專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的提取方法，尤其是一種以蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(P"ec/to，ces/7e戸'a/Wchen&DaiCs-4)發(fā)酵廢液為原料提取抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的方法。(二)
背景技術(shù)：
：目前世界上已發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草屬真菌350多種，其中我國(guó)記錄有70余種。野生的冬蟲(chóng)夏草主要產(chǎn)于四川、西藏、云南、青海等海拔3000m以上的寒冷地帶，由于其生長(zhǎng)條件的限制及過(guò)度采挖，產(chǎn)量很低，所以?xún)r(jià)格昂貴。近年來(lái)，隨著人們逐漸發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)蟲(chóng)草的滋補(bǔ)療效和提高人體免疫功能，蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)利用備受世人的極大關(guān)注，對(duì)蟲(chóng)草的研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。蟲(chóng)草多糖是一類(lèi)高分子復(fù)合物，它作為蟲(chóng)草的主要活性成分之一，是蟲(chóng)草中含量最高的藥理活性物質(zhì)。從1977年開(kāi)始，日本和中國(guó)的科技工作者開(kāi)展了對(duì)蟲(chóng)草多糖的研究工作，目前已經(jīng)在天然冬蟲(chóng)夏草以及人工培育的蟲(chóng)草真菌中分別分離純化出多種多糖組分，并對(duì)其理化性質(zhì)和藥理活性進(jìn)行了研究。雖然已有的研究報(bào)道在所用蟲(chóng)草菌絲體原料上存在著差異，以及分離純化的多糖產(chǎn)品各不相同，但都從不同角度肯定了蟲(chóng)草多糖的免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤等功能。蟲(chóng)草多糖被認(rèn)為是當(dāng)前世界上非常好的免疫促進(jìn)劑之一。因此，蟲(chóng)草多糖作為保健食品和醫(yī)藥產(chǎn)品有著廣泛的開(kāi)發(fā)前景。深層發(fā)酵技術(shù)問(wèn)世以后，人工蟲(chóng)草菌絲的產(chǎn)量問(wèn)題得到了解決。在目前的工業(yè)化生產(chǎn)中，蟲(chóng)草發(fā)酵廢液作為副產(chǎn)物，普遍被舍棄，不僅污染了環(huán)境，也是一種資源浪費(fèi)，造成了蟲(chóng)草的主要生物活性物質(zhì)——蟲(chóng)草多糖的大量損失。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的^是取方法，尤其是一種以蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(戶(hù)ae"7o"少cas/z卬/a/Wchen&DaiCs-4)發(fā)酵廢液為原料提取抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的方法，充分利用現(xiàn)行生產(chǎn)工藝中直接排放的發(fā)酵廢液，提高利用率。本發(fā)明釆用的技術(shù)方案是一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的提取方法，所述方法包括(1)以含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的蝙蝠蛾擬青霉(尸aecz7o，ces/zep^/Wchen&DaiCs-4)發(fā)酵廢液為原料，離心耳又上清液；(2)將步驟(1)所得上清液調(diào)pH至4.5~5.0,加入2~5倍體積的50%100%(V/V)乙醇(濃度100%時(shí)即為無(wú)水乙醇)，沉淀20~60min,離心，耳又;冗，定物；(3)將步驟(2)所得沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得到含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粗多糖粉末。本發(fā)明中所述含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的溶液為蟲(chóng)草菌發(fā)酵廢液，為蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(尸ae"7o，c^/ze;/a/^chen&DaiCs-4)經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液去除菌絲體后的液體成分，可解決當(dāng)今蟲(chóng)草發(fā)酵液利用不充分和易造成環(huán)境污染等問(wèn)題，提高了發(fā)酵廢液的利用率，增加經(jīng)濟(jì)收益。所述粗多糖粉末可直接應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，也可按照常規(guī)方法進(jìn)一步純化后應(yīng)用于制備保健食品和藥物。本發(fā)明中，為提高蟲(chóng)草多糖品質(zhì)，所述含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粉末可進(jìn)一步經(jīng)復(fù)溶去除不溶物，酶解去除蛋白，脫色，透析去除小分子雜質(zhì)，最后以乙醇沉淀，得到所述抗氧化活性蟲(chóng)草多糖。