專利名稱：：一種水蛭提取物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水蛭提取物及其制備方法與應(yīng)用。技術(shù)背景水蛭功效為破血、逐瘀、消癥。可用于癥瘕痞塊，血瘀經(jīng)閉，跌打損傷，血小板增多癥，及腦出血。水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》"主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無(wú)子，利水道。"《本草綱目》"咸走血，苦勝血。水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經(jīng)血分藥，故能通肝經(jīng)聚血。"水蛭作為一味傳統(tǒng)活血化瘀中藥，具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功能，由于水蛭抗凝作用得到肯定，以及近年來(lái)對(duì)活血化瘀治療各種疑難病的不斷深入研究，水蛭的藥用也倍受青睞。在中醫(yī)臨床上用單味水蛭或配伍復(fù)方，使用煎劑、散劑、膠囊劑和口服液等劑型，內(nèi)服給藥，治療心腦血管疾病療效顯著。然而臨床療效確切的水蛭制劑多為干燥藥材原粉制成的中成藥，如活血通脈膠囊，抗血栓片等，這類制劑由于具有水蛭藥材的腥臭味，不良反應(yīng)較多，同時(shí)由于成分復(fù)雜，不易控制藥材質(zhì)量，藥效波動(dòng)大。水蛭作為傳統(tǒng)中藥，臨床應(yīng)用很廣泛，但是有效成分并不明確，文獻(xiàn)報(bào)道其中的蛋白質(zhì)、多肽等為主要有效成分。有效成分不明確是動(dòng)物類藥材的固有的問(wèn)題，采用傳統(tǒng)的提取、濃縮工藝方法，使有些成分分解、破壞，或提取不出來(lái)，易使有效成分損失，不適宜動(dòng)物類藥材?？煽孛附獠捎脙?nèi)切肽酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，并通過(guò)控制某一參數(shù)大小，來(lái)確定水解的終點(diǎn)，以獲得盡可能多的目標(biāo)分子量的肽類物質(zhì)。通過(guò)可控酶解方法，就有可能把蛋白質(zhì)中所蘊(yùn)藏的功能區(qū)肽片段釋放出來(lái)，制備出具有各種各樣生理活性的生物活性肽。因此，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蛋白水解物和活性肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)極為活躍。近年來(lái)人們?cè)谏锘钚噪姆矫嫒〉昧撕艽筮M(jìn)展，越來(lái)越多生物活性肽被發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)，并確定了結(jié)構(gòu)。目前國(guó)內(nèi)外巳從蛋白質(zhì)水解物中分離出具有多種生理活性的生物活性肽，例如促進(jìn)鈣鐵吸收的酪蛋白磷酸肽、抗病毒肽、ACE抑制肽等，當(dāng)前己有部分活性肽實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化。因此，結(jié)合可控酶解技術(shù)研究水蛭提取物及其制備工藝，對(duì)于提高水蛭提取物的生理活性，增強(qiáng)水蛭提取物的質(zhì)量可控性，解決水蛭提取純化工藝的瓶頸問(wèn)題具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)卜-述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種采用可控酶解法制備的水蛭提取物及其制備方法，以提高水蛭提取物的質(zhì)量可控性及生理活性。本發(fā)明還提供了水蛭提取物的應(yīng)用。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種水蛭提取物的制備方法，步驟如下(1)取水蛭干燥全體粉碎成40120目粉末，加入815倍量的水，或取水蛭鮮活全體，加入15倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH至79,按每lg底物加入200020000U酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制溫度40。C6CTC，酶解212小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向上述酶解液中加入15倍體積的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1~2次，過(guò)濾，取濾液減壓回收，殘?jiān)铀芙猓⒖诪V膜過(guò)濾；(4)將上述濾液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將上述超濾液的pH調(diào)整至7.59.5，通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂,先用水或pH79、0.010.05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液或pH79、0.010.05mol/L的二乙醇胺-鹽酸緩沖液沖洗，將沖洗液棄去，然后以O(shè).12mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，脫鹽，濃縮，噴霧干燥或冷凍干燥即得到水蛭提取物。所述步驟(1)中，水蛭干燥全體粉碎成80100目粉末，加入913倍量的水；或用水蛭鮮活全體，加入24倍量的水。