專利名稱：：抑制人dmt1蛋白的rna、重組體及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學、生物醫(yī)藥及基因工程
技術領域：
，具體涉及利用逆轉錄病毒(Retrovirus)介導的RNA干擾技術，構建針對人二價金屬離子轉運蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1)基因的逆轉錄病毒干擾體系Retro-DMTli，并將其運用到鐵代謝相關疾病的藥物開發(fā)制備當中。
背景技術：
：RNAi指的是當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導致基因表達沉默的現(xiàn)象。RNA干擾過程主要有2個步驟(1)長雙鏈RNA被細胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(2)小干擾性RNA與細胞源性的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),該復合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。1998年，安德魯々去厄(AndrewZ.Fire)等在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中進行反義RNA抑制實驗時發(fā)現(xiàn)，作為對照加入的雙鏈RNA相比正鏈或反鏈RNA顯示出了更強的抑制效果(Fireetal.,1998)。從與靶mRNA的摩爾比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強于理論上1:1配對時的抑制效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應并且有某種酶活性參與其中。隨后，又相繼發(fā)現(xiàn)具有RNaseIII活性的Dicer可將長的雙鏈RNA加工成稱之為siRNA(smallinterferingRNA)的2123nt及3'端突出的短的雙鏈RNA，siRNA與若干個蛋白組成稱之為RISC復合物(RNA-inducedsilencingcomplex)的RNA蛋白復合物，并由該復合物主導RNAi效應。2001年，Tuschl等將短的siRNA導入到哺乳動物細胞中并由此解決了在哺乳細胞內(nèi)導入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應，由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景。RNAi機制普遍存在于生物種中，因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制。一種假說為，RNAi機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。目前發(fā)現(xiàn)，RNAi機制中的相關一些因子如內(nèi)源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調控，其范圍已經(jīng)超越了PTGS(posttranscriptionalgenesilencing),如RNAi機帝lJ同樣參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。2006年，安德魯，法厄與克雷格，梅洛(CmigC.Mdlo)由于在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生理及醫(yī)學獎。由外界導入的長的雙鏈RNA首先被稱作Dicer并具有RNaseIII活性的RNA酶切割成21~23堿基對的小的雙鏈RNA，這種RNA被稱作smallinterferingRNA(siRNA)，其特征是3'端相對于互補鏈突出兩個堿基。完成上述過程后，siRNA上結合RNAi蛋白因子，并形成稱為RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)的RNA-蛋白復合物。在RISC復合物中，siRNA依賴于ATP/或ATP非依賴性的轉換為單鏈，進而RISC被活化。活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(guidestrand),序列特異性地結合在標靶mRNA上并切斷標靶mRNA，引發(fā)靶mRNA的特異性分解。迄今為止已鑒定出包括Dicer在內(nèi)的若干個與RNAi有關的蛋白因子。