具體的，所述方法按如下順序步驟進(jìn)行(l)將總糖含量為1315g/L的蟲(chóng)草菌發(fā)酵廢液濃縮至原體積的1/201/30得濃縮液1，4500r/min離心10min,取上清液；(2)步驟(1)上清液調(diào)pH至4.55.0，加入25倍體積的50%~100%(V/V)乙醇，沉淀2030min,4500r/min離心15min,耳又沉淀物；(3)步驟(2)沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，6(TC烘干，得到含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粗多糖粉末；(4)將步驟(3)粗多糖粉末以50~100倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，調(diào)pH7.0~7.5,4500r/min離心5min去除不溶物，取上清液；(5)取步驟(4)上清液，加入質(zhì)量為粗多糖粉末質(zhì)量50100倍的蒸餾水，調(diào)pH為7.08.0,按4~6xl05U/g粗多糖的添加量加入胰蛋白酶，37。C保溫酶解24h，4500r/min離心5min,取上清液，加入體積為上清液1/4的Sevag試劑(氯仿正丁醇=4:1,體積比)，15~25°C振蕩30min，4500r/min離心20min，取上層液體蒸餾去除有機(jī)溶劑，得含有多糖的溶液；(6)將步驟(5)所得含多糖溶液以濃氨水調(diào)pH7.08.0,攪拌下滴加30%的H202溶液至多糖溶液呈淡黃色后，裝入cut-of為14000Da的透析袋，蒸餾水中透析24h,去除小分子雜質(zhì)后，將透析袋內(nèi)溶液減壓濃縮至原體積的1/81/10得濃縮液2,加入體積為濃縮液2體積2~5倍的50%~100%(V/V)乙醇醇沉，離心取沉淀，烘干，得到所述抗氧化活性蟲(chóng)草多糖。將提取得到的蟲(chóng)草多糖進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取得到的蟲(chóng)草多糖具有很高的清除超氧陰離子自由基、羥基自由基(.OH)的活性。本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在提取獲得蟲(chóng)草多糖抗氧化活性高，具有良好應(yīng)用前景，且可充分利用發(fā)酵廢液資源，減少環(huán)境污染、增加經(jīng)濟(jì)收益。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例l:蟲(chóng)草菌發(fā)酵廢液的獲得發(fā)酵菌種為蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(Pae"7o，cM/^p/a/Wchen&DaiCs-4)。種子培養(yǎng)基按如下組成配制葡萄糖1.5g，蛋白胨2g，無(wú)機(jī)鹽0.5g，水100mL,pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制蔗糖2g，豆粕粉6g,蛋白胨2g,無(wú)機(jī)鹽0.5g,水100mL,pH7.2;500mL三角瓶中裝種子培養(yǎng)基150mL,滅菌后接入斜面菌種，在搖床轉(zhuǎn)速為120r/min、25。C培養(yǎng)3d，得種子液；將種子液以體積比5%接種量接入種子罐，逐級(jí)放大到20n^通用型攪拌發(fā)酵罐，25°C,培養(yǎng)5d。發(fā)酵結(jié)束后用板框壓濾機(jī)過(guò)濾，去除茵絲體，得到蟲(chóng)草發(fā)酵廢液(總糖含量約為14g/L)。實(shí)施例2:蟲(chóng)草多糖的提取取4要照實(shí)施例1方法制備的蟲(chóng)草發(fā)酵廢液1000mL,濃縮至42mL,濃縮液為深褐色粘稠液體，pH值1.5，密度1.304g/mL,固形物含量51.33%。稱(chēng)取20g濃縮液，用50mL蒸餾水稀釋后，4500r/min，離心10min，取上清液，調(diào)上清液pH值至4.88，加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀20min后，4500r/min離心15min,收集沉淀，將沉淀物依次用無(wú)水乙醇10mL、丙酮10mL、乙醚10mL洗滌，最后于60。C左右烘干，得到3.57g淺褐色粗多糖粉末，提取率為7.75%。隨后再進(jìn)一步去除雜質(zhì)。取2.0g粗多糖粉末重新用100mL蒸餾水溶解，調(diào)pH至7.2,離心(4500r/min,5min)去除不溶物。取上清液，加入100mL蒸餾水將粗多糖配成1%(w/w)左右的溶液，調(diào)pH至8左右，按粗多糖胰蛋白酶=50:1(質(zhì)量比)的比例加入胰蛋白酶(25000U/mg,市售)，37。C保溫24h，然后離心(4000r/min,5min),去除沉淀。上清液再以Sevag法繼續(xù)去除蛋白(Sevag法操作均在低溫下進(jìn)行)；按上清液Sevag試劑(氯仿正丁醇=4:1,體積比)體積比=4:1的比例力口入預(yù)冷的Sevag試劑，低溫(20°C)下于搖床振蕩30min，4500r/min離心20min,混合液分層，上層為多糖溶液，下層為Sevag試劑，中間為變性蛋白質(zhì)。取上層多糖溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上低壓蒸餾除去溶于其中的有機(jī)溶劑。多糖溶液以濃氨水調(diào)pH至7.0左右，不斷滴加30%(v/v)的H202溶液，并不斷攪拌至多糖溶液呈淡黃色為止。將多糖溶液裝入cut-of為14000Da的透析袋，蒸餾水中透析24h,去除小分子雜質(zhì)。將透析袋內(nèi)溶液減壓濃縮至原體積的1/10得濃縮液，再加入濃縮液4倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀20min后離心(4500r/min，15min)，收集沉淀，將沉淀物依次用無(wú)水乙醇10mL、丙酮10mL、乙醚10mL洗滌，最后于60。C左右烘干，得到淡黃色多糖粉末0.58g,多糖提取率6.7%。實(shí)施例3:1.