所述步驟(2)中，調(diào)整pH為89，按每lg底物加入500010000U蛋白酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶(當(dāng)同時(shí)加入胰蛋白酶和胰酶時(shí)，兩者之間沒(méi)有比例的限定)，控制溫度45。C55。C，酶解410小時(shí)，冷卻至室溫。所述步驟(3)中，向酶解液中加入24倍體積的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀12次，過(guò)濾，取濾液60'C以下減壓回收溶媒，殘?jiān)铀芙?，微孔濾膜過(guò)濾。所述步驟(5)中，陰離子交換樹(shù)脂是以纖維素為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂、以葡聚糖為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂或以瓊脂糖為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂中的任一種；所述用于洗脫的氯化鈉溶液為0.l~2mol/L的氯化鈉水溶液或含0.l2mol/L氯化鈉的pH79、0.010.05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液或含0.l2mol/L氯化鈉的pH79、0.010.05mol/L三乙醇胺-鹽酸緩沖液；所述脫鹽采用鈉濾法或葡聚糖凝膠法。一種水蛭提取物，是由以上制備方法制得的。所述水蛭提取物在制備具有抗凝作用藥物中的應(yīng)用。所述水蛭提取物在制備具有溶栓作用藥物中的應(yīng)用。所述水蛭提取物在制備具有抑制血小板聚集作用藥物中的應(yīng)用。所述水蛭提取物在制備具有祌經(jīng)保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從中藥現(xiàn)代化的技術(shù)要求出發(fā)，采用可控酶解技術(shù)提取水蛭中的肽類成分，結(jié)合生物制藥技術(shù)，采用超濾、凝膠層析的分離技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行純化，得到了比傳統(tǒng)水蛭提取物純度更高、活性更強(qiáng)的提取物。該方法突破了傳統(tǒng)動(dòng)物藥在提取、分離方面的瓶頸，解決了傳統(tǒng)動(dòng)物藥以原粉應(yīng)用時(shí)用量大、味道腥臭的問(wèn)題，進(jìn)一步提高了動(dòng)物藥提取物活性和質(zhì)量可控性，大大提高了藥材的利用率。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明具有以下突出的有益效果1、突破了傳統(tǒng)提取方法水蛭在傳統(tǒng)用藥中大多數(shù)情況下以原粉的形式應(yīng)用，這是因?yàn)樗蔚挠行С煞植⒉幻鞔_，文獻(xiàn)報(bào)道其中的蛋白質(zhì)、多肽、微量元素等為有效成分，采用傳統(tǒng)的提取、濃縮工藝方法，使有些成分分解、破壞，或提取不出來(lái)，易使有效成分損失，不適宜動(dòng)物類藥材。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，采用可控酶解技術(shù)，把蛋白質(zhì)內(nèi)部存在著功能區(qū)的多肽鏈打開(kāi)，把具有生物活性的肽片段釋放出來(lái)，從而可制備出具有更強(qiáng)生理活性的生物活性肽，再采用超濾、離子交換層析等生物制藥技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行純化，從而得到純度高、生物活性強(qiáng)的水蛭提取物，與傳統(tǒng)提取方法得到的提取物相比有了質(zhì)的飛躍，突破了傳統(tǒng)的提取方法。2、提高了藥材的利用率在傳統(tǒng)的臨床復(fù)方應(yīng)用中，水蛭的日用量一般為69g，而單獨(dú)使用時(shí)則日用量可達(dá)1215g。而采用可控酶解技術(shù)后，由于打開(kāi)蛋白質(zhì)內(nèi)部存在的功能區(qū)，釋放出具有生物活性的肽片段，其活性有著大幅度的提高，而有效劑量也大大降低，折合生藥材的量為23g，僅為傳統(tǒng)用量的l/3左右，大大提高藥材的利用率。3、改善了中藥的質(zhì)量:水蛭在傳統(tǒng)用藥中大多數(shù)情況下以原粉的形式應(yīng)用，由于水蛭本身的腥臭味道會(huì)引起惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，還由于動(dòng)物組織進(jìn)行滅菌時(shí)不徹底，容易導(dǎo)致微生物限度超標(biāo)。而采用本專利方法對(duì)水蛭進(jìn)行處理，經(jīng)過(guò)酶解、乙醇或/和丙酮沉淀、超濾、離子交換層析，除去了大部分的雜質(zhì)，同時(shí)也由于除去了有害的微生物和內(nèi)毒素等，制得的水蛭提取物可以作為注射制劑的原料藥，改變了傳統(tǒng)中藥"粗大黑"的形象，外在質(zhì)量顯著提高；而多種純化手段的使用，使得水蛭提取物的純度大大提高，有效物質(zhì)基本明確，水蛭提取物的質(zhì)量可控性己經(jīng)達(dá)到化學(xué)藥物的水平。中藥疔效的物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明，為中藥進(jìn)入國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)創(chuàng)造良好的生產(chǎn)條件。