專利名稱：：一種制備微粉化蛋白的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及由含人血管內(nèi)皮抑制素的原料溶液制備固體形式的微粉化人血管內(nèi)皮抑制素的方法。特別涉及一種能得到高活性的微粉化人血管內(nèi)皮抑制素的方法。
背景技術：
：生物技術的革新和發(fā)展使重組蛋白和多肽藥物得以實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)和應用。蛋白與多肽在水溶液中不穩(wěn)定，易失活，阻礙了將此類藥物制備成藥用制劑。例如將蛋白溶液與有機溶劑接觸后，由于油水界面表面張力的存在，使蛋白構象改變而失活?，F(xiàn)有的在蛋白原液中直接添加凍干保護劑的冷凍干燥法也可得到干燥的固態(tài)蛋白，但得到的蛋白顆粒大，輔料占的比重大，多用于制成凍干粉針劑，用途不廣泛。在蛋白與多肽類藥物給藥系統(tǒng)的研究中，以藥物微粉化為前提的劑型日益增多，這些劑型的應用和發(fā)展，其前提和關鍵是藥物的微粉化。但現(xiàn)有的生產(chǎn)固態(tài)蛋白的技術無法生產(chǎn)出粒徑小于3um的微粉化蛋白，故不能滿足新劑型研發(fā)的需要。本發(fā)明獨特的優(yōu)點在于一、將蛋白制備成固態(tài)，提高了蛋白被制備成其他劑型的穩(wěn)定性；二、固態(tài)的蛋白，其粒子極小，是微粉化的固態(tài)蛋白，擴展了其制劑應用范圍，不僅可用于制備粉末注射劑，由于其粒徑極小(lum以下)，還可用于制備干粉吸入劑、粉末注射劑等等。現(xiàn)有微粉化蛋白的方法己經(jīng)有很多，總體歸納可分為以下幾種噴霧干燥法、冷凍干燥法、噴霧冷凍干燥法、超臨界流體技術。噴霧干燥是利用霧化器將藥物溶液分散為細小的霧滴，并在熱干燥介質中迅速蒸發(fā)溶劑形成干粉的過程，該技術制得的微粉粒徑均勻，但是該法需使用熱空氣，不適合用于干燥對溫度不敏感的蛋白和多肽藥物。噴霧冷凍干燥法將噴霧干燥中的霧化步驟與冷凍干燥相結合，步驟是將霧化的藥物水溶液噴入液氮中，以冷凍干燥的步驟將其干燥，得到粒徑均勻的藥物微粉。該方法批處理量大，但成本較高，得到的微粉粒徑較大。超臨界流體技術是新近發(fā)展的技術，可用于超臨界流體的性質來提取溶劑，干燥蛋白，但是，該技術仍存在許多需要研究和解決的問題如蛋白和多肽類藥物在有機溶劑中的溶解度普遍較小，如何通過改變?nèi)軇┙M成來增加藥物的溶解度，以及不同的操作條件與最終得到的不同性質微粉之間的關系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的微粉化蛋白方法中存在的問題，提供一種活性保持良好且微粉化效率極高的微粉化蛋白方法。本發(fā)明制備的微粉化蛋白可應用于多種用途干粉吸入劑、粉末注射劑以及微球微囊緩釋制劑等。本發(fā)明公開了一種制備微粉化蛋白的方法，它包括以下步驟-(1)在含有可溶性蛋白的緩沖鹽溶液中加入可溶性金屬鹽，然后調整該溶液的pH至蛋白的等電點(pl)，得到蛋白的細小顆粒沉淀，蛋白溶液變?yōu)榛鞈乙?2)將混懸液與凍干保護劑混合均勻后，凍干；(3)將凍干后的固體粉塊用溶劑洗漆，除去凍干保護劑，得到微粉化蛋白。本工藝利用的原理是"等電點+金屬鹽"兩種方法共同作用得到蛋白細小的沉淀顆粒，適用于絕大多數(shù)可溶性蛋白。上述可溶性蛋白可以是重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，重組人生長激素，干擾素a2-b(IFNa2-b)，重組人胰島素等。本發(fā)明中利用聚乙二醇這種聚合物作為冷凍干燥的保護劑，在凍千中起到空間賦形和穩(wěn)定的作用，沉淀下來的蛋白顆?？晌皆诰垡叶嫉墓羌苌?。上述聚乙二醇分子量范圍在1000至8000道爾頓。聚乙二醇有著良好的懸浮穩(wěn)定性，分子量范圍在1000至8000道爾頓均可很好的穩(wěn)定蛋白顆粒，保持其在凍干中不聚集，不下沉。上述微粉化蛋白的制備方法，步驟(2)中混懸液和凍干保護劑的體積比為1:9999:1，優(yōu)選15:85-90:10;混懸液中的蛋白濃度為0.01mg/ml~500mg/ml，凍干保護劑的濃度為1%~50%(w/v)。