專利名稱：蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白多肽類藥物緩釋制劑的制備方法。
背景技術：
蛋白多肽類高值生化藥物與其他化學合成藥物相比，具有毒副作用小、用 量少、療效好等優(yōu)勢，受到廣大醫(yī)生和患者的普遍歡迎。隨著基因工程技術的 發(fā)展，胰島素、干擾素等很多多肽藥物已能夠通過基因重組技術得到有效的開 發(fā)，具有廣闊的發(fā)展前景。由于蛋白多肽類藥物分子大且常以多聚體形式存在， 因此大多數(shù)蛋白多肽類藥物不能經胃腸道吸收，并且極易引起機體的免疫反 應，而且蛋白多肽類藥物存在穩(wěn)定性差、生物利用度低、體內生物半衰期短、 極易被生物體內的酶分解、易于從血液循環(huán)中清除等缺點，使它們在治疔學領 域的應用受到很大限制。

發(fā)明內容
本發(fā)明是為了解決蛋白多肽類藥物在體內穩(wěn)定性差、極易變性失活等缺 陷，而提供了蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法。
本發(fā)明中蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是按下述步驟進行的
一、 按0.01 100mg蛋白質多肽類藥物與lmL鹽酸溶液的比例將蛋白質多 肽類藥物溶于濃度為0.001 10Ommol/L的鹽酸溶液中，并調節(jié)pH值為1 7之 間，再加入無機鹽，使無機鹽濃度為0.01 1Omol/L，并以10 600r/min的速度 磁力攪拌0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理0.01 100min，再離 心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；
二、 將聚陰離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機鹽溶液中，其中聚陰離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1 7,再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質量比為l: 0.01 100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以 10~600 r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，再用功率5 200W的 超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰離子)，固 相物再用濃度O.01~10mol/L 、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌
0.1 100 min;
三、 將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為 0.01 100mg/mL、 pH值為1 7的多價金屬陽離子鹽溶液中，其中多價金屬陽 離子與蛋白多肽類藥物微粒的質量比為1: 0.01 100，然后以10 600 r/min的 速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理 0.01 100 min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的多價金屬陽離子)，用 0.01 1Omol/L 、 pH值為1~6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1 100 min;
四、 重復步驟三的操作一次；
五、 將聚陽離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機鹽溶液中，其中聚陽離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質量比為1: 0.01 100的比例加入經步驟四處理的蛋白多肽類藥 物微粒，然后以10 600r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，然后 用功率10 200W的超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸 附的聚陽離子)，用濃度O.01~10mol/L、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次， 每次洗滌0.1 100min;即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟 五反應溫度控制5~10°C，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物 占30%~60%。
本發(fā)明步驟一中的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、降 鈣素、生長激素、環(huán)孢菌(環(huán)肽)、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子W1、神 經垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生成 素、促皮質素、胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人丙 種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細胞生成素或白細胞介素-2。
本發(fā)明的步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖 (DS)、硫化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸(Nafion)、羧甲 基纖維素鈉、聚陰離子纖維素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、硫 酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、透明質酸、聚甲基丙烯 酸中的一種或幾種的混合物；聚陰離子為混合物時，各種聚陰離子間可按任意 比混合。
