芬維a胺及其活性衍生物的新用途及其藥物組合物的制作方法

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專利名稱：芬維a胺及其活性衍生物的新用途及其藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及芬維A胺的新用途，具體涉及芬維A胺或其活性衍生物在制備用于清除或殺滅受試者腫瘤干細胞、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞或用于治療和/或預防起源于腫瘤干細胞、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的腫瘤疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗腫瘤藥聯(lián)合應用的新用途、包含所述芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗腫瘤藥的藥物組合物、篩選所述其它抗腫瘤藥方法、^使用所述芬維 A胺或其活性^"生物清除或殺滅受試者腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的方法、以及使用所述芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合其它抗腫瘤藥清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和起源于腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的腫瘤細胞的方法。
背景技術：
近幾十年來，人們對干細胞生理特性的認識極大地推進了人類對個體發(fā)育及內環(huán)境平衡的研究，尤其促進對腫瘤起源與相關治療方面的研究(例如參見Bonnet and Dick， 1997)。已經在哺乳動物的多種組織系統(tǒng)中證實了干細胞的存在，如皮膚、小腸、中樞神經系統(tǒng)和造血系統(tǒng)(例如參見Blanpain 等，2004)。干細胞^L定義為一種具有自我更新能力、可分化為不同系別細胞的能力和長期增殖能力的細胞。由于腫瘤起源細胞與正常干細胞生理特征的相似性，人們將腫瘤起源細胞稱為腫瘤干細胞，這一觀點先后在造血系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)和乳腺系統(tǒng)的胂瘤中得到了逐一的證實(例如參見 Bonnet and Dick, 1997、 Cobaleda等，2000、 Jordan等，2006)。
肺瘤干細胞同正常千細胞與傳統(tǒng)意義上的腫瘤細胞有所區(qū)別。同正常干細胞群體相比，肺瘤干細胞群體具有自身獨特的生理特性，如白血病干
4細胞表現(xiàn)了異常激活的NF—kB活性，高度地表達細胞表面分子抗原 CD123、干擾素調節(jié)因子l(IRF-l)與DAP激酶等。有別于傳統(tǒng)意義上的胂瘤細胞群體，腫瘤干細胞為其母體，具有無限自我更新能力與分化潛能。
在腫瘤相關研究和治療中，越來越多的實驗數據與臨床資料表明很多腫瘤在腫瘤發(fā)生發(fā)展上起源于為數不多的一小群細胞——胂瘤干細胞 (例如參見Jordan等，2006)。腫瘤干細胞具有致瘤性能力，致使腫瘤細胞群體自我更新的優(yōu)勢與低分化的特性(例如參見Hope等，2004)。腫瘤干細胞最早發(fā)現(xiàn)于造血系統(tǒng)腫瘤白血病(例如參見Lapidot等，l994)。類似于正常的造血干細胞，白血病干細胞是占白血病細胞群體一小部分、位于分化程度較低的金字塔頂端、具有無限增殖潛能的細胞，能產生具有有限的增殖能力的白血病祖細胞及其下游不同分化程度的白血病細胞，最終導致白血病發(fā)生。因此，在腫瘤疾病的靶向治療中，腫瘤干細胞已經成為備受關注的藥物設計與篩選的靼點。
由于傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物都是作用于腫瘤干細胞下游不同分化程度的腫瘤細胞，對于分化程度較低但具有無限增殖潛能的腫瘤干細胞非常不敏感，因此雖然大多數腫瘤患者都可以達到臨床緩解，但不難想象由于缺乏有效的干細胞靶向藥物而導致耐藥和復發(fā)現(xiàn)象。例如,慢性粒細胞白血病(CML) 是以CML千細胞為病因的造血系統(tǒng)腫瘤(例如參見Huntly and Gilliland， 2004)，主要特征為基因異位而形成的BCR-ABL融合蛋白，從而表現(xiàn)了異常激活的酪氨酸激酶活性；基于此原理設計的酪氨酸激酶靶向抑制劑伊馬替尼(imatinib， STI571， Gleevec)可有效的殺傷白血病細胞(例如參見 Deiiiiiiger等，2000)。但是很多慢粒患者長期用藥后會產生耐藥和復發(fā)，分子i貪斷發(fā)現(xiàn)幾乎所有的病人體內都有BCR-ABL陽性細胞殘留，這說明單獨使用酪氨酸激酶靶向抑制劑伊馬替尼不能清除所有的白血病細胞，尤其是白血病干細胞(例如參見Graham等，2002)。另外一個例子是急性粒細胞白血病(AML)，主要特征是髓系分化受阻而導致外周血充斥著大量沒有功能的原始粒細胞，包括AML干細胞(例如參見Bonnet and Dick, 1997)。由于傳統(tǒng)的化療藥物如阿糖胞苷(Ara-C)主要是通過阻斷DNA的復制而殺傷分裂期的細胞，所以對AML干細胞非常不敏感，臨床上很難達到完全緩解(例如參見Guzman等，2002; Guan等，2003)。
考慮到這些現(xiàn)狀，腫瘤治療領域明顯需要能特異性地殺傷胂瘤干細胞但對正常干細胞無明顯影響的藥物，這不僅能克服腫瘤耐藥性和復發(fā)，同時對起源于腫瘤干細胞的腫瘤疾病起到預防和根療作用。
令人驚訝的是，本發(fā)明人基于以下研究結果發(fā)現(xiàn)芬維A胺或其活性衍生物能特異性地誘導較原始肺瘤細胞的凋亡，特別是處于靜止期的 CD34 + CD38—的白血病干細胞，而對生理特征與白血病干細胞較為相似的 CD34 + CD38+白血病祖細胞也有一定的殺傷力，但對正常造血干細胞無明顯影響。同時本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與該藥物相關的聯(lián)合用藥方案可以達到更好的療效。此外，本發(fā)明人還建立一個有效篩選能夠與芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合應用以誘導腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤細胞凋亡的抗腫瘤劑的方法
發(fā)明內容
發(fā)明概述
本發(fā)明第一方面提供芬維A胺或其活性衍生物的新醫(yī)藥用途。根據本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明第二方面提供所述芬維A胺或其活性
衍生物與其它抗腫瘤藥聯(lián)合的新醫(yī)藥用途。
根據本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明第三方面提供用于所述新醫(yī)藥用途的
藥物組合物，其中包含所述芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗腫瘤藥。
本發(fā)明第四方面提供篩選與所述芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合應用于所述新醫(yī)藥用途的其它抗腫瘤藥的方法。
本發(fā)明第五方面提供清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的方法，以及清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和起源于腫瘤、尤其造血系統(tǒng)紳瘤干細胞的腫瘤細胞的方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，芬維A胺或其活性衍生物、特別是芬維A胺，能特異性地誘導腫瘤干細胞的凋亡，但對正常干細胞無明顯影響。具體對于iti&L 系統(tǒng)腫瘤，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)芬維A胺能夠特異性地誘導來自造血系統(tǒng)胂瘤患者標本中的CD34+CD38-細胞亞群調亡，而對正常造血干細胞無明顯影響，此外發(fā)現(xiàn)芬維A胺對CD34 + CD38+白血病祖細胞也有一定的殺傷力。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，芬維A胺或其活性衍生物、特別是芬維A胺，主要通過改變造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和/或祖細胞的氧化還原態(tài)的平衡，致使這些較原始的、較多處于靜止期的造血系統(tǒng)胂瘤干細胞和/或祖細胞胞內活性氧水平升高，超過其所能承受的抗氧化能力閾值，從而特異性誘導凋亡。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，芬維A胺或其活性衍生物、特別是芬維A胺誘導造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和/或祖細胞的凋亡過程，可由氧化應'^U1應、內質網應激反應、未折疊蛋白反應、蛋白酶體激活等分子事件來刻畫。特別值得注意的是，該凋亡事件起始涉及應激反應相關轉錄因子HSF1和NRF2的活化及其調節(jié)耙基因的表達，從而介導了上游藥物引發(fā)的活化氧信號向下游各種細胞應^L^應的傳遞。
根據上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明第一方面提供芬維A胺或其活性衍生物在制備用于清除或殺滅受試者腫瘤干細胞或用于治療和/或預防起源于腫瘤干細胞的肺瘤疾病的藥物中的用途。進一步地，本發(fā)明第一方面提供芬維A胺在制備用于治療和/或預防其中清除或殺滅腫瘤干細胞有益于抑制腫瘤耐藥性產生和復發(fā)的腫瘤疾病的藥物中的用途。
根據本發(fā)明的芬維A胺是一種人工合成的全反式維甲酸衍生物，其化學名為N-(4-羥基苯基)維生素曱酰胺，俗稱芬維A胺，CAS注冊號 65646-68-6 ，其可通過文獻所述方法合成(US4190594)。
根據本發(fā)明的芬維A胺的活性衍生物指的是芬維A胺經人工修飾或生
物代謝而形成的卻依然保留甚至加強其生物活性的衍生形式總稱，包括芬維A胺的活性代謝物如4-氧代-芬維A胺、芬維A胺的可能的溶劑合物、可能的前體藥物以及可能的藥學可接受的鹽。其中，應該理解，溶劑合物、前體藥物和藥學可接受的鹽具有本領域技術人員熟知的本領域通常的含
