專利名稱：一種具有低抗血凝性肝素－紫杉醇抗癌藥物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有低抗血凝性能和強抗癌性能的化學鍵合型抗癌藥物。
背景技術：
紫杉醇是六十年代美國化學家從紅豆杉中提取出來的具有獨特抗癌活性的 藥物，治療乳腺癌，卵巢癌等非常有效，近年來十分廣泛地應用于臨床研究，但 是由于其溶解性極差等原因，限制了它的應用范圍。我國的云南、陜西、黑龍江 等地培植了大片的紅豆杉林，具有豐富的天然資源，研究以紫杉醇為活性成分的 納米抗癌靶向藥物，有利于我國天然資源的利用，為我國深度開發(fā)紫杉醇提供了 新的途徑?；瘜W鍵合型納米靶向抗癌藥物系統(tǒng)，就是通過化學鍵合的方式將藥物 包裹在可降解載體中，制備成納米量級，利用受體介導系統(tǒng)直接將藥物載入腫瘤 區(qū)域，提高靶向性，同時又可大大提高藥物在患部的相對濃度。由于載藥納米微 粒較小，比表面積大，對受體組織的黏附性大，給藥后滯留性及與組織的接觸時 間，接觸面積大為增加，從而提高藥物的生物利用度，降低毒性，減少藥劑量， 對納米抗癌靶向藥物系統(tǒng)的研究具有深遠意義。雖然肝素的應用對癌癥病人的治 療有一定好處，但是由于肝素本身高抗凝性質(zhì)會限制其在臨床中的應用，因此在 肝素應用于臨床抗凝劑的應用是需要進行化學修飾的，通過對藥物輸送系統(tǒng)的抗 凝性質(zhì)進行評價，說明制備的藥物輸送系統(tǒng)具有較好的安全性，能夠避免在注射 過程中載體引起的流血不止的情況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以肝素衍生物為載體制備出肝素一紫杉醇抗癌
藥物，該肝素一紫杉醇抗癌藥物輸送系統(tǒng)不但提高紫杉醇藥物的溶解性，同時相
比肝素而言，該系統(tǒng)的抗血凝性能大為降低，并且相比單一紫杉醇藥物，其抗癌
性能也有較大提高。
本發(fā)明的目的是通過下述方式實現(xiàn)的。
本發(fā)明采用肝素衍生物負載紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物為 氧乙酰化肝素，結構如式I所示，其中-
X為H或S(V基團, Y為H、 S(V或COCH3基團， n為1-17，
其中氧乙?；然既眶然?0-85%。 紫杉醇衍生物為氨基酸改性紫杉醇，其結構如式II所示
a AcCX,9 OH C6H5OCHN, q> *〃 畫
C6H5 T O'
H2N—HC—C—(5 Hc(1 I II R O
式n
其中
R為CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2或CH2C6H5基團。
所述的氨基酸為纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。 紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量為藥物總重量的15-30%。
肝素衍生物通過化學鍵合方式與紫杉醇形成酯鍵或與紫杉醇衍生物形成酰胺鍵。 本發(fā)明以肝素衍生物負載紫杉醇抗癌藥物并研究其抗血凝性能。肝素衍生物 通過肝素鈉的酯化反應制備得來；紫杉醇抗癌藥物可以是紫杉醇或紫杉醇衍生 物，紫杉醇衍生物通過氨基酸與紫杉醇反應制備得來，其中適宜優(yōu)選的的氨基酸 為纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。肝素一紫杉醇抗癌藥物通過肝素衍生物與紫杉醇 或紫杉醇衍生物通過化學鍵合方式形成酯鍵或酰胺鍵制備得來，本發(fā)明的藥物用
于對正常人的血的抗凝性能和對MCF-7乳腺癌細胞抑制性能評價，結果表明， 本發(fā)明的抗癌藥物具有比肝素更低的抗血凝特性，并且相比單一紫杉醇藥物，其 抗癌性能有較大提高。
具體實施例方式
以下制備過程以及效果的實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的進一步 限定。
(一)氧乙?；嗡氐闹苽?br> 稱量肝素鈉(250mg， O.lmmol-OH)，溶于20mL去離子水中，低溫下通過 732 (H+)陽離子交換樹脂，并用去離子水淋洗至pH值不變，淋出液用三丁胺調(diào) 至pH值至6.0,將液體濃縮冷凍干燥得三丁銨肝素衍生物(500 mg， 0.1 mmol -OH)。在N2保護下將其溶于10mlDMF中，攪拌下加入DMAP(36 mg， 0.3 mmol)， 乙酸酐(1330mg， 13mmo1)后，再加入三乙胺(1300mg， 13mmoD，冰浴反應30h后，反應轉(zhuǎn)移至室溫反應24h，反應畢，反應液中加入200mL冰乙醇，磁 力攪拌l h使其充分沉淀。溶液離心后，棄上層清液，沉淀用少量蒸餾水溶解， 液體低溫下通過732 (H+)陽離子交換樹脂，去離子水淋洗至pH值不變，淋出液 濃縮后過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱，去離子水沖洗，淋出液濃縮冷凍干燥得 到氧乙?；嗡匕咨腆w(140mg)，收率56%。
(二) 紫杉醇及紫杉醇衍生物藥物的制備
(1) 未改性紫杉醇原藥簡稱為Drugl。