本發(fā)明步驟二中的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟三中所述的多價金屬陽離子為Zn2+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、雨3+、 Pm3+、 Sm3+、 En3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 Li^+中的一種或幾種的混合物; 多價金屬陽離子為混合物時，各種多價金屬陽離子間可按任意比混合。
本發(fā)明的步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖(CS)、聚陽離子為魚精蛋白 (PRO)、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、質子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺鹽酸 鹽、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)、聚二烯丙基 二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯 基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取代二 苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混合物；聚陽離子為混合物時，各種聚陽離子 間可按任意比混合。
本發(fā)明歩驟五中的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明的步驟一、二、三和五中洗滌用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶 液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本發(fā)明蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法還能在進行步驟四操作之 前依次重復步驟二和三的操作一至三十九次。
本發(fā)明蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法還能在步驟五中完成用無 機鹽溶液洗滌之后，依次重復步驟二和三的操作內容一至三十九次，即得 到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。
本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點
1)本發(fā)明通過靜電吸引層層自組裝技術，使多價金屬陽離子(如三價鐵 離子、二價鋅離子等)與多聚陰離子(如硫酸葡聚糖、葡聚糖、肝素、海藻酸 鈉等) 一層緊貼一層結合在一起，將蛋白多肽類藥物包裹在里面形成微膠囊。 另外，多價金屬陽離子與聚陰離子的結合不僅依靠靜電吸引，而且還通過多價 金屬陽離子與聚陰離子的配位絡合作用，從而得到相對穩(wěn)定的載藥微膠囊。
2) 在微膠囊的外層，用具有生物相容性和特殊功能的多聚陽離子進行修 飾。從而使制備的微膠囊最外層帶有穩(wěn)定的正電荷，能夠與黏膜內壁上的負電 荷相互作用，阻礙微膠囊的流動，最終起到延緩藥效的作用。
3) 在微膠囊中引入了在人體中具有特殊生物學作用的金屬元素(如人體 不可缺少的鐵和鋅等)，在一定程度上能夠補充人體對這些物質的需要。
4) 本發(fā)明通過改變組成微膠囊囊壁的材料和包裹層數(shù)控制囊壁的厚度， 進一步調節(jié)微膠囊的藥物釋放速度。
5) 本發(fā)明的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊具有較高的包封率和載藥量。包 封率達50%以上，蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物占30%~60%。
6) 本發(fā)明工藝簡單，反應條件溫和，易操作，重現(xiàn)性好，環(huán)境友好，為蛋 白多肽類藥物緩控釋制劑的研制提供了物質基礎與技術保障，具有良好的應用 刖景。
本發(fā)明微膠囊在中性介質中能夠逐漸釋放出蛋白多肽藥物，從而長時間保 持藥效緩慢發(fā)揮作用。此外，把多肽藥物微膠囊分散于水性或非水性液體溶液 中可構成多種類型的微納米蛋白多肽類藥物注射液或口服液，把微米級或亞微 米級多肽藥物微膠囊與腸溶包衣混合，可構成多肽藥物口服膠囊、片劑、噴劑 等，可通過肺吸入、注射、口服、經皮吸入等多種方式給藥。


圖1是具體實施方式
二十三中外層包裹了(Fe"DS)4的聚苯乙烯實心微膠 囊的激光共聚焦圖片。圖2是具體實施方式
二十三中(Fe"DS)4空心微膠囊的 激光共聚焦圖片。圖3是具體實施方式
二十三中(Fe^DS)2空心微膠囊的原子 力圖片。圖4是具體實施方式
二十三中(F^VDS)3空心微膠囊的原子力圖片。 圖5是具體實施方式
二十三中(F^+ZDS)4空心微膠囊的原子力圖片。圖6是具 體實施方式二十三中(F^+ZDS)5空心微膠囊的原子力圖片。圖7是具體實施方 式二十三中多層膜(Fe"DS)n (n = 2,3,4，5)的壁厚隨雙層數(shù)目的變化關系圖。 圖8是包裹層數(shù)對三價鐵離子為最外層的胰島素釋放速率的影響效果圖，圖中 4-表示胰島素微粒的體外釋放胰島素的曲線，-o-表示包裹了(DS/Fe,4胰島素 微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-T -表示包裹了 (DS/Fe3+)7胰島素微膠囊的體 外釋放胰島素的曲線，-令-表示包裹了(DS/Fe、。胰島素微膠囊的體外釋放胰