4、增強(qiáng)了藥品的活性中藥治療疾病作用機(jī)理較為復(fù)雜，不僅僅通過(guò)一種途徑治療缺血引起的損害，往往通過(guò)調(diào)節(jié)與之有關(guān)的各個(gè)方面，共同達(dá)到治療作用，由此所引出的問(wèn)題也較為明顯，即作用靶點(diǎn)多，作用強(qiáng)度不夠，因此在急性疾病中往往是在西藥的基礎(chǔ)上起輔助作用。水蛭也存在這樣的問(wèn)題，傳統(tǒng)的臨床應(yīng)用主要是用在心腦血管疾病的穩(wěn)定期或者恢復(fù)期，基本不能在急性期應(yīng)用。而本發(fā)明制備的水蛭提取物活性大大增強(qiáng)，在治療急性病當(dāng)中有著與化學(xué)藥相類似的治療效果，還可以注射給藥，這一點(diǎn)對(duì)急性期病人也有著重要意義。具體實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明實(shí)施例l:制備水蛭提取物，步驟如下-(1)取水蛭干燥全體粉碎成100目粉末，加入8倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH到8.5，按每lg底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度50'C，酶解6小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入2倍體積的丙酮冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液6(TC以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將超濾液的pH調(diào)整至8.0，通過(guò)QSepharose樹(shù)脂，先用水沖洗，沖洗液棄去，以lmol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，G10葡聚糖凝膠脫鹽，濃縮，冷凍干燥得到水蛭提取物。實(shí)施例2:制備水蛭提取物，步驟如下-(1)取水蛭鮮活全體，加入2.5倍量的水，勻衆(zhòng)；(2)取勻漿液，調(diào)整pH到8.5，按每lg底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶和胰酶，其中胰酶提供蛋白酶活力占總蛋白酶活力的2%，控制溫度5(TC，酶解8小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入3倍體積的乙醇冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液減壓回收至無(wú)醇味，加入2倍體積的丙酮冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液60。C以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將超濾液的pH調(diào)整至7.8，通過(guò)DEAESepharose樹(shù)脂，先用pH7.8的0.02mol/L二乙醇胺-鹽酸緩沖液沖洗，沖洗液棄去，以含0.5mol/L氯化鈉的pH7.8、0.02mol/LTris-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，G10葡聚糖凝膠脫鹽，濃縮，冷凍干燥得到水蛭提取物。實(shí)施例3:制備水蛭提取物，步驟如下(1)取水蛭鮮活全體，加入2.5倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH至8.0，按每lg底物加入10000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度5(TC，酶解4小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入3倍體積的乙醇冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液60。C以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將超濾液的pH調(diào)整至7.9，通過(guò)DE-52樹(shù)脂，先用pH7.9、0.02mol/LTris-鹽酸緩沖液沖洗，沖洗液棄去，以含lmol/L氯化鈉的PH8.0、0.02mol/L三乙醇胺-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，鈉濾脫鹽，濃縮，噴霧干燥得到水蛭提取物。實(shí)施例4:制備水蛭提取物，步驟如下(1)取水蛭干燥全體粉碎成IOO目粉末，加入15倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH至8.0，按每lg底物加入5000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度50'C，酶解6小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入2倍體積的丙酮冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液6(TC以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分(5)將超濾液的pH調(diào)整至8.8，通過(guò)QA52樹(shù)脂，先用水沖洗，沖洗液棄去，以0.5mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，G10葡聚糖凝膠脫鹽，濃縮，冷凍干燥得到水蛭提取物。