凍干保護劑的濃度不可小于1%，否則懸浮穩(wěn)定性很差，蛋白沉淀會很快下沉聚集；凍干保護劑的濃度過高也不適合，因為凍干后為了得到蛋白微粉，需使用有機溶劑洗滌除去該保護劑，若保護劑占的比例過高，需消耗大量有機溶劑，反復清洗，給操作帶來不便。保持1%~50%(w/v)的濃度較適宜。上述微粉化蛋白的制備方法，步驟(3)中的洗漆溶劑是可溶解聚乙二醇的溶劑，例如丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。優(yōu)選乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈。本發(fā)明屬于將蛋白沉淀技術與冷凍干燥技術結合的一項新的制備蛋白微粉的工藝。本發(fā)明的工藝溫和簡單，成本小，得到的微粉粒徑小于lum，且蛋白活性保持良好，是一項有廣泛醫(yī)藥應用前景的微粉化蛋白方法。本發(fā)明的優(yōu)點有-一本發(fā)明將蛋白沉淀顆粒與凍干保護劑冷凍千燥，蛋白的沉淀顆粒附著在保護劑的骨架上，保持了蛋白微粉的分散性，和蛋白多級結構的完整性。制備的微粉化蛋白可保留制備前85%以上的活性。二凍干后，蛋白呈固態(tài)，不含水，此時使用有機溶劑洗滌除去聚乙二醇時，不會使固態(tài)蛋白發(fā)生油水界面上的變性，干燥的蛋白微粉性質穩(wěn)定，便于下一步的制備或長期儲存。三蛋白經(jīng)過微粉化后，擴展了其制劑應用范圍，不僅可用于制備微球制劑，由于其粒徑極小(lum以下)，還可用于制備干粉吸入劑、粉末注射劑、植入泵制劑。圖1實施例一中蛋白微粉的SEM掃描電鏡照片左圖的標尺為5um，右圖的標尺為10ym，可見蛋白微粒的直徑小于lum。圖2實施例二中蛋白微粉的SEM掃描電鏡照片左圖的標尺為5um，右圖的標尺為lum，可見蛋白微粒的直徑小于lym。圖3實施例二中蛋白微粉對HUVEC細胞增殖活性具體實施例方式本發(fā)明通過以下實施例作更詳細的描述，但不能將其解釋為限制本發(fā)明的保護范圍。實施例一等電聚焦電泳法測定重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白的等電點，測定結果為PI=8.8~9.3，量取50ml重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白溶液(9.1462mg/ml，PH=5.5)，加入0.004%的醋酸鋅，至鋅鹽完全溶解后，用氫氧化鈉溶液(lmol/L)調蛋白溶液的PH至8.8-9.3這個區(qū)間內(nèi)。此時，大量蛋白沉淀，溶液呈現(xiàn)乳白色，加入50ml濃度為50n/。(w/v)的PEG-8000溶液，磁力攪拌5min使之混合均勻。將上述制備好的溶液分裝在規(guī)格30ml的西林瓶中，裝量規(guī)格為5ml/瓶，凍干。用二氯甲烷溶解凍干物，PEG-8000在二氯甲烷中溶解，離心后，在離心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化蛋白，常溫減壓干燥之，得到干燥的微粉化蛋白，粒徑0.01-lum之間。(圖1)實施例二等電聚焦電泳法測定重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白的等電點，測定結果為PI=8.8~9.3，量取50ml蛋白溶液(102.8mg/ml，PH=6.5)，加入0.001%的硫酸鎂，至鎂鹽完全溶解后，用氫氧化鈉溶液(lmol/L)調蛋白溶液的PH至8.8-9.3這個區(qū)間內(nèi)。此時，大量蛋白沉淀，溶液呈現(xiàn)乳白色，加入50ml濃度為200/。(w/v)的PEG-6000溶液，磁力攪拌5min使之混合均勻。將上述制備好的溶液分裝在規(guī)格30ml的西林瓶中，裝量規(guī)格為5ml/瓶，凍干。凍干時間為一天。用二氯甲烷溶解凍干物，PEG-6000在二氯甲垸中溶解，離心后，在離心管底部得到含有二氯甲垸的微粉化蛋白，常溫減壓干燥之，得到干燥的微粉化重組人血管內(nèi)皮抑制素蛋白。粒徑0-lum之間。