在果蠅(Drosophilamelanogaster)RISC中，已知存在著稱為Argonaute2(AG02)的因子，AG02蛋白的表達受到抑制時，RNAi效應缺失，也就是說AG02是果蠅RNAi機制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(sliceractivity),RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主導。另外，幾個RNA解旋酶(RNAhelicase)也被鑒定為參與RNAi機制的因子。在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的RNAi中必須的因子有EGOl，這是一種RdRP(RNA-dependentRNAPolymerase),植物屮也存在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標靶mRNA作為模板，以導入的dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA，在細胞內(nèi)針對于標靶mRNA合成新siRNA的酶。這一反應在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機制的基本框架雖然相同，但存在著微妙差異。RNAi在基因沉默方面的具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標基因(或疾病基因)的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這功能丟失(LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得(GOF)方法更具優(yōu)勢。因此,RNAi在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在耙標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。在藥物靶標發(fā)現(xiàn)和確認方面，RNAi技術已獲得了廣泛的應用。生物技術公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然后通過觀察細胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的腫瘤細胞生長來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。一旦所發(fā)現(xiàn)的基因屬于可用藥的靶標(如表達的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外)，就可以針對此靶標進行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標還可用RNAi技術在細胞水平或動物體內(nèi)進一步確認。在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化。然而要將RNA干擾技術運用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達效率等重要問題。shRNA即短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA)。在RNAi感染過程中，產(chǎn)生dsRNA的一個有效方法就是在體內(nèi)表達一個短發(fā)夾RNA，這種shRNA包含兩個短反向重復序列(其中一個與目的基因互補)，中間由一個loop序列分隔，組成發(fā)夾結構。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，從而降解目的基因抑制其表達。人二價金屬離子轉運蛋白(Divalentmetaltransporter-1，DMT1)在人體組織分布十分廣泛。RNA印跡分析顯示DMT1在近端小腸表達最高,在腎、胸腺和腦有中等度的表達，而在睪丸、肝、結腸、心臟、脾、骨骼肌、肺、骨髓的含量相對較低。在細胞水平，DMT1特異地表達于某些細胞.在小腸，DMT1僅表達于小腸絨毛的腸上皮細胞，尤其在隱窩和絨毛較低部位含量最高，并從近端到遠端表達呈逐漸減低，這種表達方式與小腸鐵吸收的解剖位置一致。在腦內(nèi)，DMT1主要發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元上.然而，大多數(shù)的神經(jīng)元表達DMT1的水平相對較低。原位雜交確定DMT1mRNA在不同組織定位的研究顯示，DMT1mRNA存在于神經(jīng)元及脈絡叢上皮細胞，而同區(qū)的膠質細胞和室管膜細胞卻不表達。在密集排列的細胞群，如海馬錐體和顆粒細胞、小腦顆粒細胞、視上核和梨狀皮層的錐體細胞,DMTlmRNA的表達相對較顯著。在黑質,DMTlmRNA表達中等，在嗅核前部腹側區(qū)，則含有大量的DMTlmRNA。DMTl有高度的疏水性，其氨基端和羧基端都嵌入胞槳內(nèi)。