7義，具體參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第二十一版本，ISBN: 9780781746731,出版日期15-06-2005)。
根據本發(fā)明，優(yōu)選使用芬維A胺或其可藥用鹽。
根據本發(fā)明的術語"受試者"為本領域技術人員公知，在本發(fā)明中特別地指哺乳動物、更特別地是人類受試者，他們因罹患本文所述疾病即腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤而需要使用本發(fā)明的藥物組合物或方法進行預防或治療。
根據本發(fā)明的腫瘤包括造血系統(tǒng)腫瘤和實體瘤，相應地，腫瘤干細胞包括造血系統(tǒng)腫瘤千細胞和實體瘤干細胞。進一步地，根據本發(fā)明的造血系統(tǒng)腫瘤干細胞主要指來自造血系統(tǒng)腫瘤患者標本中的CD34+CD38-細胞亞群，其表達CD34但不表達CD38。根據本發(fā)明的實體瘤干細胞指的是占實體瘤少數的具有廣泛增殖與形成腫瘤能力的這一類細胞群體。根據本發(fā)明的造血系統(tǒng)腫瘤祖細胞主要是指來自造血系統(tǒng)腫瘤患者的 CD34+CD38 +細胞亞群，其表達CD34和CD38 。
根據本發(fā)明的造血系統(tǒng)腫瘤包括但不限于白血病、惡性淋巴增殖性障礙。進一步地，所述白血病包括但不限于慢性髓細胞白血病(CML)、急性髓細胞性白血病(AML)、骨髓增生異常綜合征、急性淋巴細胞白血病 (ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)。進一步地，所述惡性淋巴增殖性障礙包括但不限于淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤(MM);并且所述的淋巴瘤包括但不限于非霍奇金'淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小細胞和/或大細胞的濾泡淋巴
根據本發(fā)明的實體瘤尤其指乳癌、結腸癌和通常的包括胃癌、肝細胞瘤在內的胃腸道癌；肺癌尤其是小細胞肺癌和非小細胞肺癌、腎癌、間皮瘤、神經膠質瘤、皮膚鱗狀細胞癌、頭和頸癌、泌尿生殖癌、例如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌或膀胱癌；何杰金氏病、類癌綜合征或卡波西肉瘤。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，待治療的實體瘤疾病選自胃癌、乳癌、結腸直腸癌、卵巢癌、腎癌、肺癌、尤其是胃癌和卵巢癌。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤是it血系統(tǒng)腫瘤，所述造血系
8統(tǒng)腫瘤中優(yōu)選白血病。換言之，本發(fā)明第一方面優(yōu)選提供芬維A胺或其活性衍生物在制備用于清除或殺滅受試者造血系統(tǒng)腫瘤干細胞或用于治療和 /或預防起源于造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的逸釭系統(tǒng)腫瘤疾病的藥物中的用途。進一步地，本發(fā)明第一方面提供芬維A胺或其活性衍生物在制備用于治療和/或預防其中清除或殺滅造血系統(tǒng)腫瘤干細胞有益于抑制腫瘤耐藥性產生和復發(fā)的造血系統(tǒng)腫瘤的藥物中的用途。
才艮據本發(fā)明的"起源于肺瘤干細胞的腫瘤疾病"、"其中清除或殺滅肺瘤干細胞有益于抑制腫瘤耐藥性產生和復發(fā)的腫瘤疾病"分別表示"腫瘤發(fā)生iU艮源于具有無限自我更新能力與多向分化潛能的腫瘤干細胞群體的胂瘤疾病"、"相比清除或殺滅胂瘤細胞的方法而滋生的腫瘤耐藥性的產生與腫瘤的復發(fā)，清除或殺滅腫瘤干細胞能有效地、徹底地達到治愈的腫瘤疾病"；相應地，"起源于造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的造血系統(tǒng)胂瘤"以及"其中清除或殺滅造血系統(tǒng)腫瘤干細胞有益于抑制腫瘤耐藥性產生和復發(fā)的造血系統(tǒng)腫瘤"分別表示"造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展源于具有無限自我更新能力與多向分化潛能的造血系統(tǒng)腫瘤干細胞群體的造血系統(tǒng)腫瘤"、"相比清除或殺滅造血系統(tǒng)腫瘤的方法而滋生的肺瘤耐藥性的產生與造血系統(tǒng)腫瘤的復發(fā)，清除或殺滅造血系統(tǒng)腫瘤千細胞能有效地、徹底地達到治愈的造血系統(tǒng)腫瘤"。
本發(fā)明人通過試驗還發(fā)現(xiàn)，與芬維A胺相關的聯(lián)合用藥方案可以達到更好的效果。本發(fā)明的藥物聯(lián)合作用于造血系統(tǒng)腫瘤的試驗表明，芬維A 胺和至少一種其他抗腫瘤藥聯(lián)用可協(xié)同抑制造血系統(tǒng)腫瘤細胞增殖，協(xié)同誘導調亡，對正常對照的骨髓造血干細胞無明顯毒副作用。芬維A胺主要作用于造血系統(tǒng)腫瘤干祖細胞亞群，而另一聯(lián)用藥物主要作用于造血系統(tǒng) 肺瘤較成熟細胞亞群。例如，試驗表明芬維A胺和BCR—ABL酪氨酸激酶靼向抑制劑的聯(lián)合、芬維A胺和常規(guī)化療藥物的聯(lián)合、芬維A胺和蛋白酶體抑制劑的聯(lián)合、芬維A胺與阿糖胞苷和MG132兩種抗腫瘤藥物聯(lián) 合、芬維A胺與伊瑪替尼和MG132兩種抗腫瘤藥物聯(lián)合均顯示協(xié)同誘導腫瘤細胞的調亡。本發(fā)明的藥物聯(lián)合作用于實體瘤的試驗也表明芬維A胺和至少一種其他抗腫瘤藥聯(lián)用可協(xié)同抑制腫瘤細胞增殖，協(xié)同誘導調亡，
例如芬維A胺與防己堿協(xié)同誘導胃癌細胞凋亡。
這里所述的"協(xié)同"是指在共同使用時藥物產生的總聯(lián)合作用大于單獨使用每種藥物時的作用總和。具體對于本發(fā)明，組合藥物聯(lián)合作用于腫瘤而達到協(xié)同療效。對于造血系統(tǒng)腫瘤，這里強調的是芬維A胺主要作用于造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和/或祖細胞亞群，也可以增強另一常規(guī)抗癌藥物對造血系統(tǒng)腫瘤較成熟細胞亞群的殺傷能力。
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明第二方面提供芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗胂瘤藥聯(lián):合的新醫(yī)藥用途。具體而言，本發(fā)明第二方面提供芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗腫瘤藥的聯(lián)合在制備同時、順次或分別施用以協(xié)同誘導受試者肺瘤細胞調亡以治療和/或預防受試者胂瘤的藥物中的用途。
同樣基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明第三方面提供藥物組合物，包含治療有效量的芬維A胺或其活性衍生物，和治療有效量的至少一種其它抗腫瘤藥，以及任選的藥學可接受的載體，所述至少一種其他抗腫瘤藥與芬維A胺或其活性衍生物同時、順次或分別施用以協(xié)同誘導腫瘤細胞調亡。
用于本文的術語"其它抗腫瘤藥"是指不同于芬維A胺或其活性衍生物的抗腫瘤藥。所述至少一種其他抗腫瘤藥包括但不限于細胞周期特異性的化療藥物、BCR—ABL酪氨酸激酶靶向抑制劑、蛋白l^抑制劑和不同于前三類的常規(guī)化療藥物。
所述細胞周期特異性的化療藥物意指本領域技術人員熟知的一大類殺傷處于特定細胞周期階段增殖期細胞的化學治療藥物，包括但不限于阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、羥基脲、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、氟達拉濱、曱氨蝶呤。對于本發(fā)明第二和第三方面的用途和藥物組合物，細胞周期特異性的化療藥物優(yōu)選使用阿糖胞苷，其作用^L理是通過阻斷DNA復制而殺傷增殖期細胞，可商購得自Sigma公司。
上述BCR-ABL酪氨酸激酶是由于染色體易位形成費城染色體 (Philadelphia chromosome)而產生的融合基因BCR-ABL,其相應的編碼融
10合蛋白具有異常酪氨酸激酶活性。BCR-ABL酪氨酸激酶靶向抑制劑能阻止該激酶異常增高的活性，從而導致Bcr-Abl陽性細胞的死亡，其包括但不限于伊瑪替尼(imatinib)、達沙替尼(Dasatinib)和尼羅替尼(Mlotinib)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，使用伊馬替尼與芬維A胺或其活性衍生物的聯(lián) 合用于本發(fā)明的新醫(yī)藥用途，或使用伊馬替尼與芬維A胺或其活性衍生物連同藥學可接受的載體制備藥物組合物。本文所述伊馬替尼的化學名為 4-[(4-甲基-l-哌漆基)曱基]-N-[4-曱基-3-[4-(3-吡^^)-2-嘧錄]^J^]-苯基] 笨甲酰胺；可商購得自瑞士Novatis公司。
上述蛋白酶體抑制劑意指一類通過對泛素化-蛋白酶體通路阻斷的抗腫瘤藥物，包括但不限于bortezomib、 BzLLLCOCHO和MG-132。對于本發(fā)明笫二和第三方面的用途和藥物組合物，優(yōu)選使用蛋白酶體抑制劑 bortezomib,其化學名為(lR)-3-甲基-l-(2S)-l-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基) 氨基丙基^J^丁基]硼酸，可得自美國Millennium Pharmaceuticals公司。
上述作用機理不同于前三類的常規(guī)化療藥物意指癌癥或腫瘤治療領域常規(guī)意義上的殺傷處于各個細胞周期階段的一系列化學治療藥物，包括但不限于去甲氧柔紅霉素、長春新堿、多柔比星、柔紅霉素、米托蒽醌、長春花堿、長春地辛、三尖杉酯堿、依托泊苷、替尼泊苷、左旋門冬酰胺酶，優(yōu)選去甲氧柔紅霉素。
用于本文的"聯(lián):合"意指本發(fā)明的芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其他抗腫瘤藥可以作為同一單元劑型的各組成部分、作為不同的單元劑型或作為同一治療方案的組成部分施用。相應地，用于本文的術語"同時、順次或分別，，是指芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗腫瘤藥可以作為同一單元劑型的各組成部分或作為不同的劑型同時施用，也可以作為