(2) 在芴甲氧羰基氨酸(27mg,0.08mmo1)與紫杉醇(60 mg, 0.072 mmol)的 20 mL無水二氯甲烷中加入DMAP (38.7 mg， 0.32 mmol)， 0 'C攪拌反應30 min。 再向反應液中加入EDC (30.4mg, 0.16mmo1)在0 。C反應30 min后，升溫至 室溫反應8h，反應畢，分別用0.1NHC1 (20mL)和水(20mL)洗，用分出 有機相，水相用二氯甲烷萃取，合并有機相用無水硫酸鎂干燥后過濾，蒸除有機 相得濃縮液。在濃縮液中加入含有10%四氫吡啶20 mL 二氯甲烷室溫反應2 h。 反應畢，濃縮反應液，濃縮物用50 mL正己垸沉淀2次，離心后去上清液，粗 產(chǎn)物用柱色譜(氯仿甲醇，25: 1)分離得纈氨酸改性紫杉醇藥物(簡稱Drug2)。
(3) 采用上述方法可以制備得到亮氨酸改性紫杉醇藥物(簡稱Drug3)。
(4) 采用上述方法可以制備得到苯丙氨酸改性紫杉醇藥物(簡稱Drug4)。
(三) 化學鍵合型肝素一紫杉醇藥物的制備
0.14g氧乙?；嗡厝苡?0 mL的DMF中，攪拌下加入0.06g紫杉醇或紫杉 醇衍生物以及催化量的HC104， N2保護下室溫反應24 h，反應畢蒸出過量的 DMF，產(chǎn)物溶于5 mL去離子水裝入透析袋(MWCO3500)透析2天，透析液濃 縮凍干得白色固體產(chǎn)物，并由紫外光譜法測定載藥量。
(四) 抗血凝性能評價
采管用一次性真空采血管取正常人靜脈血2.7ml，采血管中抗凝劑為0.109
M的枸椽酸鈉0.3 ml。
正常人混合血漿的制備將上述采血輕輕搖勻，然后進行轉(zhuǎn)速3000 rpm離 心10min，收集上層液(血漿，黃色)。
活化部分凝血活酶時間(APTT)的測定肝素標品用蒸餾水配成0.15 u/ml、 0.3 u/ml、 0.45 u/ml、 0.6 u/ml、 0.75 u/ml的溶液。待測樣用蒸餾水配成3 ng/ml的 溶液。在0.1ml血槳中加入肝素標品溶液或待測樣溶液25微升，混勻后，加入 0.1 ml APTT試劑?；旌弦褐糜?7'C孵育箱中，2分鐘后，加入37'C預熱的CaCl2溶液0.1ml 。 PRECILC2000型凝血儀自動記錄凝固時間。通過測定活化部分凝
血活酶時間(APTT)評價藥物輸送系統(tǒng)的抗凝性能，即效價。
(五)抗癌性能評價
將凍存的MCF-7乳腺癌細胞復蘇后，加入完全培養(yǎng)液(RPMI 1640 + 10 %小
牛血清+0.1%抗生素)，放入37 °C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)至指
數(shù)生長期，用0.25 %胰蛋白酶消化，加入10mL完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度，取
96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入細胞懸液100 nL，平板置于37 °C、 5%C02培養(yǎng)
箱中培養(yǎng)24 h。
對照品紫杉醇配制成0.01， 0.1， 1， 10, 100 pg/mL 5個濃度；取待測藥物HD1、 HD2用完全培養(yǎng)液分別配制相當于紫杉醇濃度的5個濃度。將96孔細胞板中的 培養(yǎng)液吸出，同時用PBS清洗后，在孔板中加入100 iaL含有藥物的完全培養(yǎng)液， 置于放入37 °C、 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，應用MTT法進行測定，用酶 標儀測定每孔在570nm的OD值，計算細胞抑制率
細胞抑制率(％)=(正常細胞孔OD值一加藥細胞孔OD值)/正常細胞孔OD 值X100X
樣品濃度對數(shù)值與細胞抑制率線性回歸，計算出待測藥物對MCF-7細胞的 半數(shù)抑制濃度IC50值。
具體的藥物輸送系統(tǒng)的抗凝性能和抗癌性能評價如下
實施例l
氧乙?；嗡?1 = 5，其中氧乙?；然既眶然?3%，藥物為Drugl， 載藥量為25.4%，抗凝性能，即效價為25U/mg。作為對比，單獨的氧乙酰化肝 素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.65pg/mL， 而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2)ag/mL。 實施例2
氧乙?；嗡豱:5，其中氧乙?；然既眶然?3%，藥物為Drug2， 載藥量為16.3%，抗凝性能，即效價為17U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.42pg/mL， 而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2pg/mL。 實施例3
氧乙酰化肝素11 = 5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，藥物為Drug3， 載藥量為18.4%，抗凝性能，即效價為28U/mg。作為對比，單獨的氧乙酰化肝 素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.046ng/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50
值為4.2pg/mL。
實施例4
氧乙酰化肝素!1 = 5，其中氧乙酰化羧基占全部羧基53%，藥物為Drug4， 載藥量為16.1%，抗凝性能，即效價為12U/mg。作為對比，單獨的氧乙酰化肝 素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為 0.037pg/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 值為4.2^ig/mL。 實施例5