第四跨膜區(qū)是其重要的功能區(qū)，如發(fā)生突變，將會嚴重干擾DMT1的正常功能。人類DMT1的基因組成已比較清楚.它包括17個外顯子，由36kb核苷酸組成。DMT1mRNA存在兩種形式，即"+IRE"和"-IRE"型。"+IRE"型的3'非翻譯區(qū)含有與運鐵蛋白受體(transferrinreceptor,TfR)mRNA的3'非翻譯區(qū)相似的鐵調節(jié)元件(ironregulatoryelement,IRE)。"-IRE"型則不包含有IRE結構."+IRE"型和"-IRE"型DMT1編碼分別為561個和568個氨基酸(一)DMT1在外周的功能DMT1是哺乳動物細胞攝取二價鐵的主要蛋白。近端小腸(十—指腸和空腸)是鐵吸收的主要部位。鐵在小腸的吸收通過兩個轉運過程，即粘膜吸收過程(鐵進入腸吸收上皮細胞)和粘膜轉運過程(鐵從腸上皮細胞的基底側轉運入血液循環(huán))。其中粘膜吸收過程被認為是機體維持鐵平衡的最關鍵一步，但其機制一直不明。DMT1在小腸上皮細胞上的發(fā)現(xiàn)，才使這一問題的研究有了重大突破?，F(xiàn)在知道，腸腔內(nèi)鐵主要是以二價的形式經(jīng)小腸上皮細胞膜上的DMT1介導，由腸腔進入上皮細胞內(nèi)。然后，再經(jīng)新近發(fā)現(xiàn)的Ferroportin1介導由細胞內(nèi)進入血液循環(huán)。DMT1介導的二價鐵離子的轉運是H+依賴的主動轉運過程。在患有嚴重缺鐵性貧血(microcyticanemia,mk)的小鼠和Begrade大鼠都存在相同的DMT1基因G185R位點的突變。他們均表現(xiàn)為小腸鐵吸收障礙導致的鐵嚴重缺乏的小細胞、低色素性貧血.此外，實驗顯示，機體的鐵狀態(tài)與小腸DMT1的表達緊密相關.當鐵缺乏時，十二指腸細胞上DMT1的表達增加，而在高鐵狀態(tài)鼠的小腸,DMT1表達則明顯下降。這些結果均顯示DMT1是介導小腸鐵吸收的重要轉運蛋白。(二)DMT1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用用位點克隆方法發(fā)現(xiàn)mk小鼠和Begrade大鼠都有DMTl的基因突變，原有甘氨酸(G185R)被精氨酸替代。因此DMTl的基因突變被認為是導致mk小鼠和Begrade大鼠的鐵吸收障礙，以及Begrade大鼠細胞內(nèi)鐵釋放利用障礙的原因。遺傳性血色素沉積癥(hereditaryhemochromatosis,HH)是盛行于北歐的一種常染色體隱性遺傳病.它的特征是鐵廣泛沉積在體內(nèi)多個組織,如肝臟、心臟等，導致這些組織的纖維變性、壞死，最終因器官的衰竭而死亡?，F(xiàn)已清楚，這種疾病重要原因之一是由一種HFE(hemochromatosisgene)突變(C282Y)所引起.最近的研究顯示HH病人的十二指腸DMT1mRNA表達明顯增加.在HFE基因敲除的小鼠，DMT1表達顯著高于對照.在不存在HFE基因突變的HH的散發(fā)病例中，DMT1的表達也有增加。因此認為在HH病人小腸DMT1的表達異常增加可導致鐵過度吸收，造成鐵在組織細胞發(fā)生沉積。大腦需要鐵，腦鐵缺乏可以導致腦發(fā)育不良和智力障礙。然而鐵在腦內(nèi)過多沉積則可引發(fā)一系列病理反應，進而損害神經(jīng)細胞，最終導致各種腦疾病發(fā)生，如各種神經(jīng)退行性疾病(NDs),包括帕金森氏綜合癥(PD),阿爾茨默綜合癥等等。新近研究顯示腦鐵異常增高的原因可能是由於某些腦內(nèi)鐵轉運蛋白表達失控。DMT1表達失控引起的腦內(nèi)鐵代謝紊亂可能也與某些NDs發(fā)生發(fā)展有關。DMT1分布在腦內(nèi)的許多區(qū)域。含鐵豐富的黑質冇較高的DMT1存在，需要大量鐵供給生長的細胞中DMT1也有高密度表達。腦內(nèi)也存在兩種形式的DMT1mRNA."+IRE"與"-IRE"型的比率高於除小腸以外的其他組織.Roth等用大鼠的PC12細胞研究了這兩種形式在神經(jīng)細胞的分布和功能。結果發(fā)現(xiàn)"+IRE"型DMT1主要分布在細胞表面，樹突或軸突的運輸小泡以及細胞內(nèi)含Tf游離鐵的內(nèi)吞小體上."-IRE"型則主要分布在細胞核。這一發(fā)現(xiàn)顯示"+IRE"可能主要發(fā)揮細胞攝取鐵和胞內(nèi)轉運鐵的功能，而"-IRE"型可能起有俘獲核內(nèi)二價金屬并轉運二價金屬進入細胞核以及傳遞信號到細胞核和保持核內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)的作用。已有報道在PD病人腦內(nèi)黑質神經(jīng)元DMT1有過高表達。而以往的病理研究顯示黑質是PD病人鐵異常過度沉積區(qū)域.