不同的劑型或作為同一治療方案的組成部分在不同的時間、以任意次序分別施用。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過本身已知的方式、例如通過常規(guī)的混合、制粒、包衣、溶劑或凍千方法制備成適合于口服給藥、胃腸外給藥或局部
給藥的劑型，選自片劑、膠嚢劑、顆粒劑、注射液、注射用粉劑、透皮貼劑、軟膏劑、凝膠劑、栓劑、口服溶液、口服混懸液、注射用乳劑、口服乳劑等、緩釋片劑、控釋片劑等。盡管理論上所有制劑形式的藥物組合
物都可以用于臨床給藥，但是本發(fā)明的含芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗腫瘤藥的藥物組合物優(yōu)選口月良給藥。
本發(fā)明優(yōu)選的口服給藥的藥物組合物可例如通過將活性成分與一種或多種固體載體混合、如果需要將所得混合物制粒，并且如果需要加工所得混合物或顆粒形成片劑或片芯，如果需要通過引入額外賦形劑進行。
本發(fā)明優(yōu)選的口服給藥的藥物組合物還包括由明膠組成的硬膠嚢以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇組成的軟密封膠嚢。在軟膠嚢中，活性成分優(yōu)選溶解或懸浮在合適的液體賦形劑中，還可向其中加入穩(wěn)定劑和清潔劑。
在本發(fā)明的藥物組合物中，除了作為主藥成分的芬維A胺或其活性衍生物和作為聯(lián)合用藥的至少一種其它抗腫瘤藥外，還任選包含藥學可接受的載體。術語"藥學可接受的載體"包括藥學領域熟知的藥學可接受的載體或賦形劑，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包膠材料。就與其它成分的相容性和對患者無害的意義而言，各載體或賦形劑應當是 "可接受的"。一些可用作藥學可接受栽體的實例包括糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉類，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧曱基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟類；油類，例如花生油、棉子油、紅花油、a油、橄欖油、玉米油和大豆油；乙二醇類，例如丙二醇；多元醇類，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；和其它無毒性可配伍的用于藥物制劑的物質。
本發(fā)明的藥物組合物還可以含有輔助劑例如防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、調節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑、掩蔽劑或抗氧化劑。另外，通過包含延緩吸收的成分，可以使藥物劑型延
12長吸收。
本領域技術人員能夠理解，盡管本發(fā)明上文提及的藥物組合物中還包
含藥學可接受的載體，但是，當芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗腫瘤藥作為藥物用于人或動物時，它們也可以以其本身給予，即不加任何上述藥學可接受的載體也能實現(xiàn)本發(fā)明。
對于本發(fā)明的藥物聯(lián)合的用途以及藥物組合物而言，藥學活性劑的劑量水平和施用的時程可以改變，當然將適合于每種特定情形下的個體需求。示例性的劑量范圍對于芬維A胺或其活性衍生物為每日50或100mg至 500mg或1000mg、 2000或3000mg/m2體表面積，優(yōu)選每日100mg/m2、 200mg/m2或400mg/m2體表面積；對于其它抗腫瘤藥，例如對于 BCR一ABL酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的劑量范圍是每日200mg、 400mg、 600mg、 800mg—次，或每曰楊mg兩次，優(yōu)選每曰200mg、 400mg、 600mg—次，；例如對于化療藥物阿糖胞苷的劑量范圍是每日靜注 0.5mg/kg、 1.0mg/kg、 1.5mg/kg或2mg/kg體重，優(yōu)選每日lmg/kg體重；例如對于蛋白酶體抑制劑bortezomib的劑量范圍是單次注射0.7mg/m' 、 1.0 mg/m'、 1.3mg/m',每周2次，優(yōu)選單次注射1.0mg/m',每周2次。
使用本發(fā)明的芬維A胺或其活性衍生物以及至少一種其它抗腫瘤藥的聯(lián)合和包含二者的藥物組合物，其給藥方案和劑量方案可根據多種因素選擇，所述因素包括受試者的種類、物種、年齡、體重、性別和所治療腫瘤/
癌癥類型；所治療腫瘤/癌癥的嚴重程度(即期)；給藥途徑；患者的腎和肝功能；和使用的具體化合物或其鹽?？梢允褂靡环N給藥/劑量方案，例如預防疾病、抑制(完全或部分)疾病或使該疾病J^A停止。
基于上述本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明第四方面提供了體外篩選與芬維A 胺或其活性衍生物聯(lián)合顯示協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡的其它抗腫瘤藥的方法，所述方法包括以下步驟
1) 使腫瘤細胞與(a)有效量的芬維A胺或其活性衍生物和(b)待選的其它抗腫瘤藥相接觸，測定細胞的凋亡；
2) 使腫瘤細胞與(a)有效量的芬維A胺或其活性衍生物相接觸，測定細胞的
13凋亡；
3) 使腫瘤細胞與(b)待選的其它抗腫瘤藥相接觸，測定細胞的凋亡；和
4) 結果分析當步驟1)中所測的凋亡大于步驟2)和步驟3)中所測凋亡的總和，則判定所述待選的其它抗腫瘤藥可以與芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡。
本發(fā)明第五方面提供了清除或殺滅受試者腫瘤干細胞的方法，其包括施用有效引起腫瘤干細胞死亡量的芬維A胺或其活性衍生物的步驟。進一步地，本發(fā)明提供清除或殺滅受試者造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的方法，其包括施用有效引起所述干細胞死亡量的芬維A胺或其活性衍生物的步驟。換言之，任一項的方法即^^用單獨的芬維A胺或其活性衍生物清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)胂瘤干細胞的方法。
本發(fā)明第五方面還提供了清除或殺滅腫瘤干細胞和起源于腫瘤干細胞的腫瘤細胞的方法，其包括在施用有效引起腫瘤千細胞死亡量的芬維A胺或其活性衍生物的步驟之前、同時或之后，還包括施用至少一種治療有效量的其它抗腫瘤藥的步驟。進一步地，本發(fā)明提供清除或殺滅受試者造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和起源于造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的造血系統(tǒng)腫瘤細胞的方法，其包括在施用有效引起造血系統(tǒng)腫瘤干細胞死亡量的芬維A胺或其活性衍生物的步驟之前、同時或之后，還包括施用至少一種治療有效量的其它抗肺瘤藥的步驟。換言之，任一項的方法即使用芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗胂瘤藥的聯(lián)合以清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和起源于腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的腫瘤細胞的方法。
應該理解，對于本發(fā)明第四方面的篩選方法和第五方面的治療方法而言，上述有關芬維A胺或其活性衍生物、腫瘤及其干細胞、造血系統(tǒng)腫瘤及其干細胞和祖細胞、實體瘤以及其他抗腫瘤藥的一般定義及優(yōu)選定義均適用。
此外，本發(fā)明還涵蓋包含芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗腫瘤藥的"藥盒，，，即通過將芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗腫瘤藥分別配制在分離的單元制劑中，再將這些分離的單元制劑組合，形成藥盒的形式。在此情況下，可以容易地將分離的單元制劑中的芬維A胺或其活性衍生物和至少一種其它抗胂瘤藥在時間上同時、順次或分別施用于受試者。
在本發(fā)明的具體實施例中，研究結果首先展示與增殖期細胞相比，芬維A胺更為有效地誘導處于靜止期白血病細胞的凋亡(見實施例1)，抑制原始的白血病細胞集落的形成(見實施例2)。同時芬維A胺可以特異性乾向作用CML、 AML與ALL病人標本中分離出來的CD34+CD38—白血病干細胞，而對正常的造血干細胞無明顯影響(見實施例3、 4)。此外本發(fā) 明人還通過一系列實施例探討了白血病細胞對芬維A胺的敏感性與細胞內 ROS水平之間的關系(見實施例5)，探討了參與芬維A胺誘導凋亡的分子事件(見實施例6)，找出了芬維A胺藥物作用靶點(見實施例7)，總結芬維 A胺誘導凋亡過程中引發(fā)相關事件的動態(tài)變化關系(見實例8)。在另外一系列實施例中，發(fā)明人還提供了幾種與芬維A胺相關的藥物聯(lián)合治療方案，如芬維A胺與阿糖胞苷聯(lián)合用于治療急性粒細胞白血病(見實施例9)，芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用于治療慢性粒細胞白血病(見實施例10)，芬維A 胺與阿糖胞苷和MG132兩種抗腫瘤藥物聯(lián)合治療AML(見實施例11)，芬維A胺與伊瑪替尼和MG132兩種抗腫瘤藥物聯(lián)合治療CML(見實施例 12)，芬維A胺與防己堿聯(lián)合用于胃癌(見實施例13)。最后，發(fā)明人提供芬維A胺活性衍生物在清除或殺滅白血病干細胞中的應用(見實施例14、15)，列舉了芬維A胺的制劑(見制劑實施例)。
盡管本發(fā)明大多采用大量造血系統(tǒng)腫瘤臨床標本進行實驗，但是本領域技術人員清楚，采用大量標本進行的試驗具有普遍代表性，并且通過本領域技術人員的知識可以容易地將這些試驗所呈現(xiàn)出的有益效果擴展到人體臨床應用。

圖1顯示芬維A胺對增殖期與血清饑餓型靜止期白血病細胞林HL60 誘導凋亡、線粒W夸膜電位(MTP)以及胞內活性氧(ROS)水平的影響作用。 (A)芬維A胺在增殖期與靜止期HL60細胞中誘導的凋亡。凋亡采用 ApoAlert Annexin V試劑盒由流式細胞儀測定。(B) Rhl23與PI雙染色方法檢測芬維A胺對增殖期與靜止期HL60細胞線粒體跨膜電位的影響。(C) 利用氧化敏感性熒光燃料DCFH-DA檢測芬維A胺對增殖期與靜止期 HL60細胞ROS的影響。