島素的曲線。圖9為包裹層數(shù)對魚精蛋白為最外層的胰島素釋放速率的影響效 果圖；圖中-*-表示胰島素微粒的體外釋放胰島素的曲線，-o-表示包裹了 (DS/Fe3+)3/DS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-T-表示包裹了 (DS/Fe3+)7/DS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線，-A-表示包裹了 (DS/F^+VDS/PRO胰島素微膠囊的體外釋放胰島素的曲線。圖IO為在胰島素 微粒上組裝上帶電物質的zeta電位隨組裝層數(shù)增加的變化關系圖。圖11是最 外層為魚精蛋白的胰島素微膠囊的共聚焦圖片。圖12是最外層為三價鐵離子 的胰島素微膠囊的共聚焦圖片。圖13是以不同材料為最外層包裹的胰島素微 膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果圖；圖中-*-表示胰島素溶液對糖尿病大鼠 的血糖影響效果曲線，-0-表示包裹了(08/ 63+)3/08/ 110胰島素微膠囊對糖尿 病大鼠的血糖影響效果曲線，-1表示包裹了(08/ ^+)4/08胰島素微膠囊對糖 尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-^-表示包裹了(08/ 63+)3/08/ 110/08胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-■-表示包裹了(DS/Fe3、胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線。圖14是不同包裹層數(shù)的胰島素微 膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果圖；圖中-*-表示胰島素溶液對糖尿病大鼠 的血糖影響效果曲線，-^-表示包裹了(08^^+)2/08/ 110胰島素微膠囊對糖尿 病大鼠的血糖影響效果曲線，-T-表示包裹了 DS/F^+)3/DS/PRO胰島素微膠囊 對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-0-表示包裹了(08^^+)7/08"!10胰島素 微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線，-國-表示包裹T(DS/Fe3+)9/DS/PRO 胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影響效果曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方 式間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式中蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是
按下述步驟進行的 一、按0.01 100mg蛋白質多肽類藥物與lmL鹽酸溶液的 比例將蛋白質多肽類藥物溶于濃度為0.001~100mmol/L的鹽酸溶液中，并調節(jié) pH值為1~7之間，再加入無機鹽，使無機鹽濃度為0.01~10mol/L，并以 10~600r/min的速度磁力攪拌0.1 100min，然后用功率5 200W的超聲波處理 0.01 100min，再離心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；
二、 將聚陰離子溶于濃度為0.01~10mol/L的無機鹽溶液中，其中聚陰離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質量比為l: 0.01 100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以 10-600 r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，再用功率5 200W的 超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰離子)，固 相物再用濃度O.01~10mol/L 、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌 O.卜勵min;
三、 將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為 0.01~100mg/mL、 pH值為1~7的多價金屬陽離子鹽溶液中，其中多價金屬陽 離子與蛋白多肽類藥物微粒的質量比為h 0.01~100，然后以10 600 r/min的 速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，然后用功率5~200W的超聲波處理 0.01~100 min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的多價金屬陽離子)，用 O.01~10mol/L 、 pH值為1~6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1 100 min;
四、 重復步驟三的操作一次；
五、 將聚陽離子溶于濃度為0.01 1Omol/L的無機鹽溶液中，其中聚陽離 子濃度為0.01~100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1 7，再按蛋白多肽類藥物微粒 與聚陰離子的質量比為1: 0.01 100的比例加入經步驟四處理的蛋白多肽類藥 物微粒，然后以10 600r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1 100min，然后 用功率10 200W的超聲波處理0.01 100min，離心或過濾(目的是去除未被吸 附的聚陽離子)，用濃度0.O卜10mol/L、 pH值為1 6的鹽溶液洗滌一至十次， 每次洗滌0.1 100min;即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟 五反應溫度控制5 10°C，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物 占30%~60o/o。
本實施方式蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的大小均勻，粒徑大小平均為