實(shí)施例5:制備水蛭提取物，步驟如下(1)取水蛭鮮活全體，加入1.5倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH至8.0,按每lg底物加入8000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度50'C，酶解4小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入3倍體積的乙醇冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液60'C以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將超濾液的pH調(diào)整至8.2，通過(guò)DEAE-SephadexA50樹(shù)脂，先用pH8.0、0.01mol/LTris-鹽酸緩沖液沖洗，沖洗液棄去，以含0.4mol/L氯化鈉的pH8.0、0.03mol/L三乙醇胺-鹽酸緩沖液洗脫，收集洗脫液，鈉濾脫鹽，濃縮，噴霧干燥得到水蛭提取物。實(shí)施例6:制備水蛭提取物，步驟如下(1)取水蛭干燥全體粉碎成IOO目粉末，加入8倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH到8.5，按每lg底物加入6000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制溫度50'C，酶解7小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向酶解液中加入3倍體積的丙酮冷藏沉淀，過(guò)濾，取濾液6(TC以下減壓回收，殘?jiān)铀芙猓?.45微米微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述藥液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將超濾液的pH調(diào)整至8.5,通過(guò)QAE-SephadexA50樹(shù)脂，先用水沖洗，沖洗液棄去，以0.5mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，G10葡聚糖凝膠脫鹽，濃縮，冷凍干燥得到水蛭提取物。實(shí)驗(yàn)例l:水蛭提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用1.1試驗(yàn)材料1.1.1藥物與試劑受試藥依本發(fā)明技術(shù)方案得到的水蛭提取物。陽(yáng)性對(duì)照藥血塞通注射液，規(guī)格250mg/5ml,中國(guó)昆明興中制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)060401。試劑12500u/ml肝素注射液上海生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)060407。1.1.2動(dòng)物Wistar大鼠72只，雌雄各半，體重260-300g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)SCXK(魯)-2003004。1.1.3儀器聚乙稀管(內(nèi)經(jīng)lmm，2腿)，動(dòng)脈夾，絲線(4*、7*)，手術(shù)器械等。電子分析天平，AB204-S型，梅特勒公司產(chǎn)品。8453E型紫外分光光度計(jì)，安捷倫科技公司產(chǎn)品。1.2方法與結(jié)果1.2.1分組及給藥取Wistar大鼠72只，分為6組(即假手術(shù)組，模型組、血塞通20mg/kg組、水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg組)，每組12只，雌雄各半。各組動(dòng)物于缺血后，即刻舌靜脈給藥，6小時(shí)后再給藥一次。假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水。1.2.2實(shí)驗(yàn)方法手術(shù)過(guò)程大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，分離右頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA),結(jié)扎ECA和CCA，用靜脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端后，迅速于距ECA與ICA分叉處約0.5cm的頸總動(dòng)脈處作一切口，插入一端涂有石蠟的尼龍線(0.285mm)，插入深度為1.85士0.5mm，實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎入口處，尼龍線外留線頭至略有阻力以實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注。在缺血3小時(shí)和再灌注0.5小時(shí)內(nèi)用電燈維持大鼠肛溫在35-36°C左右。假手術(shù)與其他模型鼠一樣分離頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外靜脈，但只結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈CCA。神經(jīng)癥狀評(píng)分神經(jīng)病學(xué)檢査評(píng)分參照Z(yǔ)eaLonga5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。