圖2顯示芬維A胺對原始CML細胞集落形成的影響作用。將從CML 病人新鮮骨髓標本中分離得到的CD34 +細胞分別接種于含有2 與4 HM芬維A胺的曱基纖維素半固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14天后對粒-單系集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系集落形成單位(BFU-E)與粒紅巨核巨噬系混合集落形成單位(CFU-GEMM)進行鑒定并計數。
圖3顯示芬維A胺特異性靶向作用于更原始的CML干細胞與祖細胞亞群。(A)芬維A胺顯著誘導CD34 + CD38 — CML干細胞與CD34 + CD38 + CML祖細胞凋亡。(B)芬維A胺特異性耙向CML干細胞對正常造血干細胞沒有影響。經芬維A胺處理后，用CD34-PE與CD38-APC抗體對從CML病人骨髓標本中富集到的CD34+細胞進行標記，CD34 + CD38—細胞為CML干細胞，CD34+CD38+細胞為CML祖細胞。其中7AAD與 Annexin V抗體用于檢測干細胞與祖細胞亞群的凋亡。同時用正常造血干細胞作為對照，檢測方法同上。
圖4顯示芬維A胺能顯著性地誘導包括AML和ALL在內的急性白血病原代靜止期細胞凋亡。(A)CD34+白血病細胞的周期測定。(B)芬維A 胺誘導的AML CD34+細胞與正常CD34+細胞的凋亡。
圖5顯示芬維A胺特異性殺傷更為原始的急性白血病干細胞與祖細胞。經芬維A胺處理后，用CD34-PE與CD38-APC抗體對從AML與ALL 病人骨髓標本中富集到的CD34+細胞進行標記，CD34 + CD38—細胞為急性白血病干細胞，CD34 + CD38+細胞為急性白血病祖細胞。其中7AAD與
16Annexin V抗體用于檢測干細胞與祖細胞亞群的凋亡。
圖6顯示芬維A胺在白血病細胞系中誘導的凋亡作用同細胞內ROS 的水平密切相關。(A)K562、 HL60與NB4細胞內ROS的本底水平，用 DCFH-DA染料檢測。(B)K562、 HL60與NB4細胞對芬維A胺的敏感性。細月包凋亡用Annexin - V與7AAD雙染法的測定
圖7顯示芬維A胺增強在白血病細胞系中同氧化應激相關和內質網應激相關的基因表達。(A)經芬維A胺處理的NB4細胞中，氧化應激介導的凋亡的基因表i^漠式。(B)western發(fā)汪了芬維A胺在NB4細胞中i秀發(fā)的氧化應激介導的凋亡。(C)經芬維A胺處理的K562細胞表現(xiàn)出典型的內質網應激反應(ER stress)基因表達模式。(D)在芬維A胺處理的K562細胞中，內質網應激反應的標志分子XBP-l基因發(fā)生了剪切。該圖為RT-PCR結果。
圖8顯示應激相關轉錄因子NRF2與HSF1以及它們調控的耙基因的有序調節(jié)參與了經芬維A胺誘導NB4細胞凋亡過程。(A)經l nM芬維A 胺處理后，NB4核蛋白中NRF2與HSF1蛋白含量變化的western結果。 *代表非特異結合條帶。(B)免疫熒光顯微鏡技術展示了在經1 jiM芬維A 胺處理的NB4細胞中NRF2與HSF1的核轉運現(xiàn)象，標尺為5 jiM。 (C) 受NRF2(左圖)與HSF1 (右圖)調節(jié)的潛在靶基因的表達片莫式。(D)染色質免疫沉淀(ChIP)與PCR技術發(fā)汪了 NRF2和HSF1與其耙基因的物理結合。Total:總產物；IgG:以IgG抗體為對照的ChIP結果。DNAJB6*: 在DNAJB6非轉錄因子結合位點設計的引物。
圖9顯示應激相關轉錄因子NRF2與HSF1對氧化應激介導的NB4細胞凋亡的特征性表達i普影響。氧化應激表達語數據由層次聚類(hierarchical clustering)方法所得。圖的左側為轉錄因子結合位點(TFBS)信息，用紅色標記。圖的上方標注了各種應激條件，除芬維A胺在NB4細胞中誘導凋亡以外，其他應激反應的處理都低于致死閾值，可以代表細胞存活狀態(tài)下的轉錄組應答模式。其中熱激數據來源于Hela、成纖維細胞與K562細胞。內質網應激反應數據來源于經糖基化抑制劑衣霉素與硫氫基還原劑
17DTT處理的Hela細胞，及DTT處理的成纖維細胞。氧化應激來源于經 11202或曱萘醌處理的Hela細胞與甲萘醌處理的成纖維細胞。
圖10顯示ROS的阻斷與蛋白酶體活性的抑制對芬維A胺誘導的凋亡的影響。(A)在NB4細胞中，抗氧化劑抗壞血酸鈉(Vc)阻斷了芬維A胺誘導的凋亡。(B)芬維A胺與蛋白酶體抑制劑MG132協(xié)同誘導NB4細胞凋亡。
圖11顯示芬維A胺促進氧化應激與內質網應^L^因在CML病人 CD34+細胞中表達。CD34 +細胞來源于CML病人新鮮骨髓標本。基因的調變由熒光實時定量RT - PCR技術檢測。
圖12芬維A胺誘導凋亡過程中動態(tài)事件變化情況。主要涉及的事件包括ROS水平升高、凋亡前CHOP表達變化、受NRF2與HSF1調節(jié)的潛在耙基因的表M式變化情況。
圖13芬維A胺與阿糖胞苷聯(lián)合用藥協(xié)同抑制AML細胞的生長。縱坐標表示達到不同抑制率(GI)以及相應協(xié)同指數(CI)所需要的單獨各自藥物劑量與合用藥物劑量。
圖14顯示芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥對CML原始細胞集落形成的影響。CD34+細胞來源于CML病人新鮮骨髓標本，分別接種于含有0.25 HM伊馬替尼(S0.25)、 4 nM芬維A胺(H4)、或兩藥合用(H4S0.25)的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基Methocult H4434中，培養(yǎng)14天后對單系集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系集落形成單位(BFU-E)與粒紅巨核巨噬系混合集落形成單位(CFU-GEMM)進行鑒定與計數.
圖15顯示芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥對CML干細胞與祖細胞及正常造血干細胞的影響。用CD34-PE和CD38-APC抗體對從CML病人新鮮骨髓標本中富集的CD34 +細胞進行標記，將細胞分成CD34 + CD38 — CML干細胞(LSC)與CD34 + CD38 + CML祖細胞(progenitors)兩個群體，并對干細胞進一步用Annexin V與7AAD進行凋亡檢測。正常造血干細胞的檢測同上。
圖16顯示芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥對K562細胞中BCR-ABL激酶活性的影響情況。(A)芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥對BCR - ABL、磷酸化BCR-ABL與磷酸化STAT5蛋白表達量的影響。(B)凋亡標志分子Caspase 3酶原形式、Caspase 3剪切形式與PARP剪切形式在經芬維A 胺、伊馬替尼單獨用藥或聯(lián)合用藥的K562細胞中的表達。CON:未處理組；H:芬維A胺處理組；S:伊馬替尼處理組；H + S:芬維A胺與伊馬替尼兩藥合用處理組。
圖17顯示芬維A胺、阿糖胞苷與MG132三藥合用協(xié)同誘導AML 細胞凋亡。
圖18顯示芬維A胺、伊瑪替尼與MG132三藥合用協(xié)同誘導CML細胞凋亡。
圖19顯示芬維A胺與中草藥抗腫瘤藥物防己堿協(xié)同誘導胃癌細胞凋亡。(A、 B ) Rhl23/PI雙染法測定MKN45和SGC 7901細胞在加藥處理后24小時和48小時的凋亡。(C、 D ) Annexin V/PI雙染法測定MKN45 及SGC7卯1凋亡率。
圖20給出表1，該表總結了 CML病人標本的基本信息。38例CML 病人標本中，有31個為剛診斷的慢性期病人標本，5個伊瑪替尼耐藥病人標本，一個急變期病人，一個伊瑪替尼耐藥轉加速期病人標本。
圖21中給出表2，該表總結了芬維A胺對急性白血病標本和正常人標本中CD34+細胞凋亡的影響。其中包括25例AML病人標本，17例ALL 病人標本與8例正常人標本。
圖22中給出表3，該表顯示了 4-氧代-芬維A胺對靜止期與增殖期白血病細胞活力的影響。
具體實施例方式
以下通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明，應當理解，本發(fā)明并不受這些實施例的具體描述的限制，本發(fā)明所要求的權利范圍應當以所附的權
利要求書為準。
A、材料和方法部分
191. 細胞系、培養(yǎng)M及藥物處理
細胞系為(a)慢性粒細胞白血病(CML)急變期來源的細胞林K562(BCR -ABL陽性細胞林)、(b)急性髓系細胞白血病細胞抹NB4和HL-60。
將各細胞培養(yǎng)于含有10 %胎牛血清(PAA， Linz， Austria)的RPMI1640 培養(yǎng)基中，放置于37。C、含5。/。C02的、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。伊馬替尼(Imatinib)由Novartis公司(Basel, Switzerland)提供，芬維A胺 (fenretinide)購自Sigma 7〉司(St Louis, MO)。分別用(i)0.25 fiM伊馬替尼、(ii)4 nM芬維A胺、以及(iii)0.25 jiM ^尹馬替尼與4 jiM芬維A胺兩藥聯(lián)用，將細胞處理24、 48和72小時。
2. 血清饑餓型靜止期白血病細胞模型
將HL-60細胞分別培養(yǎng)于(i)含有10%胎牛血清、和(ii)不含血清的 RPMI1640培養(yǎng)基中，以獲得增殖期與靜止期的白血病細胞模型。檢測藥物反應性時，將血清饑餓型靜止期白血病細胞和增殖期白血病培養(yǎng)于含有 0.5 %胎牛血清的培養(yǎng)基中，分別用1 jiM與2.5 nM濃度的芬維A胺處理。同時設置兩種化療藥物作為對照(i)20 ^M去甲氧柔紅霉素(IDA)、(ii)5 pM 阿糖胞苷(Ara-C)。
3. CD34 +細胞的分離
經上海交通大學醫(yī)學院論理委員會許可，根據赫爾辛基宣言，獲得了 38例CML病人、25例AML病人、17例ALL病人和5例非白血病捐獻者的新鮮骨髓標本與8例正常人標本。用FicoU(上海第二試劑公司，上海，中國)密度梯度離心方法從標本中分離出單個核細胞。CD34 +細胞的分離參照相應手冊4吏用EasySep⑧人類CD34正選試劑盒(StemPro 34; Gibco BRL， Gaithersburg, MD)。所有分選的CD34+細胞樣本經流式細胞儀檢觀'J，其純度都在92-98%范圍內。CD34+細胞培養(yǎng)于還含有細胞生長因子 (PeproTech，倫敦，英國)的無血清培養(yǎng)基中(StemPro 34; Gibco BRL， Gaithersburg, MD)。其中所需生長因子為GM-CSF (200pg/mL)， G-CSF (1 ng/mL); SCF (200 pg/mL); LIF (50 pg/mL)， MIP陽la (200 pg/mL)和IL-6 (1 ng/nrL)。4. 白血病干^且細胞的凋亡檢測