本實施方式的步驟一中所述的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯 化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實施方式的步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、 降鈣素、生長激素、環(huán)孢菌(環(huán)肽)、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子WI、
神經垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生 成素、促皮質素、胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人 丙種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細胞生成素或白細胞介素-2。 本實施方式的步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖
(DS)、硫化葡聚糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸(Nafion)、羧甲 基纖維素鈉、聚陰離子纖維素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、硫 酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚丙烯酸、聚丙烯酸鈉、透明質酸、聚甲基丙烯 酸中的一種或幾種的混合物；聚陰離子為混合物時，各種聚陰離子間可按任意 比混合。
本實施方式步驟二的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、 硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實施方式的步驟三中所述的多價金屬陽離子為Zr^+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、 Nd3+、 Pm3+、 Sm3+、 Eu3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 1^3+中的一種或幾種的混 合物；多價金屬陽離子為混合物時，各種多價金屬陽離子間可按任意比混合。
本實施方式的步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖(CS)、聚陽離子為魚精 蛋白(PRO)、聚精氨酸、聚乙烯亞胺、質子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺 鹽酸鹽、季胺烷基醚化陽離子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)、聚二烯 丙基二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯 酸酯基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取
代二苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混合物；聚陽離子為混合物時，各種聚陽
離子間可按任意比混合。
本實施方式步驟五中的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶 液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實施方式的步驟一、二、三和五中洗滌用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸 鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
本實施方式中通過調節(jié)磁力攪拌器的轉速、超聲功率或超聲時間來控制蛋 白多肽類藥物微粒及蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的粒子大小，磁力攪拌器的轉 速、超聲功率或超聲時間增大均能使所得粒子的粒徑變小。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點為在進行步驟 四操作之前依次重復步驟二和三的操作一至三十九次。其它步驟及參數(shù)與具體 實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點為在進行步驟 四操作之前依次重復步驟二和三的操作二至十次。其它步驟及參數(shù)與具體實 施方式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點為步 驟五中完成用無機鹽溶液洗滌之后，依次重復步驟二和三的操作內容一至 三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步驟及參數(shù)與具體實 施方式一、二或三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一、二或三的不同點為步 驟五中完成用無機鹽溶液洗滌之后，依次重復步驟二和三的操作內容二至 十次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步驟及參數(shù)與具體實施方 式一、二或三相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中磁力
攪拌速度為200 400r/min，磁力攪拌時間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具體 實施方式一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中磁力 攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方 式一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中超聲 波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一 相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中超聲