表1ZeaLonga5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>腦梗塞范圍測(cè)定動(dòng)物于缺血3小時(shí)再灌注21小時(shí)后斷頭，迅速置于冰盤上取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，后將大腦均勻切成5片放入盛有TTC的瓶中，并將放入37'C孵育30min，孵育后將其轉(zhuǎn)入10%福爾馬林溶液固定。非缺血部分染成玫紅色，缺血部位呈白色。腦組織固定后仔細(xì)將缺血部分分開(kāi)并稱重，按以下公式確定腦梗塞范圍-梗塞區(qū)重量腦梗塞范圍(％)=-xioo%全腦重量1.3結(jié)果上述試驗(yàn)結(jié)果用±>/表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用組間比較/檢驗(yàn)。1.3.1對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)癥狀的影響水蛭提取物對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)癥狀試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。表2水蛭提取物對(duì)缺血再灌注大鼠神經(jīng)癥狀的影響(±sd)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果顯示，假手術(shù)組動(dòng)物無(wú)行為異常改變，而模型組12只大鼠均出現(xiàn)偏癱樣癥狀，主要表現(xiàn)為不能完全伸展左側(cè)前爪、向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、向左側(cè)傾倒。水蛭提取物組20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg組在再灌注21小時(shí)后均可改善大鼠神經(jīng)癥狀，其中20mg/kg、10mg/kg組統(tǒng)計(jì)差別明顯(P〈0.01和0.05)。5mg/kg劑量組神經(jīng)癥狀有一定的改善，但未能顯示出統(tǒng)計(jì)意義。1.3.2對(duì)缺血再灌注大鼠腦梗范圍的影響對(duì)缺血再灌注大鼠腦梗范圍試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。表3水蛭提取物對(duì)缺血再灌注大鼠腦梗范圍的影響(±W)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>與模型組相比，*P<0.05，**P〈0.01。試驗(yàn)結(jié)果顯示，手術(shù)后1天，假手術(shù)組未見(jiàn)腦組織異常改變，模型組、給藥組大鼠均有不同程度梗塞灶，水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg組的大鼠梗塞程度明顯減輕，與模型組比較差異顯著(P〈0.01和0.05)。5mg/kg劑量組梗塞程度有一定的改善，但未能顯示出統(tǒng)計(jì)意義。實(shí)驗(yàn)例2:水蛭提取物對(duì)三氯化鐵誘導(dǎo)家兔頸靜脈血栓的溶栓作用2.1試驗(yàn)材料2.1.1藥物與試劑受試藥、陽(yáng)性藥同實(shí)驗(yàn)例1。試劑戊巴比妥鈉批號(hào)060402，進(jìn)口分裝，配成3%溶液備用。肝素上海生物化學(xué)制藥廠，批號(hào)050407。配制成0.5%溶液備用。生理鹽水注射液北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)0604282。三氯化鐵批號(hào)060224，北京化學(xué)試劑公司。2.1.2動(dòng)物家兔40只，體重2.0-3.0kg，雌雄兼用。2.1.3儀器Powerlab/8SP數(shù)據(jù)記錄分析儀，澳大利亞ADInstrumentPty.Ltd.產(chǎn)品。MFV-2100電磁血流量計(jì)，日本光電公司產(chǎn)品。2.2方法與結(jié)果2.2.1分組及給藥取家兔40只，分為5組，每組8只，雌雄各半。在頸靜脈血栓形成并老化30min后，靜脈注射給藥，觀察時(shí)間為給藥后120min。2.2.2方法手術(shù)過(guò)程試驗(yàn)前動(dòng)物禁食12小時(shí)，自由飲水。3W戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉動(dòng)物。動(dòng)物仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，分離出一側(cè)頸靜脈，長(zhǎng)度3cm左右，將直徑2.53.5mm的電磁流量計(jì)探頭安放在合適位置，電磁流量計(jì)探頭連接于MFV-2100電磁流量計(jì)上，記錄頸靜脈的血流量；右前肢建立靜脈通道，供給藥、補(bǔ)液和取血用。血栓模型制備在血流探頭近心端取長(zhǎng)度約lcm的血管，在此段血管內(nèi)用特制的血管鉗夾閉靜脈，使血管內(nèi)膜粗糙，每次夾閉20sec，間隔5min，重復(fù)6次。將頸靜脈的近心端和遠(yuǎn)心端用靜脈夾阻斷血流，用浸有三氯化鐵溶液的棉線繞動(dòng)物一圈，20min后去掉靜脈夾，電磁流量計(jì)讀數(shù)為零，表明頸靜脈已形成穩(wěn)定的血栓，穩(wěn)定10min后即可進(jìn)行各項(xiàng)參數(shù)的觀察和測(cè)定。