原始的AML與CML細胞(CD34 +分選得到的細胞)用CD34-PE與 CD38-APC (Beckman Coulter, Fullerton， CA)標記，室溫孵育15分鐘，細胞用預冷的PBS清洗一次，再用200^1 lx結合緩沖液(10 mM HEPES/NaOH， pH 7.4; 140 mM NaCl; 2.5 mM CaCh)重新混懸，加入5pL A騰xinV-FITC (BD Pharmingen， San Diego， CA)和7-氨基放線菌素 (7-AAD， 0.25 mg/mL) (Molecular Probes, Eugene, OR),室溫孵育15分鐘后，用流式細胞儀進行凋亡檢測。
5. 細胞系凋亡檢測
2xl05細胞采用ApoAlert Annexin V-FITC凋亡試劑盒(BD Biosciences)進行凋亡檢測.細胞用PBS清洗一次后，重懸于200^1 lx結合緩沖液，加入5pL AnnexinV-FITC、 10pLPI，避光室溫孵育15分鐘，用流式細胞儀進行凋亡檢測(LSRII， Becton Dickinson)。
6. 線粒體跨膜電位(AYm)的測定
親脂性陰離子染料Rhl23和PI雙染檢測細胞的線粒體跨膜電位(A甲m) 的變化和線粒體膜的完整性。2xl()5的細胞用PBS洗滌1次，加入Rhl23 至終濃度10jig/ml，在37。C下避光溫育30min后離心洗去Rhl23，加入碘化丙啶(PI)至終濃度為10ng/ml，于暗處4'C放置30min。經流式細胞儀進行檢測。
7. 活性氧(ROS)的檢測
細胞內活性氧(ROS)水平用過氧化敏感性熒光探針2'，7，-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)進行測定(Molecular Probes)。細胞經芬維A胺處理3h后，收集2xl05細胞，用PBS洗滌1次，重新混懸于lml含有10jiM DCFH-DA的PBS中，37。C孵育30min，用PBS洗滌兩次后，在530 nm 波長處用流式細胞儀進行熒光強度的測定。
8. 免疫印記(Westernblot)檢測蛋白表達。
細胞總蛋白或核漿抽提蛋白用以下抗體進行Western blot檢測caspase 3 (BD Pharmingen， San Diego, CA)、剪切形式的caspase畫3，褲酸化BCR-ABL、磷酸化醫(yī)STAT5和卩-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)、剪切形式的PARP和GADD153 (Calbiochem， SanDiego， CA)、 BCR-ABL和GRP78 (Santa Cmz， CA) 、 NRF2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)、 HSF1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz， CA)。
9. 集落形成實驗
將1000個CD34 +細胞接接種于分別混有伊馬替尼(0.25 pM)、芬維A 胺(2 nM或4 nM)及合用組藥物(芬維A胺2 jiM+伊馬替尼0.25 pM,或芬維A胺4 nM+4尹馬替尼0.25 jiM)的曱基纖維素半固體培養(yǎng)基(Methocult H4434; Stem Cell Technologies, Vancouver, BC,加拿大)中，放置于37。C 、含5%C02、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天。然后進行集落分成粒-單系集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系集落形成單位(BFU-E)與粒紅巨核巨噬系混合集落形成單位(CFU-GEMM)，分別進行計數。細胞數大于50 個的祐j見為一個集落。
10. 細胞周期分析
收集lxl(^細胞，用PBS洗滌2次，用預冷的75%乙醇進行固定，在 4。C下過夜。將固定好的細胞用PBS洗滌2次，用0.5fig/mlRNaseA在37。C 下孵育30分鐘，重新混懸于500ji1含有PI終濃度為10照/ml的PBS中，用流式細胞儀進行周期檢測，所得結果用cellFit軟件分析。
10. 統(tǒng)計分析。
4吏用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software, SanDiego, CA)對數據進4于統(tǒng)計分4斤。數據通過l-way ANOVA分析并隨后通過Tukey post hoc檢驗。配對t檢驗用于兩組顯著性比較。
11. 基因芯片雜交與數據挖掘
所用芯片是本實驗室自制的，含有12，630個cDNA克隆，代表10，647 條基因，用Generation III點才羊4義(Amersham Pharmacia Biosciences)制備完成。cDNA文庫所含基因表達于血液細胞?？俁NA用TRIzol(Life
22Technologies)提取，經RNEasy柱(Qiagen)進一步純化。純化的RNA用RNA LabChip試劑盒(Agilent Technologies, Palo Alto， CA)定量后進行標i己反轉。取30jig RNA樣本用Superscript II逆轉錄酶進行(Life Technologies) 逆轉錄，并在此過程中摻入Cy3-dCTP或Cy5-dCTP熒光染料。經標準程序雜交后，熒光信號用激光掃描器(Axon Instruments, Union City, CA) 進行掃描。所得數據標準化后計算藥物處理組RNA樣本與內參的比值。為了避免假陽性并保留芯片表達數據中生物學上有意義的調變基因，本發(fā)明人提出一種基因篩選、基因聚類的分析方法，該方法是自主開發(fā)并獲美國專利的自組織圖平面展示技術的改進版(Xiao等，2003)(MW/^A "m/s"te附 /br fffifl/p/s Wswfl//zffftV w 附 /,/必附￡附/卵"/ tif"to. US, Patent No:美國專利6897875)。
12. 熒光實時定量RT-PCR
熒光實時定量RT-PCR使用SYBR Green I染料(Applied Biosystem， Foster City, CA)在熒光定量RT-PCR4義ABI7900熱循環(huán)檢測系統(tǒng)上進行。
13. 抑制實驗
在ROS的拮抗實驗中，NB4細胞先經100 nM抗氧化劑抗壞血酸鈉 (Sigma)預處理2h，然后用l jiM芬維A胺處理24h，檢測其凋亡變化。在蛋白酶體抑制實驗中，NB4細胞分別由0.5 nM芬維A胺和0.2 nM蛋白酶體抑制劑MG132(Calbiochem)單用或合用處理48h，然后檢測其凋亡。
14. 免疫熒光4支術
為了檢測轉錄因子激活后在細胞內位置的變化，NRF2與HSF1用免
疫熒光技術進行了檢測。
15. 染色質免疫共沉淀(ChIP)分析
使用NRF2與HSF1的抗體進行免疫共沉淀實驗(ChIP)。沉淀下來的片段用熒光定量PCR技術!Ht由計算機預測出的基因啟動子區(qū)域的潛在轉錄因子結合位點(transcription factor binding sites, TFBS)。
16. 細胞活力測定
使用3-(4，5-二甲基-2-噻哇)-2，5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(MTT)檢
23測細胞的活力。
B、實施例部分實施例1
芬維A胺更為有效地誘導白血病干細胞模型一一處于靜止期的白血病細胞的凋亡
有文獻纟艮道來源于AML的HL60細胞林在血清饑餓的情況下會發(fā)生增殖阻滯(例如參見Bello等，2005)。為了檢測芬維A胺對增殖期與靜止期細胞的作用，HL60細胞株被選作血清饑餓型靜止期白血病細胞模型。
該模型HL60細胞在沒有血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h， G0/G1期(靜止期)細胞達到了 59.9%。將血清饑餓型白血病細胞與增殖期細胞培養(yǎng)于 0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基中，用1jiM和2.5nM芬維A胺處理，同時用化療藥物20 nM去甲氧柔紅霉素(IDA)和5 nM阿糖胞苷(Ara-C)處理組作為對照。在增殖期HL60細胞中，1 jiM和2.5 pM芬維A胺24h誘導凋亡的比例分別是11.8%與36.8%;而在血清饑餓型靜止期HL60細胞中，芬維 A胺誘導的凋亡分別是39.5%與52.7%。這暗示了血清饑餓型靜止期白血病細胞對芬維A胺更敏感，尤其當芬維A胺的濃度為1 nM時(pO.OOOl) (圖1A)。相比較之下，化療藥物甲氧柔紅霉素在增殖期與靜止期HL60細胞中誘導的凋亡率分別分別為88.7%與29.1%，其誘導靜止期細胞凋亡的能力顯著降低(p〈0.000001)。 Ara-C處理組的結果類似(p<0.00001)。芬維 A胺在多種腫瘤細胞中可以誘導細胞內ROS水平的增高，降低線粒體的跨膜電位，最終誘導了細胞的凋亡。在此我們用Rhl23與PI雙染法檢測了增值期與靜止期HL60細胞線粒體的跨膜電位的變化。與增殖期細胞相比，芬維A胺顯著降低了靜止期細胞的線粒體的跨膜電位，而化療藥物無論是去甲氧柔紅霉素還是阿糖胞苷對靜止期細胞的跨膜電位都基本無影響 (圖1B)。本發(fā)明人進一步研究了芬維A胺對細胞內ROS水平的影響。血清饑餓48h的靜止期HL60細胞中的ROS本底水平下降了 36%。經1 jiM 或2.5 jiM芬維A胺處理3h的增殖期細胞ROS分別升高了 1.77與2.6倍；而對于靜止期的細胞，ROS的升高分別為3.83與4.3倍。芬維A胺在同等條件處理下，血清饑餓型白血病細胞胞內ROS水平要比增殖期細胞內ROS水平顯著升高，不僅表現(xiàn)在ROS改變倍數上，還表現(xiàn)在ROS 的最終水平上(圖1C)。
實施例2
芬維A胺抑制原始的白血病細胞集落的形成