波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中磁力
攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具體 實施方式一相同。
具體實施方式
十一本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中磁
力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式一相同。
具體實施方式
十二本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中超 聲波的功率為20 100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中超 聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中磁 力攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具 體實施方式一相同。
具體實施方式
十五本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中磁 力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式一相同。
具體實施方式
十六本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中超 聲波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十七本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟三中超 聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
十八本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中磁
力攪拌速度為200~400r/min，磁力攪拌時間為5 30min。其它步驟及參數(shù)與具 體實施方式一相同。
具體實施方式
十九本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中磁 力攪拌速度為300r/min，磁力攪拌時間為15min。其它步驟及參數(shù)與具體實施 方式一相同。
具體實施方式
二十本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中超
聲波的功率為20~100W，超聲處理1 50min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
二十一本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟五中
超聲波的功率為50W，超聲處理5min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
二十二本實施方式中胰島素緩釋微膠囊的制備方法是按下
述步驟進行的 一、將胰島素溶于濃度為O.OOlmol/L的鹽酸溶液中，胰島素 的濃度為20mg/mL，并調節(jié)pH值為3.0，再加入無機鹽，使無機鹽的濃度為 0.5mol/L溶液，以300r/min的速度磁力攪拌60min，然后用功率50W的超聲 波處理5min，再離心分離或過濾后取固體，即得到胰島素微粒；
二、 將0.01 100mg胰島素微粒置于1 2mL濃度為10mg/mL、pH值為1 7 硫酸葡聚糖(DS)的NaCl溶液中，硫酸葡聚糖的NaCl溶液中NaCl溶液的 濃度為0.01~10mol/L，然后以100r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應15min， 再用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陰 離子)，再用濃度0.5mol/L 、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次，每次洗滌1 min;
三、 將經步驟二處理后的胰島素微粒置于l 2mL濃度為5mg/mL、 pH值 為3.0的三價鐵離子溶液中，然后以100 r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應 15min，然后用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被 吸附的多價金屬陽離子)，用0.5mol/L 、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次， 每次洗滌1 min;
四、 重復步驟三的操作一次；
五、 將經步驟四處理的胰島素微粒置于l 2mL濃度為5mg/mL、 pH值為 3.0魚精蛋白(PRO)的NaCl溶液中，聚陽離子的無機鹽溶液中NaCl溶液的 濃度為0.5mol/L，然后以300 r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應15min，然 后用功率50W的超聲波處理5min，離心或過濾(目的是去除未被吸附的聚陽 離子)，用濃度0.5mol/L、 pH值為3.0的NaCl溶液洗滌三次，每次洗滌1 min; 即得到胰島素緩釋微膠囊。
具體實施方式
二十三本實施方式與具體實施方式
二十二的不同點為在 進行步驟四操作之前依次重復步驟二和三的操作一至九次。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
二十二相同。
本實施方式方式得到的胰島素緩釋微膠囊胰島素外層結構表達式
(DS/Fe3+)n/DS/PRO，其中n表示個數(shù)，為2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9。