手術(shù)完畢及模型成功后，將所有信號(hào)輸入po呢rlab/8SP記錄儀并經(jīng)生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)進(jìn)行連續(xù)信號(hào)采集，試驗(yàn)參數(shù)由計(jì)算機(jī)全程進(jìn)行監(jiān)控和顯示并儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)上，試驗(yàn)結(jié)束后，作脫機(jī)處理進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、打印原始記錄。檢測(cè)指標(biāo)栓塞靜脈再通的判定連續(xù)記錄頸靜脈血流量，以給藥后血流量回升達(dá)到基礎(chǔ)值的50%以上，為頸靜脈血管再通，再灌注后血流量再次降至零為再栓塞。試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以±W表示。采用配對(duì)f檢驗(yàn)比較給藥前后均數(shù)差異顯著性，非配對(duì)t檢驗(yàn)比較組間均數(shù)差異顯著性。2.3結(jié)果家兔靜脈注射水蛭提取物高、中、低組給藥劑量分別按20、10、5mg/kg計(jì)算，血塞通注射液按20mg/kg計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表4。表4水蛭提取物對(duì)栓塞頸靜脈再通率及再通時(shí)間的影響(±W)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>與陰性對(duì)照組比較"2檢驗(yàn))**P<0.05-0.01。因低劑量組再通時(shí)間動(dòng)物數(shù)只有2只，固未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。試驗(yàn)結(jié)果顯示，血栓形成后，血管外觀呈暗紅色，血栓形成段血流呈終止?fàn)顟B(tài)。生理鹽水對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中(120min)未見(jiàn)栓塞血管再通。水蛭提取物高劑量組8只動(dòng)物給藥后有8只動(dòng)物的血流量均有不同程度增加，平均血管再通時(shí)間為25.0土14.3min，再通率為100%(8/8)。水蛭提取物中、低劑量組血管再通率分別為50%和37.5%。再通時(shí)間為35.2和56.7min，血流再通時(shí)間比對(duì)照明顯縮短。血管再通率增加和血管再通時(shí)間的改變，提示該藥具有促進(jìn)纖溶活性的作用。實(shí)驗(yàn)例3:水蛭提取物溶栓作用(血清藥理)3.1試驗(yàn)材料3.1.1藥物與試劑受試藥同前。陽(yáng)性對(duì)照藥尿激酶廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，為白色粉末，l萬(wàn)單位/瓶，批號(hào)20060401。受試劑量為1萬(wàn)單位/kg。尿激酶功能為溶血栓，用于治療血栓性腦梗塞，腦血栓。3.1.2動(dòng)物Wistar大鼠50只，雄性，體重250-270g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)SCXK(魯)-2003004。3.1.3儀器SHZ-22型水浴箱振蕩器，江蘇太倉(cāng)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；電子分析天平，AB204-S型，梅特勒公司產(chǎn)品；DGG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品。3.2方法與結(jié)果3.2.1分組及給藥取Wistar大鼠50只，分為5組(即對(duì)照組、水蛭提取物20、10、5mg/kg組、尿激酶1萬(wàn)單位/kg組)，每組10只，雌雄各半。腹腔注射給藥2次，假手術(shù)組、模型組給予等量的生理鹽水(0.8ml/100g體重)。每三次給藥時(shí)腹腔注射每日劑量的一半，另一半舌下靜脈注射給藥，給藥半小時(shí)后經(jīng)頸動(dòng)脈取血。靜置半小時(shí)。2500轉(zhuǎn)/分離心，15分鐘，取血清lml備用o3.2.2方法取250g體重雄性大鼠1只，經(jīng)頸總靜脈放血至一米長(zhǎng)、直徑3mm的塑料管中，夾閉兩端，垂直放置24h后取出血塊，精密稱取約50mg的血塊，放入以備制好的lml含藥血清中，37'C水浴24h后取出血塊稱重(大于原血栓重的，按原血栓重計(jì)算)，計(jì)算相對(duì)溶栓率。相對(duì)溶栓率(％)溶前血塊濕重一溶后血塊濕重--X100%=溶前血塊濕重3.2.3結(jié)果將溶栓率進(jìn)行組間比較，進(jìn)行r檢驗(yàn)，見(jiàn)表5。表5水蛭提取物體外溶栓作用(±)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與模型組相比，**P〈0.01。結(jié)果顯示水蛭提取物高劑量組具有一定的溶栓作用，中、低劑量溶栓作用較弱。尿激酶1萬(wàn)單位/kg組亦有較強(qiáng)的溶栓作用。實(shí)驗(yàn)例4:水蛭提取物對(duì)ADP(二磷酸腺苷)所誘導(dǎo)的兔血小板聚集的影響4.1試驗(yàn)材料4.1.1藥物及試劑受試藥水蛭提取物。實(shí)驗(yàn)前以生理鹽水稀釋到0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875、0.00094mg/ml。血小板活化因子(PAF)系美國(guó)sigma公司產(chǎn)品，規(guī)格lmg、0.5mg。4.1.2動(dòng)物家兔，雄性，體重2.5-3.0kg。4.1.3儀器LG-PABER-1血小板聚集分析儀，北京世帝公司產(chǎn)品，400R低溫離心機(jī)，德國(guó)Heraeus產(chǎn)品。