我們進一步對從38例CML病人骨髓標本中獲得的原始CML細胞進行了集落形成實驗，檢測芬維A胺對該群體細胞集落形成的影響(表1)。首先，采用EasySep 人類CD34陽性分選試劑盒進行CML CD34+細胞的分選，并將該細胞接接種于還含有2nM或4nM芬維A胺的曱基纖維素培養(yǎng)基中，分別觀察芬維A胺對粒-單系集落形成單位(CFU-GM)、爆式紅系集落形成單位(BFU-E)與粒紅巨核巨噬系混合集落形成單位 (CFU-GEMM)的影響。如圖2所示，當芬維A胺濃度從2 增加到4 時，爆式紅系集落形成單位的數量顯著減少，其抑制率從24%±6%增加到66% ± 9% (p<0.001)，而相對于紅系而言，粒-單系集落形成單位的數量減少得沒那么明顯，2 jiM和4 jiM的芬維A胺對應的抑制率分別是 19% ±7%和36 ± 9% (p<0.05)。尤為值得注意的是由更為原始的祖細胞形成的集落——粒紅巨核巨噬系混合集落形成單位，在芬維A胺處理組不能凈皮檢測到。
實施例3
芬維A胺特異性耙向作用于原始的CML細胞CML干細胞及其祖細胞，而對正常造血干細胞沒有影響。
白血病細胞被證明是一個具有等級結構的細胞群體(例如參見Bonnet and Dick, 1997)。所以非常有必要找出芬維A胺所作用的群體。
將CML病人標本分離的細胞分成單個核細胞與CD34+細胞兩個群體，其中CD34 +細胞為較為原始的CML細胞，包含CML干細胞與祖細胞。故將CD34 +細胞用抗體標記再細分為CD34 + CD38 —CML干細胞與 CD34 + CD38 + CML祖細胞，同時用7AAD與Annexin V標記檢測其凋亡。結果顯示，芬維A胺基本不能誘導單個核細胞凋亡。對CD34 + CD38 + CML 祖細胞而言，芬維A胺的誘導凋亡呈劑量依賴性，2 nM、 4pM和6nM 芬維A胺誘導的凋亡率分別為17.83%±6.01% 、 30.60%±4.93%和 33.08%±9.43%。然而在CD34 + CD38 —CML干細胞中，芬維A胺在較低的濃度就可以顯著誘導凋亡。2jiM、 4jiM和6nM芬維A胺誘導的凋亡率分別為60.58%±2.76%、 63.75%±8.49%和62.83%±9.72%(圖3A)。 CML 干細胞與祖細胞之間凋亡率差異顯著(p〈0.001)。圖3B分別顯示了芬維A 胺對白血病干細胞(LSC)與正常造血干細胞(HSC)的影響。該圖的試驗分別來自一代表樣本，其他各4例CML樣本與正常人標本與該結果一致。與未處理組相比，芬維A胺使白血病干細胞比例顯著下降了 80.3%，同時該群體細胞的凋亡率顯著增高，為53.3%。而在正常造血干細胞組，芬維A 胺基本沒有改變其比例(減少5.36%)，同時細胞凋亡率為19.08%。該結果表明，芬維A胺可以特異性誘導CML干細胞與祖細胞的凋亡，但對正常造血干細胞的活力基本沒有影響。
實施例4
芬維A胺特顯著^"導原始的靜止期AML與ALL急性白血病細胞凋亡，而對正常造血干細胞及其祖細胞沒有影響。
因為肺瘤千細胞大部分處于靜止期，所以傳統(tǒng)的化療藥物對其非常不敏。從AML與ALL樣本中分離的原代急性白血病細胞大多數都是靜止期細胞，特別是CD3(群體(例如參見GuanandHogge，2000)。為了驗證對該靜止期細胞對芬維A胺的敏感性，我們比較了芬維A胺對短期培養(yǎng)的原代白血病細胞與正常樣本細胞的影響。首先我們對從原代白血病細胞中分離出來的CD34+細胞用PI染色后進行了 DNA含量的分析。流式結果顯示 AML與ALL CD34 +細胞大部分處于G0/G1期，表明白血病CD34+細胞表現(xiàn)出靜止期特征(圖4A)。然后對CD34 + AML細胞與CD34+正常造血細
26胞用annexin-V FITC與7AAD雙染法進行了凋亡檢測(圖4B)。在AML CD34+細胞中，芬維A胺誘導了顯著的凋亡，且該凋亡呈時間與劑量依賴性。與之相反，正常的CD34 +造血細胞表現(xiàn)出一定程度的耐藥。表2列出了芬維A胺對25例AML、 17例ALL，與8例正常標本中CD34+群體的作用。5 nM芬維A胺處理8h后，AML CD34+細胞的平均存活率為 45.4%。然而AML樣本間對芬維A胺的反應性差異比較大，最敏感的細胞存活率只有0.5%(AML #20)，而最耐受的細胞存活率為89.7% (AML #8)。芬維A胺濃度增加到7.5 nM， AML CD34+細胞平均存活率下降到了 12.2%。與^M目似，ALLCD34+細胞經芬維A胺處理后也表現(xiàn)出劇烈的凋亡。5nM和7.5nM芬維A胺作用下的細胞平均存活率分別為58.0%和 20.9%。為了驗證芬維A胺是對腫瘤細胞特異性殺傷，本發(fā)明人還對正常造血細胞進行了細胞活性檢測。結果發(fā)現(xiàn)當芬維A胺為5nM時，正常造血細胞的活力基本沒受影響(97.1%)，而當芬維A胺濃度達到7.5pM時，細胞存活率下降到58.1%。所以，發(fā)明人認為芬維A胺在5nM以內為安全劑量，而且較正常的CD34+細胞而言，芬維A胺對AML與ALL CD34 +細胞顯示了特異性殺傷。
進一步，我們檢測了芬維A胺對AML與ALL中處于高度靜止期的 CD34+CD3K白血病干細胞和CD34+CD38+白血病祖細胞的作用。由于4帥獲得足夠數量的正常人CD34+CD38—細胞，這里所用的凋亡數據來源于正常人的CD34+細胞群體。同時本發(fā)明人用阿糖胞苷(Ara-C)與長春新堿 (VCR)作為對照，來檢測化療藥物誘導的白血病干細胞的凋亡，因為通常情況下腫瘤干細胞被認為是化療藥物耐受型。結果顯示，芬維A胺在 CD34+CD38-急性白血病干細胞群體中比在CD34+CD38+急性白血病祖細胞群體中誘導了更多的凋亡，而對正常CD34+細胞基本沒有影響(圖5)。
實施例5
芬維A胺誘導白血病細胞系的凋亡能力與細胞內ROS升高的水平呈正相關在很多腫瘤中，芬維A胺誘導的凋亡顯示出一個共同的特征ROS 依賴性凋亡(例如參見Sun等，1999)。因此本發(fā)明探討了細胞內的ROS水平與芬維A胺誘導的細胞凋亡之間的關系。本實驗在一系列的白血病細胞系K562、HL60和NB4中展開。細胞內的ROS水平用熒光探針DCFH-DA 來檢測，不同濃度的芬維A胺誘導的細胞凋亡用annexin-V FITC與 7AAD雙染法檢測。結果發(fā)現(xiàn)，NB4、 HL60和K562細胞內的ROS水平為NB4>HL60 >K562 (圖6A)，而有趣的是這些細胞對芬維A胺的敏感性也為NB4〉HL60 〉K562.(圖6B)。結果表明，芬維A胺誘導的細胞凋亡與細胞內ROS的水平呈正相關。
實施例6
在白血病細胞系中，芬維A胺誘導凋亡所發(fā)生的顯著分子事件及與蛋白酶體抑制劑協(xié)同促凋亡的作用。
盡管芬維A胺誘導凋亡效應顯著(例如參見Oridate等，1997)，但其分子機理尚不明晰。尤其是在芬維A胺誘導的氧化應激反應如何激活下游分子事件這一方面更是知之甚少。本發(fā)明人整合了基因芯片技術、robust數據挖掘工具與分子生物學^^支術，對芬維A胺在白血病細胞系中誘導的凋亡進行了全面的分析。NB4細胞林的轉錄組分析結果顯示在芬維A胺誘導的凋亡的過程中，大量氧化應激事件在不同的時間與空間水平被激活，反應出一個典型的氧化應激介導凋亡的生物學過程。這些顯著事件包括轉錄調控、核糖體機器、氧化應激反應、內質網應激反應(ER stress)、未折疊蛋白反應(UPR)、泛素化蛋白酶體系統(tǒng)與凋亡等(圖7A)。相類似地，芬維A 胺在K562細皿中誘導凋亡的轉錄組表達鐠也激活了內質網應'^L^應、 UPR和蛋白S^等相關基因(圖7C)。最近有研究結果表明芬維A胺能夠擾亂細胞內環(huán)境平衡，激活內質網應'^應，并最終導致凋亡。內質網應激反應是細胞的一種保護機制，用以抵抗外界^^種刺激，包括氧化應激。為了證實轉錄組分析得到啟示與相關的分子事件，本發(fā)明人進一步用RT - PCR實驗驗證內質網應激反應的標志分子XBP - 1。在芬維A胺處理過的K562細胞中，XBP- 1的剪切形式持續(xù)出現(xiàn)于各個時間點(圖7D)。
轉錄組分析的結果促使本發(fā)明人對氧化應激介導的凋亡進行了更深入的生物信息學分析，包括對調變基因上游轉錄因子的預測。幾十個預測的轉錄因子中包括兩個應激應答轉錄因子NRF2與HSF1，它們在氧化信號向下游事件傳遞的過程中起著重要作用。NRF2是本領域熟知的一個維持細胞氧化還原平衡的關鍵分子，可以激活抗氧化基因對抗氧化應激(例如參見Jaiswal， 2004)。而HSF1通常情況下被認為是一個熱激轉錄因子(例如參見Hayashida等，2006)，在特定的環(huán)境下也會被氧化應激激活(例如參見 Ahn and Thiele， 2003)。因此本發(fā)明人對這兩個轉錄因子在芬維A胺誘導的凋亡中時間豐度與空間位置的變化做了進一步的研究。如圖8A所示，經芬維A胺處理后，NB4核蛋白中NRF2與HSF1蛋白的含量在短時間內(小于6h)顯著升高。NRF2被持續(xù)激活，而HSF1的激活只在24h以內。免疫熒光實驗驗汪了這一結果，未經處理的細胞，NRF2與HSF1呈現(xiàn)彌散分布，而芬維A胺處理6h的細胞，兩轉錄因子顯著的聚集到細胞核中(圖 8B)。同樣，NRF2入核的現(xiàn)象超過了 24h，而HSF1的激活則在該時間點終止。此外，NRF2與HSF1在時間與空間水平的變化與其調控的乾基因變化非常一致(圖8C)。 NRF2的潛在耙基因上調持續(xù)到了藥物處理的晚期，而HSF1的潛在耙基因上調持續(xù)到中期。為了檢測這兩個轉錄因子是否真的結合到了所預測的耙基因上，本發(fā)明人進行了染色質免疫沉淀實驗 (ChIP)。根據預測到的代^&因結合位點(圖8C)，本發(fā)明人設計了相應的引物，以NRF2和HSF1特異性抗體拉下來的ChIP產物為DNA模板進行PCR驗證。如圖7D所示，預測的含有NRT2結合位點的基因如尸7X、 A《0 、 JXA^Z)J 、 GCXAf和GCXC在NRF2的ChIP產物中為陽性結果，而非相關基因如丄i jRC、 AFB/和iMATZ4在相同的產物中為陰性結果。盡管在未經芬維A胺處理的ChIP產物中也能檢測到基底水平的 NRF2結合基因，但處理組大多數預測基因的信號顯著強于未處理組。同樣HSF1的ChIP-PCR實驗得到了相似的結果(圖8D右側)。值得注意的是，4艮據轉錄因子結合位點區(qū)域i殳計的引物在HSFl的ChIP產物中可以
29檢測到目的基因，而非轉錄因子結合位點區(qū)域引物則沒有信號，例如基因