因此一些研究者推測DMT1表達失控可能是引發(fā)某些NDs腦內(nèi)鐵過多沉積的眾多原因之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術的上述問題，提供-一種能夠有效抑制體內(nèi)人二價金屬離子轉運蛋白表達、從而調節(jié)體內(nèi)鐵水平的RNA。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述RNA的DNA。本發(fā)明的再一目的在于提供具有優(yōu)良的靶向性、安全性以及持續(xù)表達上述RNA、進而抑制人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)表達的重組體。本發(fā)明的再一目的在于提供上述RNA、DNA以及重組體在制備藥物方面的應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案本發(fā)明公開了一種人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)表達的RNA，所述RNA含有以下序列SeqIDNo,1:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'在本發(fā)明的具體實施方式中，所述RNA為含有以下雙鏈結構的siRNA:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'3，-GAUGGACCUAGGUCCUUUA-5'優(yōu)選地，所述siRNA具有以下結構5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU口CD-3'3，-口口GAUGGACCUAGGUCCUUUA-5'其中口口為3'端的兩個突出堿基，可以為AA或UU，或本領域技術人員所熟知的其他形式?；蛘?，在本發(fā)明另外的實施方式中，所述RNA為同時含有SeqIDNo.1以及SeqIDNo.l的反向重復序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)。所述shRNA優(yōu)選含有以下序列S叫IDNo.2:CAGGUAG-3'本發(fā)明還公開了編碼所述RNA的DNA。優(yōu)選的，所述DNA含有序列表中SeqIDNo.3和/或SeqIDNo.4所示的序列。本發(fā)明還公開了一種人二價金屬離子轉運蛋白的重組體，所述重組體含有上述的DNA以及基因轉移載體。所述基因轉移載體優(yōu)選為病毒性載體，更優(yōu)選為逆轉錄病毒載體。本發(fā)明進一步公開了上述RNA、上述DNA以及上述重組體在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。所述鐵代謝紊亂疾病是指血清鐵水平高而導致的鐵代謝紊亂疾病，或者是指人DMT1過量表達而導致的鐵代謝紊亂疾病。由于采用了以上技術方案，使本發(fā)明具備了以下有益效果本發(fā)明的RNA，特別是siRNA及shRNA，以及編碼shRNA的DNA以及重組慢病毒能夠有效抑制體內(nèi)人二價金屬離子轉運蛋白表達、抑制鐵的吸收與代謝，并降低體內(nèi)的血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。本發(fā)明設計的shRNA經(jīng)過體內(nèi)以及體外實驗證明，能有效的抑制DMT1的表達，有效的調節(jié)血清鐵的水平。圖1是本發(fā)明所用的Retrovirus逆轉錄病毒載體的多克隆位點圖；圖2是Retro-DMTli系統(tǒng)感染體細胞后，DMT1蛋白的表達情況圖；圖3是通過高鐵飼料詞養(yǎng)SD大鼠，構建高血清鐵動物模型，然后利用Retrovirus-DMTli系統(tǒng)進行體內(nèi)實驗，降低血清鐵水平結果圖。具體實施例方式本發(fā)明利用鐵代謝相關疾病的發(fā)病機理，有針對性的調節(jié)DMT1的表達，設計特定的小干擾性RNA以及編碼shRNA的DNA，從而降低血清鐵對于細胞的損害。本發(fā)明的小干擾性RNA以及DNA所編碼的shRNA，能特異性的識別序列CTACCTGGATCCAGGAAAT，該序列位于DMT1(NM_000617.1)第249-267堿基處。要將RNA干擾技術運用于臨床治療，就需要解決RNA干擾片段表達持續(xù)以及表達效率等重要問題。我們利用失活逆轉錄病毒載體攜帶RNA干擾片段的DNA模板，其在體內(nèi)轉錄成shRNA，完美的解決了RNA干擾基因治療的靶向性、安全性以及表達持續(xù)性的問題。本發(fā)明采用逆轉錄病毒作為基因轉移載體，逆轉錄病毒載體具有廣泛的宿主細胞以及高的轉導效率和持續(xù)且可控制的基因表達等特點，是一種非常適合用于生物藥品開發(fā)的優(yōu)良基因轉移載體。通常而言，基因轉移載體可分兩大類病毒性載體和非病毒性載體。非病毒性載體的方法包括裸DNA注射、基因槍法、多聚賴氨酸或陽離子脂質體包裹DNA法等。