4.2方法與結(jié)果4.2.1分組及給藥取血后隨機(jī)分為7組，即生理鹽水對(duì)照組及水蛭提取物0.3mg/ml、0.15mg/ml、0.075mg/ml、0.0375mg/ml、0.01875mg/ml、0.0094mg/ml劑量組(試驗(yàn)主要觀察藥物不同劑量抗血小板聚集作用，固只設(shè)生理鹽水對(duì)照組，而未設(shè)陽(yáng)性藥對(duì)照組)。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12h,取血后體外給藥。4.2.2方法家兔以3%戊巴比妥納lml/kg耳緣靜脈注射麻醉，頸總靜脈取血，用3.8%枸櫞酸納溶液抗凝(體積比為1:9),以900卬m離心10min，吸出上層血漿后，再以3000rpm離心10rain制成血小板數(shù)為44.5X10/L，用比濁法測(cè)定血小板聚集率。實(shí)驗(yàn)時(shí)先取300w1PRP比濁管內(nèi)，以PPP調(diào)透光率為100,將PRP放入預(yù)溫孔中，加入ADP溶劑或藥物lOix1，37'C溫育10min，依入檢測(cè)孔中，加入ADP應(yīng)用液10ul，記錄最大聚集率。以如下公式計(jì)算抑制率。對(duì)照組最大抑制率-給藥組最大抑制率抑制率(％)=-X100%對(duì)照組最大抑制率4.2.3結(jié)果表6水蛭提取物體外給藥對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的影響(±)組別齊懂(mg/ml)動(dòng)物數(shù)(只)聚集率(％)模型組一1266.5±6.220.3129.49±2.51**水蛭0.151220.5±3.14**提0.0751230.1±4.07**取0.03751241.6±5.59物0.01881258.6±7.07組0.00941262.1土4.82與模型組相比**P〈0.01。結(jié)果表明水蛭提取物體外給藥對(duì)ADP膠原所誘導(dǎo)的家兔血小板聚集具有顯著的抑制作用，并在0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875、0.0094mg/ml范圍內(nèi)呈一定的劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)例5:水蛭提取物對(duì)MCAT大鼠凝血的影響5.1實(shí)驗(yàn)材料5.1.1藥物與試劑受試藥、陽(yáng)性藥同試驗(yàn)例l。試劑PT、APTT為武漢中太生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，。5.1.2動(dòng)物Wistar大鼠72只，雄性，體重190210g,由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào):SCXK(魯)-2003004。5.1.3儀器STA-R全自動(dòng)血凝儀，法國(guó)DignosticaStago公司產(chǎn)品。400R低溫離心機(jī)，德國(guó)Heraeus產(chǎn)品。5.2方法與結(jié)果5.2.1分組與給藥取Wistar大鼠72只，分為6組(即假手術(shù)組、MCAT模型組、水蛭提取物20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg組、血塞通注射液20mg/kg組)，每組12只，雌雄各半。造模前預(yù)防腹腔注射給藥，每天一次，共兩天；造模后給藥一次。5.2.2方法大鼠腹腔注射3y。異戊巴比妥0.1ml/100g麻醉。大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和耳道連線中點(diǎn)作一弧形切口，長(zhǎng)約1.5cm，夾斷顳肌并切除，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨和顳骨接合處靠近口側(cè)lmm處作一直徑2.5ram骨窗，清理殘?jiān)?，暴露大腦中動(dòng)脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。置一小片塑料薄膜保護(hù)血管周圍組織。將吸有50%三氯化鐵溶液的小片定量濾紙敷在此段大腦中動(dòng)脈上，30min后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠詞養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠除不滴加三氯化鐵溶液外，其余手術(shù)步驟同模型組。于末次給藥后4h頸總靜脈放血，以3.8W枸櫞酸納(V/V為l:9)抗凝，以1500rpm離心10min，在全自動(dòng)血凝儀上分別測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)和部分凝血活酶時(shí)間(APTT)值。5.2.3結(jié)果水蛭提取物對(duì)MCAT大鼠凝血的影響結(jié)果組間比較，進(jìn)行f檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。表7水蛭提取物對(duì)MCAT大鼠凝血的影響(±W)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>與模型組相比，*P〈0.05，**P〈0.01。結(jié)果顯示，水蛭提取物各個(gè)劑量組均能延長(zhǎng)MCAT大鼠的APTT，而對(duì)MCAT大鼠的PT只有水蛭提取物高劑量組顯示出較好的作用。本發(fā)明個(gè)技術(shù)方案所制得的水蛭提取物均可以達(dá)到以上效果。