Z>7VJ/56與Z>A^/56*。綜上所述，本發(fā)明人的實驗結果表明在芬維A胺處理的早期ROS的累積激活了轉錄因子NRF2和HSF1， 4吏得氧化應激的信號由其靶基因傳遞到了下游事件。NRF2的激活一直持續(xù)到晚期，而 HSF1的激活則在中期末端結束。芬維A胺在白血病細胞中誘導的凋亡是應激應答轉錄因子有序地調節(jié)了大量應激應答基因回應氧化應激的結果。本發(fā)明人認為在芬維A胺誘導凋亡的過程中，這些氧化應激應答特征賦予細胞的是一種促凋亡而非促生存信號。為了驗證上述觀點，并評估NRF2 與HSF1對上述特征性表達鐠的潛在影響，本發(fā)明人比較了芬維A胺與三氧化二砷(ATO)介導的凋亡(例如參見Zheng等，2005)以及一系列非凋亡條件下的應激應答表達譜數據(例如參見Murray等，2004)。通過分級 (hierarchical)聚類分析，整合基因組轉錄因子結合位點數據，圖9展示了在凋亡與非凋亡條件下的應激應答轉錄組特征。該特征性表達鐠可以被分成4大類。第一類基因的調變主要由于HSF1的激活，同時也表明在熱激條件下該類基因的顯著上調。值得注意的是HSF1在非凋亡條件的激活是持續(xù)的而非短暫的。第二類基因的調變比較復雜，可能是由于參與了多種應激應答轉錄因子的調節(jié)如CHOP與XBP1等，從圖中可以看到多種轉錄因子的結合位點。這些基因涉及內質網應激反應與UPR，調變發(fā)生在氧化應激介導的凋亡的中期。第三類基因的調變發(fā)生在中晚期，與氧化還原信號直接相關，主要受NRF2與其輔助因子MAF調節(jié)。第四類基因的特征最明顯，主要是編碼蛋白i^亞基的基因，受ELK1調節(jié)。綜上所述，本發(fā)明的數據清晰的展示了經芬維A胺處理的NB4細胞應激應答轉錄組特征是一個典型的由氧化應激介導凋亡的表達語特征。
ROS信號在芬維A胺誘導的凋亡早期可能是一個不可或缺的刺激。為了驗證芬維A胺誘導凋亡的ROS依賴性，我們用抗氧化劑抗壞血酸鈉抑制ROS的生成。實驗表明，在NB4細胞中，抑制ROS的生成可以完全阻斷芬維A胺誘導的凋亡(圖IOA)。
由于基因表達鐠顯示編碼蛋白酶的基因在芬維A胺誘導的凋亡的過程中被顯著上調，發(fā)明人推測蛋白酶體的激活可能是細胞的一種保護機制，與UPR偶聯(lián)，降解大量未折疊或4f^:折疊的蛋白以減輕對內質網的壓力 (例如Meusser等，2005)。蛋白酶體的激活可能與促凋亡/凋亡級聯(lián)反應相拮抗。為了驗證這一設想，本發(fā)明人使用了蛋白酶體抑制劑GM132阻斷蛋白酶體的活性。如圖IOB所示，低劑量的GM132(0.2nM)與低劑量的芬維A胺(0.5 nM)在48h以內可顯著誘導細胞的凋亡，這表明阻斷蛋白的活性可以促進芬維A胺誘導的凋亡。
實施例7
在芬維A胺處理的CMLCD34+細胞中氧化應激、內質網應激相關的基因表達水平增強。
芬維A胺可以特異性殺傷原始的白血病干祖細胞(實施例3與實施例 4)，同時在白血病細胞系中芬維A胺表現(xiàn)為ROS依賴性且大量氧化應激與內質網應'^t^應基因被上調(實施例5與實施例6)。因此非常有必要研究在白血病干祖細胞中芬維A胺是否表現(xiàn)為相同凋亡機制。本發(fā)明人參照經芬維處理的K562表達鐠，用熒光實時定量RT-PCR技術檢測了從CML 病人標本中分離出的CD34 +細胞在芬維A胺處理后氧化應激與內質網應激反應基因表達調變情況。如圖ll所示，用芬維A胺處理48h，CMLCD34 +細胞中，氧化應激與內質網應'^L^應基因被顯著上調，這表明這些基因可能是芬維A胺藥理學作用靶點。
實施例8
總結芬維A胺引發(fā)相關事件的動態(tài)變化關系
這里我們探討芬維A胺誘導凋亡過程相關分子事件的動態(tài)變化關系。如FIG. 12所示，細胞內ROS變化情況遠比先前認識的復雜，呈現(xiàn)向左偏的鐘形變化趨勢(圖中藍線顯示)。同預期期盼的一樣，ROS早期快速升高積聚并于6小時內達到峰值，之后緩慢下降并維持同處理前兩倍的水平。這種變化趨勢不僅是芬維A胺生物作用機制的直接反映，也是引發(fā)下游分子應'^L^應的始發(fā)信號，如兩個應激應答轉錄因子NRF2與HSF1激活并介導了各自所調控的靶基因的表達(圖中青色與深紫色顯示)。雖然這兩類應激應答基因各自表達可以認為是細胞內抵御返防結果，但是它們協(xié)調性地有序表達(NRF2被持續(xù)激活與HSF1激活相對瞬時性)對芬維A胺誘導凋亡事件A^到促進作用，如促進凋亡前CHOP信號(圖中淡紫色顯示)。
實施例9
芬維A胺與阿糖胞苷聯(lián)合用藥協(xié)同抑制AML細胞的生長。
AML白血病細胞群體包括處于靜止狀態(tài)的AML白血病干祖細胞亞群和較成熟的增殖的粒細胞亞群。利用芬維A胺殺傷白血病腫瘤干祖細胞而對正常造血干祖細胞無影響的靶向治療的優(yōu)勢，結合傳統(tǒng)的化療藥物阿糖胞苷(Ara-C)通過阻斷DNA的復制而殺傷分裂期細胞能力，聯(lián)合用藥芬維A胺與阿糖胞苷，分別靶向作用于干祖細胞亞群與較成熟粒細胞亞群，以達到克服現(xiàn)階段針對白血病的傳統(tǒng)化療耐藥和復發(fā)目的。因此，我們檢測了兩藥聯(lián)用抑制AML細胞生長增殖的情況。
協(xié)同指數(Combination Index, CI)用于評估芬維A胺與阿糖胞苷兩藥聯(lián)用在AML細胞U937中產生的生長抑制效應。協(xié)同指數的計算基于經典的isobologram公式CI = dl/Dl + d2/D2,其中Dl與D2為藥物1或藥物2單獨用藥達到一定生長抑制率(Growth Inhibition, GI)所需劑量，dl 與d2為藥物1和藥物2合用要達到相同抑制率所需的各自劑量。CK1代表兩藥協(xié)同，Ol代表兩藥拮抗，CI-1代表兩藥作用相加。如FIG. 13 所示，當生長抑制率GI大于30。/。時，CI值均小于1，這表明芬維A胺與阿糖胞苷合用顯示了協(xié)同作用。如為取得65.47%的生長抑制率，單用芬維 A胺的劑量為2.72 jiM，單用阿糖胞苷的劑量為0.091 jiM，而合用藥組兩藥的劑量分別需要芬維A胺0.05 nM，阿糖胞苷0.05 nM，大幅度地低于單用情況。該聯(lián)合用藥策略顯示了顯著的協(xié)同效應與低毒性。無疑，聯(lián)合用藥芬維A胺與阿糖胞苷協(xié)同抑制AML細胞的生長，該方案為芬維A胺聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥物的組合治療白血病提供典范。實施例10
芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥協(xié)同抑制原始CML細胞集落的形成，靶向 CML干細胞及其祖細胞，在K562細胞中協(xié)同抑制BCR - ABL激酶活性。對CML發(fā)病機制的深入認識，促使了高效靶向小分子藥物伊馬替尼 (STI571， Gleevec)的誕生。伊馬替尼可以特異性抑制BCR - ABL酪氨酸激酶的活性，在CML臨床治療上取得了巨大成功，使慢性期CML病人的完全遺傳學緩解到達近87%(例如參見Druker等，2006)。然而很多病人長期用藥后還出現(xiàn)耐藥和復發(fā)。一方面由于BCR-ABL激酶活性位點的突變影響了伊馬替尼的結合(例如參見Shah等，2002)，另一方面是因為在較為原始的CML細胞中BCR-ABL激酶活性的抑制與凋亡的關系尚不明晰。幾乎所以病人在持續(xù)服用伊馬替尼的情況下，體內仍舊有BCR-ABL P曰性的細胞殘余。這表明，只抑制BCR-ABL激酶活性，不能殺傷所有的 CML細胞，特別是CML干祖細胞(例如參見Graham等，2002)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，新的用藥方案，例如芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥，能更有效地治療CML，克服伊馬替尼聯(lián)耐藥與疾病復發(fā)。以下介紹了芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥在病人原代細胞中的合用效果，與以K562為模型兩藥協(xié)同機制的研究。
如實施例2所述，芬維A胺可以有效地抑制更為原始的CML祖細胞的集落形成。因此，本發(fā)明人進一步檢測了芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥對從38例CML病人中分離的原代CML細胞集落形成的影響(表1)。將 CML CD34+細胞分別接種于含有0.25 伊馬替尼，4 jiM芬維A胺，或兩藥合用的半固體培養(yǎng)基中，以檢測藥物對粒系集落形成單位 (CFU-GM),紅系集落形成單位(BFU-E)與混合集落形成單位(GFU-GEMM) 的生長的影響。如圖14所示，兩藥合用組與單用要組相比，顯著的抑制了 CFU-GM與BFU-E集落的形成(pO.OOl)。 GFU-GEMM被認為是更原始的細胞形成的集落，在芬維A胺處理組與兩藥合用組不能4皮檢測到。
為了檢測伊馬替尼和芬維A胺是否對CD34 +細胞亞群具有乾向作用的偏向性，本發(fā)明人用CD34與CD38抗體對這群細胞進行了細分。如圖15所示，在CML干細胞(CD34 + CD38，中，芬維A胺與合用組^i秀導的凋亡顯著高于未處理組與伊瑪替尼處理組(p〈0.001)，分別為53.3%和 42.6%。而對正常造血干細胞的毒性分成小，芬維A胺與合用組誘導的凋亡分別只有19.08%和19.48%。
綜合上述結果，本發(fā)明人可以得出芬維A胺與伊馬替尼聯(lián)合用藥在原代CML細胞中所表現(xiàn)的協(xié)同作用，這種協(xié)同作用不僅體現(xiàn)在兩種藥物藥效在同一群體細胞中的放大，更重要的是由于兩種藥物有效地作用于不同細胞群體。伊馬替尼主要作用于下游分化了的CML細胞，而芬維A胺在我們的研究中被首次發(fā)現(xiàn)主要作用于CML干細胞及其祖細胞，而對正常的造血干細胞無影響。因此該協(xié)同策略為克服CML的耐藥與復發(fā)提供了行之有效的臨床治療方案。
為了研究芬維A胺與伊瑪替尼協(xié)同的潛在分子機理，本發(fā)明人用 western技術檢測了經芬維A胺、伊瑪替尼單獨處理和兩藥合用處理的 K562細胞林中BCR畫ABL、磷酸化曙BCR-ABL、磷酸化-STAT5、酶原形式caspase 3、剪切形式caspase3和剪切形式PARP.的表達量。如圖16A 所示，各處理組對BCR-ABL蛋白表達量并無影響，而對其磷酸化活性形式作用明顯伊馬替尼對BCR-ABL磷酸化的抑制24h為50%, 48h 為85 % ,而兩藥合用組24h的抑制率為80 % ， 48h為99 % 。 STAT5的磷酸化活性也發(fā)生了相類似的改變。此外，Caspase 3與PARP在兩藥合用組發(fā)生了最多的剪切(其活性形式)。(圖16B)?？傊?，在K5"細胞系中，芬維A胺與伊馬替尼協(xié)同抑制了 BCR-ABL的活性，并協(xié)同誘導了細胞的凋亡。
實施例11
芬維A胺、阿糖胞苷與GM132三藥合用協(xié)同誘導AML細胞凋亡。
有兩個現(xiàn)象促使我們進一步研究其他聯(lián)合用藥方案。如實施例6所述蛋白酶體抑制劑可以放大芬維A胺誘導白血病細胞凋亡的效應。此外，實
34施例8所述，芬維A胺與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合用藥可以協(xié)同抑制白血病細胞的生長(見實施例9)。這里我們將展示芬維A胺、阿糖胞普與蛋白I^l 抑制劑GM132三藥合用誘導AML細胞系U937凋亡的協(xié)同效果。如圖17 所示，芬維A胺(1.5 jiM)與低劑量的阿糖胞苷(0.03 jiM)和MG132(0.2 nM) 單獨用藥在48h以內基本沒有誘導凋亡(5 o/q左右)，芬維A胺與MG132 兩藥聯(lián)用時凋亡率倍增，而三藥合用其凋亡率接近35%，該凋亡率顯著高于任意兩種藥物的組合。這表明芬維A胺、阿糖胞苷與GM132三藥合用可以顯著協(xié)同誘導AML細胞的凋亡。這里值得注意的是阿糖胞苷與 MG132的劑量都低于臨床用藥水平，這意味著降低了藥物的毒性。