(圖2)實施例三等電聚焦電泳法測定重組人生長激素的等電點，測定結果為P^5.305.80,量取50ml蛋白溶液(86.90mg/ml，PH=7.4)，加入0.04%的硫酸鈣，至鈣鹽完全溶解后，用醋酸溶液(lmol/L)調蛋白溶液的PH至5.30-5.80這個區(qū)間內(nèi)。此時，大量蛋白沉淀，溶液呈現(xiàn)乳白色，加入50ml濃度為30%(w/v)的PEG-4000溶液，磁力攪拌8min使之混合均勻。將上述制備好的溶液分裝在規(guī)格30ml的西林瓶中，裝量規(guī)格為5ml/瓶，凍干。凍干時間為一天。用二氯甲烷溶解凍干物，PEG-4000在二氯甲烷中溶解，離心后，在離心管底部得到含有二氯甲垸的微粉化重組人生長激素，常溫減壓干燥之，得到干燥的微粉化的重組人生長激素。實施例四等電聚焦電泳法測定干擾素(X2-b(IFNa2-b)的等電點，測定結果為PI=5.20~6.10，量取50ml蛋白溶液(117.2mg/ml，PH=7.4)，加入0.025%的醋酸鋅，至鋅鹽完全溶解后，用醋酸溶液(lmol/L)調蛋白溶液的PH至5.206.10這個區(qū)間內(nèi)。此時，大量蛋白沉淀，溶液呈現(xiàn)乳白色，加入50ml濃度為8%(w/v)的PEG-8000溶液，磁力攪拌5min使之混合均勻。將上述制備好的溶液分裝在規(guī)格30ml的西林瓶中，裝量規(guī)格為5ml/瓶，凍干。凍干時間為一天。用二氯甲烷溶解凍干物，PEG-8000在二氯甲垸中溶解，離心后，在離心管底部得到含有二氯甲烷的微粉化干擾素a2-b，常溫減壓干燥之，得到干燥的微粉化干擾素(X2陽b。實施例五等電聚焦電泳法測定重組人胰島素的等電點，測定結果為PI=5.30~5.50，量取50ml蛋白溶液(98.36mg/ml，PH=7.4)，加入0.04%的硫酸鈣，至鈣鹽完全溶解后，用醋酸溶液(lmol/L)調蛋白溶液的PH至5.305.50這個區(qū)間內(nèi)。此時，大量蛋白沉淀，溶液呈現(xiàn)乳白色，加入50ml濃度為40。/。(w/v)的PEG-6000溶液，磁力攪拌10min使之混合均勻。將上述制備好的溶液分裝在規(guī)格30ml的西林瓶中，裝量規(guī)格為5ml/瓶，凍干。凍干時間為一天。用二氯甲烷溶解凍干物，PEG-4000在二氯甲烷中溶解，離心后，在離心管底部得到含有二氯甲垸的微粉化重組人胰島素，常溫減壓干燥之，得到干燥的微粉化重組人胰島素，實施例六精密稱取實施例一中制備的微粉化蛋白，用緩沖液復溶，稀釋至1500ng/ml、1200ng/ml、1000ng/ml、800ng/ml、600ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml。用市售ELISA(酶聯(lián)免疫測定)試劑盒測定其免疫學活性。方法作一條未經(jīng)微粉化的蛋白標準曲線，再作一條微粉化蛋白復溶后的標準曲線，比較兩曲線在100ng/ml-1000ng/ml的吸光值(OD)差異，得免疫學活性保持率?；钚员３致视嬎惴椒榛钚员３致?100%-(未微粉化蛋白OD-微粉化后蛋白OD)/(未微粉化蛋白OD-空白值0.0392)*100%。表一顯示，微粉化后的蛋白活性保持率大于90%(表一)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例七精密稱取實施例二中制備的微粉化蛋白，用緩沖液復溶，進行HUVEC生物學活性測定。HUVEC細胞用添加5%FBS、1%ECGS、1%P/0Solution的ECM培養(yǎng)基于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞狀態(tài)良好并進入對數(shù)生長期后進行接種，選用第四代細胞接種。細胞用0.25%胰酶消化，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用培養(yǎng)基重新混懸，顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞。調細胞密度為5000個/ml,每孔加入160^1細胞懸液。