為了證明三價鐵離子與硫酸葡聚糖形成的復合物能夠作為胰島素的載體
材料，采用聚苯乙烯小球為模板，制備了PS(Fe"DS)4微膠囊，然后用四氫呋 喃溶去其中的PS小球，得到(DS /Fe3+) 4的空心微膠囊。從圖1和2中可以看 出，空心微膠囊(DS/F^+)4在水中依然能夠保持原來的球形，而在干燥狀態(tài) 下由于內外壓力差變?yōu)楦砂T多褶皺形態(tài)(圖3、 4、 5和6所示)。在干燥狀態(tài) 下，利用原子力顯微鏡測定空心微膠囊的壁厚，隨著(DS/F^+)層數(shù)的增加， 其厚度呈線性關系增長(圖7所示)，這表明可以通過改變包裹層數(shù)來改變外 殼厚度，從而改變胰島素的釋放速度。隨著包裹層數(shù)增加，藥物釋放速度減慢， 最外層為Fe"(圖8)禾nPRO (圖9)的胰島素微膠囊均表現(xiàn)出較好的釋放效 果。
在包裹胰島素微膠囊的過程中，每包裹完一層，取出少量測定Zeta電位， 通過最外層Zeta電位的正負交叉變化證明每一層的成功包裹。從圖10可以看 出Zeta電位正負交叉變化，從而證明帶有正負電荷的兩種物質均成功包裹在 胰島素微聚體的表面。另夕卜，從圖中還可以看出F浐的Zeta電位的絕對值明 顯低于DS或PRO的Zeta電位的絕對值。此外，從圖11和12還可以看出， 超聲處理后，最外層為魚精蛋白的胰島素微膠囊比最外層為鐵離子的胰島素微 膠囊的分散性更好。這可能是由于所帶電荷的穩(wěn)定性影響了其穩(wěn)定性的緣故， 因為三價鐵離子所帶的電荷不穩(wěn)定，而魚精蛋白由于含有大于70%的精氨酸而 帶有足夠多的正電荷，使得微粒分散性更好。另外，鐵與多糖容易形成納米顆 粒狀復合物的表面不規(guī)整，不利于其保存，影響其在體外保存時的穩(wěn)定性。因 此采用多聚陽離子修飾微膠囊的表面。
圖13和14為鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型大鼠皮下注射給藥后血糖隨時. 間的變化情況。結果表明，糖尿病大鼠皮下注射后，胰島素微膠囊混懸液具有 較好的降血糖效果。其中，圖13為以不同材料為最外層包裹的胰島素微膠囊 對糖尿病大鼠的血糖影響，從圖中可以看出，與最外層為DS、 F^+的胰島素 微膠囊相比，皮下注射最外層為PRO (—o—)的胰島素微膠囊能夠使糖尿病 大鼠的降血糖效果持續(xù)在40%以下6個小時，而且非常穩(wěn)定。這是因為，人體 內的黏膜和細胞外壁上具有很多陰離子，這樣可以同最外層為PRO的胰島素 微膠囊的外層聚陽離子PRO通過靜電作用相互吸引，從而減慢了胰島素微膠
囊的流動，使得胰島素微膠囊的藥效能夠穩(wěn)定發(fā)揮較長時間。圖14為以魚精 蛋白為最外層，皮下注射不同層數(shù)包裹的胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的血糖影 響。從圖14中可以看出，隨著層數(shù)的增加，胰島素微膠囊對糖尿病大鼠的降 血糖效果更加明顯。這與釋放實驗的結論是一致的，隨著包裹層數(shù)增加，藥物
釋放速度減慢，從而使藥效的發(fā)揮時間越長。其中，皮下注射包裹io個雙層
(DS/F^+)9/DS/PRO的胰島素微膠囊使降血糖效果達到了 IO個小時，降血糖效 果非常顯著。
胰島素是一種具有生物活性的多肽類藥物，容易被胃蛋白酶分解而失去藥 效，所以臨床上多以注射針劑給藥。但是由于這類藥物半衰期短，必須長期頻 繁注射，不但費用高、麻煩大，而且注射部位會引起硬結和皮下脂肪萎縮，給 患者造成極大的痛苦和精神壓力。通過本實施方法可實現(xiàn)此類藥物口服化，從 而減輕患者的痛苦。由于口服藥具有方便、安全以及費用低的有點，因而具有 廣闊的應用前景。
具體實施方式
二十四本實施方式與具體實施方式
二十二的不同點為在 進行步驟四操作之前依次重復步驟二和三的操作十至三十九次。其它步驟及參 數(shù)與具體實施方式
二十二相同。
具體實施方式
二十五本實施方式與具體實施方式
二十二、 二十三或二十 四的不同點為步驟五中完成用無機鹽溶液洗滌之后，依次重復步驟二和 三的操作內容一至三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。其它步 驟及參數(shù)與具體實施方式
二十二、 二十三或二十四相同。
權利要求
1、蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特征在于蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法是按下述步驟進行的一、按0.01～100mg蛋白質多肽類藥物與1mL鹽酸溶液的比例將蛋白質多肽類藥物溶于濃度為0.001～100mmol/L的鹽酸溶液中，并調節(jié)pH值為1～7之間，再加入無機鹽，使無機鹽濃度為0.01～10mol/L，并以10～600r/min的速度磁力攪拌0.1～100min，然后用功率5～200W的超聲波處理0.01～100min，再離心分離或過濾后取固體，即得到蛋白多肽類藥物微粒；二、將聚陰離子溶于濃度為0.01～10mol/L的無機鹽溶液中，其中聚陰離子濃度為0.01～100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1～7，再按蛋白多肽類藥物微粒與聚陰離子的質量比為1:0.01～100的比例加入蛋白多肽類藥物微粒，然后以10～600r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1～100min，再用功率5～200W的超聲波處理0.01～100min，離心或過濾，固相物再用濃度0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min；三、將上一步驟處理后的蛋白多肽類藥物微粒置于濃度為0.01～100mg/mL、pH值為1～7的多價金屬陽離子鹽溶液中，其中多價金屬陽離子與蛋白多肽類藥物微粒的質量比為1:0.01～100，然后以10～600r/rain的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1～100min，然后用功率5～200W的超聲波處理0.01～100 