實施例12
芬維A胺、伊瑪替尼與MG132三藥合用協(xié)同誘導CML細胞凋亡。在實例10中我們詳細介紹了芬維A胺與伊瑪替尼聯(lián)合用藥協(xié)同誘導CML 細胞凋亡的現(xiàn)象與機理。與實施例11相似，我們在K562細胞加入MG132 探討其是否會進一步協(xié)同芬維A胺與伊瑪替尼誘導的凋亡。如圖18所示，藥物處理48h，芬維A胺(4|iM)、伊瑪替尼(0.25 pM)和低劑量的 MG132(0.1 jiM)單獨用藥誘導的凋亡率分別為2.46 % 、 12、 08 %和2.51 % 。芬維A胺與伊瑪替尼兩藥聯(lián)用的凋亡率為21.04%，而三藥合用的凋亡率為31.66%，該凋亡率顯著高于任意兩種藥物的組合。像這樣將芬維A胺與多種抗腫瘤藥物聯(lián)用的治療方案，CML的治療提供了更廣闊的前景。
實例13
芬維A胺與防己堿協(xié)同誘導胃癌細胞凋亡。
芬維A胺主要通過作用腫瘤細胞產生內質網壓力，提高細胞內活性氧水平，從而啟動一系列通路，激活凋亡通路，同時也激活包括NF-KB在內的通路，而NF-KB調控著許多炎癥相關腫瘤的形成和t艮。在多種抗腫瘤藥物及抗炎藥物中，我們篩選出與芬維A胺聯(lián)用在誘導腫瘤細胞凋亡方面具有協(xié)同效果的藥物防己堿(Tetrandrine)。與芬維A胺不同，防己堿是中草藥粉防己中的主要有效成分，具有逆轉多重耐藥(MDR)、阻滯鉀離子通道等作用。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞中4 uM芬維A胺與4-5 jLiM防己堿可以顯著協(xié)同誘導細胞的調亡。圖19A和19B分別展示了用Rhl23/PI雙染法檢測的兩藥合用在MKN45與SGC7901細胞系中的協(xié)同作用，在MKN45細胞中，藥物處理48h ，兩藥合用誘導的凋亡顯著高于單用藥誘導的凋亡(如，4 jii M芬維A胺、5pM防己堿和兩藥合用誘導的凋亡率分別是6.2% 、 15.8%和 49.4%)同樣在SGC 7901細胞中芬維A胺與防己堿合用也顯示了明顯的協(xié) 同作用，如圖19B所示。圖19C與圖19D分別為在MKN45與SGC7卯1細胞用Annexin V/PI雙染法測定凋亡率，我們可以看到在合用組i秀導的凋亡顯著高于單用藥組。
實施例14
4-氧代-芬維A胺更為有效地誘導血清々幾餓型靜止期白血病細胞的凋亡
HL60細胞在沒有血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h,構建血清饑餓型靜止期白血病模型(見實施例1)。將血清饑餓型白血病細胞與增殖期細胞培養(yǎng)于0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基中，分別用0 - 10 fiM 4-氧代-芬維A胺分別處理24與48小時。用MTT方法檢測4-氧代-芬維A胺對增殖期與靜止期細胞的活力的影響。與芬維A胺結果相類似，較增值期白血病細胞而言，血清饑餓型靜止期細胞對4-氧代-芬維A胺更敏感(表格3)。
實施例15
4-氧代-芬維A胺特異性靶向作用于原始的AML干細胞及其祖細胞。為了驗證4-氧代-芬維A胺是否能像芬維A胺一樣特異性殺傷原始的白血病細胞，我們AML骨髓標本中分離出CD34+細胞，分別用0-10 nM 4-氧代-芬維A胺處理48h檢測其凋亡。由此獲得CD34+細胞的凋亡率。在用CD34-PE與CD38-APC抗體將CD34+細胞群體進行細分后，在CD34 + €038 +入]\11^祖細胞與CD34 + CD38 —CML干細胞中，4-氧代-芬維A胺的誘導凋亡呈劑量依賴性，與芬維A胺的結果相類似(見實施例4)。由此表明，4-氧代-芬維A胺也是非常具有前景的白血病干細胞與祖細胞耙向藥物。
C、制劑實施例芬維A胺口服制劑
膠嚢劑(1000粒，50mg/粒)_
組成_投料量
芬維A胺 50g 卵磷脂 7.5g 氬4t豆油 7.5g 蜂蠟 10g BHA(丁基羥基茴香醚) 0.25g 植物油 214.75g
制備方法將已經預熱至80°C的水、甘油、對羥基苯曱酸乙酯(用適量95%以上的藥用乙醇溶解)、明膠置濃縮鍋內，在蒸汽壓力不超過0.06 Mpa, 60士2。C的條件下，過濾，出料，備用。另在60。C以下的溫度^ 下，去芬維A胺、BHA加入適量植物油中，攪拌、混勻，再加入已過濾的蜂蠟和氫化豆油混合物，以及剩余的植物油，研磨，加入卵磷脂，攪拌、混勻。將此油料在丸制室中密封于上述備好的軟質嚢中制丸，定型，再在 26-30。C和30-35。C、相對濕度均<40%下4氐溫烘丸二次，并用石油醚洗丸l-2次后，曬丸，整理，包裝，塑封，即得。參考文獻
美國專利文獻
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權利要求
1、芬維A胺或其活性衍生物在制備用于清除或殺滅受試者腫瘤干細胞或用于治療和/或預防起源于腫瘤干細胞的腫瘤疾病的藥物中的用途。
2. 根據權利要求l的用途，其中所述起源于腫瘤千細胞的腫瘤疾病為其中清除或殺滅腫瘤干細胞有益于抑制腫瘤耐藥性產生和復發(fā)的腫瘤疾病o
3. 芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗胂瘤藥的聯(lián)合在制備同時、順次或分別施用以誘導受試者肺瘤細胞調亡的藥物中的用途。
4. 藥物組合物，其中包含治療有效量的芬維A胺或其活性衍生物，治療有效量的至少一種其它抗腫瘤藥，以及任選的藥學可接受的載體，所述至少一種其他抗胂瘤藥與芬維A胺或其活性衍生物同時、順次或分別施用以協(xié)同誘導受試者腫瘤細胞調亡。
5. —種體外篩選抗肺瘤藥的方法，所述抗腫瘤藥與所述芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合以協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡，其包括以下步驟1) 使腫瘤細胞與(a)有效量的芬維A胺或其活性衍生物和(b)待選的其它抗腫瘤藥相接觸，測定細胞的凋亡；2) 使腫瘤細胞與(a)有效量的芬維A胺或其活性衍生物相接觸，測定細胞的凋亡；3) 使腫瘤細胞與(b)待選的其它抗腫瘤藥相接觸，測定細胞的凋亡；和4) 當步驟1)中所測凋亡的程度大于步驟2)和步驟3)中所測凋亡的總和，則判定所述待選的抗腫瘤藥可以與所述芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合協(xié)同誘導腫瘤細胞凋亡。
6. 根據權利要求l-6的用途、組合物或方法，其中所述腫瘤包括造血系統(tǒng)肺瘤和實體瘤。
7. 根據權利要求6的用途，其中所述造血系統(tǒng)腫瘤選自白血病和惡性淋巴增殖性障礙。
8. 根據權利要求7的用途、組合物或方法，其中所述白血病選自急性髓細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、骨髓增生異常綜合征、急性淋巴細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病，且其中所述惡性淋巴增殖性障礙選自淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。
9. 根據權利要求8的用途、組合物或方法，其中所述淋巴瘤選自非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、以及小細胞和/或大細胞的濾泡淋巴瘤。
10. 根據權利要求6的用途、組合物或方法，其中所述實體瘤選自胃癌、肺癌、卵巢癌和神經母細胞瘤。
11. 根據權利要求3或4的用途或組合物，其中所述其它抗腫瘤藥選自細胞周期特異性的化療藥物、BCR—ABL酪氨酸激酶耙向抑制劑、蛋白酶體抑制劑和不同于前三類的常規(guī)化療藥物。
12、根據權利要求ll的用途或組合物，其中所述細胞周期特異性的化療藥物選自阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、羥基脲、6-巰基嘌呤、6-硫鳥噤呤、氟達拉濱、甲氨蝶呤，優(yōu)選阿糖胞苷。
13、根據權利要求11的用途或組合物，其中所述BCR—ABL酪氨酸激酶靶向抑制劑選自伊馬替尼、達沙替尼和尼羅替尼，優(yōu)選伊馬替尼。
14、根據權利要求ll的用途或組合物，其中所述蛋白酶體抑制劑選自 bortezomib、 BzLLLCOCHO和MG-132,優(yōu)選bortezomib。
15、根據權利要求ll的用途或組合物，其中所述常規(guī)化療藥物選自去甲氧柔紅霉素、長春新堿、多柔比星、柔紅霉素、米托蒽醌、長春花堿、長春地辛、三尖杉酯堿、依托泊苷、替尼泊苷、左旋門冬酰胺酶，優(yōu)選去甲氧柔紅霉素。
16. 根據前述權利要求之任一項的用途或組合物，其中所述芬維A胺的活性衍生物是4-氧代-芬維A胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及芬維A胺或其活性衍生物的新醫(yī)藥用途，具體涉及芬維A胺在制備用于清除或殺滅受試者腫瘤干細胞或用于治療和/或預防其中以腫瘤干細胞為病灶的腫瘤疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及芬維A胺或其活性衍生物與其它抗腫瘤藥聯(lián)合應用的新用途、包含所述芬維A胺或其活性衍生物與至少一種其它抗腫瘤藥的藥物組合物、篩選所述其它抗腫瘤藥方法、使用所述芬維A胺或其活性衍生物清除或殺滅受試者腫瘤干細胞、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的方法、以及使用所述芬維A胺或其活性衍生物聯(lián)合其它抗腫瘤藥清除或殺滅腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞和起源于腫瘤、尤其造血系統(tǒng)腫瘤干細胞的腫瘤細胞的方法。
文檔編號A61K31/167GK101623277SQ20081013765
公開日2010年1月13日申請日期2008年7月8日優(yōu)先權日2008年7月8日
發(fā)明者濟張, 海方, 潘曉玲, 王侃侃申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院;中國科學院上海生命科學研究院

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