加藥接種后即刻加入藥物每孔40nl，藥物終濃度200，100，50，25,12.5,6.25，0嗎/ml，每個濃度設置3個復孔，37'C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時。加入MTT試劑，每孔20pl，置37。C5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，加入三聯(lián)試劑置37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使用酶標儀570nm波長下測定OD值。通過下列公式求得抑制率樣品的抑制率％=(陰性對照OD值-藥物OD值)/(陰性對照OD值一無細胞對照孔OD值)xl00%。(圖3)權利要求1、一種制備微粉化蛋白的方法，它包括(1)在含有可溶性蛋白的緩沖鹽溶液中加入可溶性金屬鹽，然后調整該溶液的pH至蛋白的等電點(pI)，得到蛋白的細小顆粒沉淀，蛋白溶液變?yōu)榛鞈乙海?2)將混懸液與凍干保護劑混合均勻后，凍干；(3)將凍干后的固體粉塊用溶劑洗滌，除去凍干保護劑，得到微粉化蛋白。2、根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述可溶性蛋白為重組人血管內(nèi)皮抑制素Endostar，重組人生長激素，干擾素a2-b，重組人胰島素；緩沖鹽溶液為醋酸鈉溶液。3、根據(jù)權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述可溶性蛋白的緩沖鹽溶液中蛋白濃度為0.01mg/ml~500mg/ml;緩沖鹽濃度濃度為0.0001%(w/v)~30%(w/v)。4、根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述可溶性金屬鹽選自銅鹽、鋅鹽、鎘鹽、鈣鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、銀鹽、鋁鹽。5、根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述可溶性金屬鹽選自鋅鹽、鎂鹽和f!鹽。6、根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述可溶性金屬鹽的加入量為0.001%(w/v)~10%(w/v;>。7、根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于所述可溶性金屬鹽的加入量為0.001%(w/v)~3%(w/v)。8、根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于所使用的凍干保護劑為分子量范圍在1000至9000道爾頓的聚乙二醇或分子量范圍在2000至20000道爾頓的聚乙烯吡咯垸酮。9、根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于混懸液和凍干保護劑的體積比為15:85-90:10。10、根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述洗滌用有機溶劑為丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈中的一種或幾種。全文摘要本發(fā)明涉及一種制備微粉化蛋白的方法。該方法包括以下步驟(1)在含有可溶性蛋白的緩沖鹽溶液中加入可溶性金屬鹽，然后調整該溶液的pH至蛋白的等電點(pI)，得到蛋白的細小顆粒沉淀，蛋白溶液變?yōu)榛鞈乙海?2)將混懸液與凍干保護劑混合均勻后，凍干；(3)將凍干后的固體粉塊用溶劑洗滌，除去凍干保護劑，得到微粉化蛋白。文檔編號A61K9/19GK101618023SQ20081012276公開日2010年1月6日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權日2008年6月30日發(fā)明者蘇華,李海瑞,王青松,許向陽,陳英杰申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司