氧乙?；嗡?1=10，其中氧乙?；然既眶然?2%，藥物為Drugl， 載藥量為22.8%，抗凝性能，即效價為29U/mg。作為對比，單獨的氧乙酰化肝 素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.57|iig/mL， 而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2pg/mL。 實施例6
氧乙酰化肝素11=10，其中氧乙酰化羧基占全部羧基72%，藥物為Drug2， 載藥量為19.2%，抗凝性能，即效價為20U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.35pg/mL， 而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2pg/mL。 實施例7
氧乙?；嗡?1=10，其中氧乙?；然既眶然?2%，藥物為Drug3， 載藥量為17.9%，抗凝性能，即效價為24U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為 0.078ng/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 值為4.2ng/mL。 實施例8
氧乙?；嗡?1=10，其中氧乙?；然既眶然?2%，藥物為Drug4， 載藥量為17.2%，抗凝性能，即效價為15U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為 0.081pg/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 值為4.2(ag/mL。 實施例9
氧乙?；嗡?1=15，其中氧乙?；然既眶然?1%，藥物為Drugl， 載藥量為19.2%，抗凝性能，即效價為27U/mg。作為對比，單獨的氧乙酰化肝 素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.62pg/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2pg/mL。 實施例10
氧乙?；嗡?1=15，其中氧乙?；然既眶然?1%，藥物為Drug2， 載藥量為20.3%，抗凝性能，即效價為25U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為0.25pg/mL， 而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為4.2pg/mL。 實施例11
氧乙?；嗡?1=15，其中氧乙?；然既眶然?1%，藥物為Drug3， 載藥量為18.8%，抗凝性能，即效價為29U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為 0.046ng/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 值為4.2pg/mL。 實施例12
氧乙?；嗡豱:15，其中氧乙酰化羧基占全部羧基81%，藥物為Drug4， 載藥量為21.6%，抗凝性能，即效價為17U/mg。作為對比，單獨的氧乙?；?素的抗凝性能為127 U/mg;對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50值為 0.052|ag/mL，而作為對比，單一紫杉醇藥物對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度IC50 值為4.2)ag/mL。
權利要求
1、一種具有低抗血凝性肝素—紫杉醇抗癌藥物，其特征在于，采用肝素衍生物負載紫杉醇或紫杉醇衍生物，所述的肝素衍生物為氧乙?；嗡兀Y構如式I所示，式I其中X為H或SO3-基團，Y為H、SO3-或COCH3基團，n為1-17，其中氧乙?；然既眶然?0-85％。
2、 根據(jù)權利要求書1所述的一種具有低抗血凝性肝素一紫杉醇抗癌藥物，其特 征在于，紫杉醇衍生物為氨基酸改性紫杉醇，其結構如式n所示<formula>formula see original document page 2</formula>式n其中R為CH(CH3)2、 CH2CH(CH3)2或CH2C6H5基團。
3、 根據(jù)權利要求書2所述的一種具有低抗血凝性抗癌藥物，其特征在于，所述 的氨基酸為纈氦酸、亮氨酸或苯丙氨酸。
4、 根據(jù)權利要求書1-3任一項所述的一種具有低抗血凝性抗癌藥物，其特征在 于，紫杉醇或紫杉醇衍生物的重量為藥物總重量的15-30%。
5、 根據(jù)權利要求書1-3任一項所述的一種具有低抗血凝性抗癌藥物，其特征在 于，肝素衍生物通過化學鍵合方式與紫杉醇形成酯鍵或與紫杉醇衍生物形成酰胺 鍵。
全文摘要
一種具有低抗血凝性肝素-紫杉醇抗癌藥物，本發(fā)明涉及一種化學鍵合型抗癌藥物。肝素衍生物和紫杉醇或紫杉醇衍生物通過化學鍵合的方式制備出肝素-紫杉醇藥物，該抗癌藥物不但具有比肝素更低的抗血凝特性，而且具有比單純紫杉醇藥物更強的抗癌性能。
文檔編號A61K47/48GK101422613SQ200810143918
公開日2009年5月6日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者劉承斌, 向建南, 鶯 王 申請人:湖南大學