以提取率為參考的醇沉工藝的確定根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇量、醇沉?xí)r間和pH值3個(gè)對(duì)多糖得率的影響較為顯著的因素，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法。試驗(yàn)分析方案如表1:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>經(jīng)過(guò)design-Expert軟件分析，列出22組優(yōu)化方案，綜合考慮，選擇乙醇體積為上清液體積的4倍，醇沉?xí)r間20min,pH值為4.88的優(yōu)化結(jié)果，理論提取率為7.80%,用此方案經(jīng)過(guò)三次重復(fù)試^r，分別得出提取率為7.8%、7.70%、7.79%。表明此優(yōu)化方案可行，與預(yù)期結(jié)果吻合。2.體外抗氧化活性測(cè)定就粗多糖體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明粗多糖具有很好的清除超氧陰離子自由基和羥基自由基(OH)活性，分別采用NBT光還原法、Fenton反應(yīng)法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的提取方法，所述方法包括(1)以含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的蝙蝠蛾擬青霉(Paecilonyceshepialidchen&DaiCs-4)發(fā)酵廢液為原料，離心取上清液；(2)將步驟(1)所得上清液調(diào)pH至4.5～5.0，加入2～5倍體積的50％～100％(說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明即可)乙醇，沉淀20～60min，離心，取沉淀物；(3)將步驟(2)所得沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得到含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粗多糖粉末。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述蝙蝠蛾擬青霉發(fā)酵廢液，為蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(戶(hù)ae"7w^cas/z甲/a/Wchen&DaiCs-4)經(jīng)發(fā)酵獲得的發(fā)酵液去除菌絲體后的液體成分。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粉末進(jìn)一步經(jīng)復(fù)溶去除不溶物、酶解去除蛋白、脫色、透析去除小分子雜質(zhì)，最后以乙醇沉淀，得到所述抗氧化活性蟲(chóng)草多糖。4.如^l利要求2所述的方法，其特4正在于所述方法如下(l)將總糖含量為1315g/L的蟲(chóng)草菌發(fā)酵廢液濃縮至原體積的1/20~1/30得濃縮液1，濃縮液1加入25倍體積的蒸餾水稀釋?zhuān)?500r/min離心10min,耳又上清液；(2)步驟(1)上清液調(diào)pH至4.5~5.0,加入2~5倍體積的50%100%乙醇，沉淀2030min,4500r/min離心15min,耳又沉淀物；(3)步驟(2)沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，60。C烘干，得到含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的粗多糖粉末；(4)將步驟(3)粗多糖粉末以50100倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，調(diào)pH7.0~7.5，4500r/min離心5min去除不溶物，耳又上清液；(5)取步驟(4)上清液，加入質(zhì)量為粗多糖粉末質(zhì)量50100倍的蒸餾水，調(diào)pH為7.08.0，按4~6xl05U/g粗多糖的添加量加入胰蛋白酶，37。C保溫酶解24h,4500r/min離心5min，取上清液，加入體積為上清液1/4的Sevag試劑，1525。C振蕩30min,4500r/min離心20min，取上層液體蒸餾去除有機(jī)溶劑，得多糖溶液；(6)將步驟(5)多糖溶液以濃氨水調(diào)pH7.08.0,攪拌下滴加30%的&02溶液至多糖溶液呈淡黃色后，裝入cut-of為14000Da的透析袋，蒸鎦水中透析24h，去除小分子雜質(zhì)后，將透析袋內(nèi)溶液減壓濃縮至原體積的1/81/10得濃縮液2,加入體積為濃縮液2體積25倍的50%100%乙醇，離心取沉淀，烘干，得到所述抗氧化活性蟲(chóng)草多糖。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的提取方法，尤其是一種以蟲(chóng)草菌蝙蝠蛾擬青霉(Paecilonyceshepialidchen&DaiCs-4)發(fā)酵廢液為原料提取抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的方法。所述方法包括以含有抗氧化活性蟲(chóng)草多糖的溶液為原料，離心取上清液；上清液調(diào)pH至4.5～5.0，加入2～5倍體積的50％～100％(V/V)乙醇，沉淀20～60min，離心，取沉淀物依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，烘干，得到含有蟲(chóng)草多糖的粗多糖粉末。文檔編號(hào)A61P37/00GK101353382SQ20081012087公開(kāi)日2009年1月28日申請(qǐng)日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日發(fā)明者何軍邀,吳力平,李國(guó)權(quán),普王,明鄭申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)