min，離心或過濾，用0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min；四、重復步驟三的操作一次；五、將聚陽離子溶于濃度為0.01～l0mol/L的無機鹽溶液中，其中聚陽離子濃度為0.01～100mg/mL，然后調節(jié)pH值為1～7，再按蛋白多肽類藥物微粒與聚陰離子的質量比為1:1:0.0l～100的比例加入經步驟四處理的蛋白多肽類藥物微粒，然后以10～600 r/min的速度磁力攪拌進行吸附反應0.1～100min，然后用功率10～200W的超聲波處理0.01～100min，離心或過濾，用濃度0.01～10mol/L、pH值為1～6的鹽溶液洗滌一至十次，每次洗滌0.1～100min即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊；其中步驟一至步驟五反應溫度控制5～10℃，所得蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊中蛋白多肽類藥物占30％～60％。
2、 根據(jù)權利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于在進行步驟四操作之前依次重復步驟二和三的操作一至三十九次。
3、 根據(jù)權利要求1或2所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法， 其特征在于步驟五中完成用鹽溶液洗滌之后，依次重復步驟二和三的操作 內容一至三十九次，即得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。
4、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟一中所述的蛋白多肽類藥物為胰島素、干擾素、水蛭素、降鈣素、生長激素、環(huán)孢菌、促紅素等葡萄糖氧化酶、凝血因子Vffl、神經垂體素、縮宮素、增血壓素、促黑色素細胞素、胸腺素、胸腺肽、胸腺生成素、促皮質素、 胰蛋白酶抑制劑、絨毛膜促性激素、尿激酶、魚精蛋白、人丙種球蛋白、白蛋白、胃膜素、表皮生長因子、紅細胞生成素或白細胞介素-2。
5、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二中所述的聚陰離子為海藻素鈉、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫化葡聚 糖、肝素、硫酸肝素、聚谷氨酸、全氟磺酸、羧甲基纖維素鈉、聚陰離子纖維 素、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯磺酸鈉、硫酸軟骨素、肝磷脂、尿激酶、聚內烯 酸、聚丙烯酸鈉、透明質酸、聚甲基丙烯酸中的一種或幾種的混合物。
6、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟一中的無機鹽為氯化鈉、氯化銨、硫酸銨、氯化鉀、磷酸鈉、磷酸 鉀。
7、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟三中所述的多價金屬陽離子為Zn2+、 Cu2+、 Fe3+、 Ru3+、 Os3+、 Rh3+、 Sc3+、 Al3+、 Cr3+、 Y3+、 La3+、 Ce3+、 Pr3+、 Nd3+、 Pm3+、 Sm3+、 Eu3+、 Ga3+、 Tb3+、 Dy3+、 Ho3+、 Er3+、 Tm3+、 Yb3+、 1^3+中的一種或幾種的混合物。
8、 根據(jù)權利要求l所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟五中所述的聚陽離子為殼聚糖、聚陽離子為魚精蛋白、聚精氨酸、 聚乙烯亞胺、質子化的聚乙烯亞胺、聚乙烯基亞胺鹽酸鹽、季胺烷基醚化陽離 子聚乙烯醇、聚烯丙基銨鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲季銨鹽、膠原、多聚賴氨酸、 陽離子葡聚糖、聚2-羥基-3-甲基丙烯酸酯基三甲基氯化銨、聚丙烯基氨、多 熔素、明膠、二苯胺-4-重氮樹脂、取代二苯胺重氮樹脂中的一種或幾種的混 合物。
9、 根據(jù)權利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二中的無機鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸 銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀；步驟五中的無機鹽溶液為氯化鈉 溶液、硫酸鈉溶液、氯化銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷 酸鉀。
10、 根據(jù)權利要求1所述的蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，其特 征在于步驟二、三、五中洗滌所用的鹽溶液為氯化鈉溶液、硫酸鈉溶液、氯化 銨溶液、硫酸銨溶液、氯化鉀溶液、磷酸鈉溶液或磷酸鉀溶液。
全文摘要
蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊的制備方法，它涉及蛋白多肽類藥物緩釋制劑的制備方法。本發(fā)明解決了蛋白多肽類藥物在體內穩(wěn)定性差、極易變性失活等缺陷。本發(fā)明方法步驟如下一、鹽析法制蛋白多肽類藥物微粒；二、吸附聚陰離子；三、吸附多價金屬陽離子；四、吸附聚陰離子；五、吸附聚陽離子，得到蛋白多肽類藥物緩釋微膠囊。本發(fā)明產品中多價金屬陽離子與聚陰離子通過靜電引力及配位絡合作用相互結合，大大提高了產品在體內穩(wěn)定性；通過體外釋放實驗驗證本發(fā)明產品釋放緩慢，通過藥理活性實驗驗證本發(fā)明產品具有生物活性，并且能夠在體內緩慢發(fā)揮藥效，持續(xù)12小時～24小時以上，同時為人體補充所需的微量元素。
文檔編號A61K47/38GK101361963SQ20081013712
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月16日 優(yōu)先權日2008年9月16日
發(fā)明者劉紹琴, 岳秀麗, 戴志飛, 洋 王, 健 鄭, 閻秀峰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學