綜上所述，本發(fā)明的水蛭提取物具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集及神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)研制具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集或神經(jīng)保護(hù)作用的藥物具有一定的指導(dǎo)意義。權(quán)利要求1.一種水蛭提取物的制備方法，其特征在于步驟如下(1)取水蛭干燥全體粉碎成40～120目粉末，加入8～15倍量的水，或取水蛭鮮活全體，加入1～5倍量的水，勻漿；(2)取勻漿液，調(diào)整pH至7～9，按每1g底物加入2000～20000U酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制溫度40℃～60℃，酶解2～12小時(shí)，冷卻至室溫；(3)向上述酶解液中加入1～5倍體積的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀1～2次，過(guò)濾，取濾液減壓回收，殘?jiān)铀芙?，微孔濾膜過(guò)濾；(4)將上述濾液通過(guò)分子截留量為5000Da的超濾膜，收集分子量小于5000Da的部分；(5)將上述超濾液的pH調(diào)整至7.5～9.5，通過(guò)陰離子交換樹(shù)脂，先用水或pH7～9、0.01～0.05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液或pH7～9、0.01～0.05mol/L的二乙醇胺-鹽酸緩沖液沖洗，將沖洗液棄去，然后以0.1～2mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集洗脫液，脫鹽，濃縮，噴霧干燥或冷凍干燥即得到水蛭提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(1)為取水蛭干燥全體粉碎成80100目粉末，加入913倍量的水；或用水蛭鮮活全體，加入24倍量的水。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(2)為取勻漿液，調(diào)整pH為89，按每lg底物加入500010000U蛋白酶的比例加入胰蛋白酶或/和胰酶，控制溫度45。C55。C，酶解410小時(shí)，冷卻至室溫。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)為向酶解液中加入24倍體積的乙醇或/和丙酮冷藏沉淀l2次，過(guò)濾，取濾液60'C以下減壓回收溶媒，殘?jiān)铀芙?，微孔濾膜過(guò)濾。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭提取物的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中，陰離子交換樹(shù)脂是以纖維素為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂、以葡聚糖為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂或以瓊脂糖為基質(zhì)的陰離子交換樹(shù)脂中的任一種；所述用于洗脫的氯化鈉溶液為0.12mol/L的氯化鈉水溶液或含0.12mol/L氯化鈉的pH79、0.010.05mol/L的Tris-鹽酸緩沖液或含O.12mol/L氯化鈉的pH79、0.010.05mol/L三乙醇胺-鹽酸緩沖液；所述脫鹽采用鈉濾法或葡聚糖凝膠法。6.—種水蛭提取物，其特征在于所述水蛭提取物是以權(quán)利要求l所述方法制得的。7.權(quán)利要求6所述水蛭提取物在制備具有抗凝作用藥物中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求6所述水蛭提取物在制備具有溶栓作用藥物中的應(yīng)用。9.權(quán)利要求6所述水蛭提取物在制備具有抑制血小板聚集作用藥物中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求6所述水蛭提取物在制備具有神經(jīng)保護(hù)作用藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種水蛭提取物的制備方法將水蛭加水勻漿后，經(jīng)可控酶解、有機(jī)溶劑沉淀、超濾、陰離子交換層析制得水蛭提取物。該水蛭提取物可用于制備具有抗凝作用、溶栓作用、抑制血小板聚集作用及神經(jīng)保護(hù)作用的藥物。本發(fā)明從中藥現(xiàn)代化的技術(shù)要求出發(fā)，采用可控酶解技術(shù)提取水蛭中的肽類成分，結(jié)合生物制藥技術(shù)，采用超濾、凝膠層析的分離技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行純化，得到了比傳統(tǒng)水蛭提取物純度更高、活性更強(qiáng)的提取物。該方法突破了傳統(tǒng)動(dòng)物藥在提取、分離方面的瓶頸，解決了傳統(tǒng)動(dòng)物藥以原粉應(yīng)用時(shí)用量大、味道腥臭的問(wèn)題，進(jìn)一步提高了動(dòng)物藥提取物活性和質(zhì)量可控性，大大提高了藥材的利用率。文檔編號(hào)A61K35/62GK101332211SQ20081013893公開(kāi)日2008年12月31日申請(qǐng)日期2008年8月6日優(yōu)先權(quán)日2008年8月6日發(fā)明者吉愛(ài)國(guó),浩梁,武建卓申請(qǐng)人:山東大學(xué)