一般非病毒性載體毒性成分少，且較安全。但它們存在共同的弱點效率低且攜帶基因表達時間短。所以目前研究仍是一些病毒性載體，如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒等。逆轉錄病毒應用最早，研究也相當成熟，目前仍被廣泛應用。逆轉錄病毒的許多特點使其成為基因轉移載體的上佳選擇。最重要的一點是它可以有效的整合入靶細胞基因組并穩(wěn)定持久地表達所帶的外源基因。病毒基因組以轉座的方式整合，其基因組不會發(fā)生重排，因此所攜帶的外源基因也不會改變。而另幾種整合載體——例如腺相關病毒，以同源重組的方式整合，整合過程中病毒基因組發(fā)生重排，可能會影響到外源基因的結構與功能。因此，如果能實現(xiàn)有效的基因轉移，基因治療在對付遺傳性疾病、減緩腫瘤發(fā)展、戰(zhàn)勝病毒性感染和終止神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等方面都會有廣闊的應用前景。本發(fā)明通過合成干擾片段，.將片段連接至Retrovirus逆轉錄病毒載體當中。轉染重組體入Phoenix細胞，獲取病毒上清，體外以及體內(nèi)實驗證明能夠有效抑制DMT1。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，構建了人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)的逆轉錄病毒干擾體系(Retro-DMTli)，并取得了良好的抑制效果。下面通過具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例l根據(jù)人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)序列(NM—000617.1)，設計模板鏈與編碼鏈。分別于5'端加上BglII與Xhol酶切位點，送Invitrogen公司合成序列。經(jīng)過篩選，獲得干擾效果最為顯著的本發(fā)明的DMT1干擾片斷序列如下模板鏈(S叫IDNo.3):5，-GATCCCCCTACCTGGATCCAGGAAATTTCAAGAGAATTTCCTGGATCCAGGTAGTTTTTTA-3,編碼鏈(SeqlDNo.4):5，-AGCTTAAAAACTACCTGGATCCAGGAAATTCTCTTGAAATTTCCTGGATCCAGGTAGGGG-3,實施例2Retro-DMTli系統(tǒng)構建一、將合成的DMT1干擾片段(SeqlDNo.3及SeqlDNo.4)進行退火。具體步驟如下1.建立退火系統(tǒng)5ul10x退火buffer2nmole模板鏈SeqIDNo.32nmole編碼鏈SeqIDNo.4用三蒸水補足至50ul。2.放入PCR儀，95°C5分鐘，75°C5分鐘，55°C5分鐘，42°C5分鐘，37°C15分鐘，之后逐步遞減溫度至室溫。3.制12%1xTAE聚丙烯酰胺膠，取10ul上述退火產(chǎn)物跑膠200Vlh。銀染觀察退火條帶。置于-8(TC保存退火產(chǎn)物。三、酶切(XbaI與XhoI)逆轉錄病毒載體(圖l所示)，膠純化回收后，用T4連接酶與退火產(chǎn)物室溫連接24小時，經(jīng)轉化篩選之后，獲得正確克隆。送Invitrogen公司測序鑒定，命名為Retro-DMTli系統(tǒng)。具體操作步驟如下1.構建質粒酶切體系BglII而Xhol歸10xBuffer5ulBSA0.5ulpSUPER.Retro質茅立10ul用水補足50ul，37°C，2h。3.利用試劑盒(iiwitrogen)膠純化上述酶切產(chǎn)物。4.構建連接系統(tǒng)10xBuffer2ulT4連接酶lulRetro酶切產(chǎn)物lul退火產(chǎn)物5ul用水補足20ul，16°C，16h。4.取5ul連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞，涂板后，氨芐青霉素篩選。5.挑取陽性克隆，小量擴增質粒。6.用EcoRI與XhoI酶切鑒定質粒，選擇陽性結果質粒，測序保存。實施例3重組逆轉錄病毒Retro-DMTli的生產(chǎn)流程1、接種Phoenix細胞1.5乂107個細胞于9cm培養(yǎng)皿(Corning)中，37°C,5。/。C02培養(yǎng)過夜；2、轉染前20分鐘換新鮮培養(yǎng)基；3、取20ul上述Retro-DMTli與DMEM培養(yǎng)基500ul混勻，標記為A管，另取20ul脂質體與500ulDMEM培養(yǎng)基混勻，標記為B管。將A管與B管混勻，室溫放置30min，將混合物輕輕加入第1歩中的9cm培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；5、24小時后加7.5ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時；6、收集細胞上清并用0.45um濾器過濾，細胞可以擴大培養(yǎng)，持續(xù)收取病毒上清。