-胺和基因所形成的納米基因載體組合物能實(shí)現(xiàn)基因的有效締合、保護(hù)、傳遞與釋放。本發(fā)明具有較高的基因締合能力、良好的貯藏穩(wěn)定性和較低的毒性以及較高的轉(zhuǎn)染效率，在基因治療中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K47/34GK101357231SQ20081012068
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日
發(fā)明者徐建平, 沈家驄, 劍 計(jì), 蘭 賈 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)