7、測定病毒上清滴度，用PH8.0Tris-HCl調整細胞滴度至1000VP/ml。8、包裝入2ml西林瓶中(每瓶含lml)，保存于-8(TC。9、對病毒進行熱源檢測、微生物檢測，確保無熱源，無細菌、真菌、野生病毒污染。實施例4重組逆轉錄病毒Retro-DMTli體外實驗復蘇神經(jīng)元細胞株P12，接種于6孔板，每孔1X106個。取Retro-DMTli慢病毒液，按照每毫升培養(yǎng)基加lul病毒液(1000VP/ml)的比例加入P12細胞培養(yǎng)基中，輕輕左右混勻，以充分感染細胞株，分別處理0h、6h、12h、24h、48h，收集細胞，利用real-timePCR技術進行定量測定DMT1mRNA表達情況，以0h為對照組，可見DMT1的表達在12h之后受到明顯的抑制。如圖2。實施例5重組逆轉錄病毒Retro-DMTli體內(nèi)實驗選擇3月齡SD大鼠雄雌各10只，按性別隨機分為兩組，兩組實驗鼠均以高鐵飼料(購自SIGMA)喂養(yǎng)3個月，構建高血清鐵大鼠模型，并測定血清鐵濃度。之后，實驗組注射retro-DMTli病毒液，每次劑量為500ul病毒液(1000VP/ml)，每3天注射一次，3次為一療程；對照組注射PBS等滲鹽水；一療程結束后，分別于3、6、9、12、15、18天抽取血清，按常規(guī)方法利用血清生化儀測定血清鐵濃度。結果發(fā)現(xiàn)，從第6天開始，病毒組血清鐵濃度開始下降，12天達到正常血清鐵水平。如圖3。以上內(nèi)容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一歩詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>〈400〉3gatccccctacctggatccaggaaatttcaagagaatttcctggatccaggtagtttttt6061〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉460DNA人工序列〈400>4agcttaaaaactacctggatccaggaaattctcttgaaatttcctggatccaggtagggg60權利要求1、一種抑制人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)表達的RNA，其特征在于所述RNA含有以下序列SeqIDNo.15’-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3’。2、根據(jù)權利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為含有以下雙鏈結構的siRNA:5，-CUACCUGGAUCCAGGAAAU-3'3，-GAUGGACCUAGGUCCUUUA陽5'。3、根據(jù)權利要求1所述的RNA，其特征在于所述RNA為同時含有SeqIDNo.l及其反向重復序列的shRNA。4、根據(jù)權利要求3所述的RNA，其特征在于，所述shRNA含有以下序列SeqIDNo.2:CAGGUAG-3，。5、編碼權利要求14任意一項所述RNA的DNA。6、根據(jù)權利要求5所述的DNA，其特征在于所述DNA含有序列表中SeqIDNo.3禾口/或SeqIDNo.4所示的序列。7、一種抑制人二價金屬離子轉運蛋白表達的重組體，其特征在于所述重組體含有權利要求5或6所述的DNA以及基因轉移載體。8、根據(jù)權利要求7所述的重組體，其特征在于所述基因轉移載體為逆轉錄病毒載體。9、權利要求14任意一項所述的RNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。10、權利要求5或6項所述的DNA在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。11、權利要求7或8所述的重組體在制備用于治療鐵代謝紊亂疾病的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種抑制人二價金屬離子轉運蛋白(DMT1)表達的小干擾性RNA。本發(fā)明進一步公開了編碼所述小干擾性RNA的相應shRNA的DNA以及能表達所述RNA的重組體。本發(fā)明的小干擾性RNA、DNA以及重組體能夠有效抑制體內(nèi)人二價金屬離子轉運蛋白表達、抑制鐵的吸收與代謝，降低體內(nèi)的血清鐵水平，從而達到治療鐵代謝相關疾病的目的。文檔編號A61K48/00GK101538569SQ20081014191公開日2009年9月23日申請日期2008年8月19日優(yōu)先權日2008年8月19日發(fā)明者亞柯,葛嘯虎,錢忠明申請人:香港理工大學深圳研究院