專利名稱：重組人源性硫氧還蛋白用于制備治療內(nèi)毒素血癥藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用小分子蛋白質(zhì)藥物治療感染性疾病領(lǐng)域，更具體地說， 涉及重組人源性硫氧還蛋白用于制備治療內(nèi)毒素血癥藥物的應(yīng)用，確認(rèn)重組 人源性硫氧還蛋白在發(fā)揮器官保護(hù)作用而治療內(nèi)毒素血癥中的應(yīng)用及其機 制。
背景技術(shù)：
內(nèi)毒素血癥是由于血中細(xì)菌或病灶內(nèi)細(xì)菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液，或 輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起。細(xì)菌內(nèi)毒素具有十分復(fù)雜的生物學(xué)活性， 內(nèi)毒素血癥可以出現(xiàn)在多系統(tǒng)的多種疾病中，可引起一系列病理生理改變，
包括膿毒癥、休克、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)、多器官功能障礙綜合征 (MODS)等，病死率極高。因此，拮抗內(nèi)毒素及阻斷或減弱其介導(dǎo)的損傷 具有重要臨床意義。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成部分，包 括脂質(zhì)A (LipidA)、核心多糖、特異性多糖三個成分。習(xí)慣上即將LPS稱 為內(nèi)毒素，其中由脂質(zhì)A發(fā)揮內(nèi)毒素活性，氧化應(yīng)激及其后的脂質(zhì)過氧化 反應(yīng)被證實是LPS致死的重要原因。到目前為止，內(nèi)毒素血癥的治療缺乏 有效藥物。多粘菌素B (polymyxinB，PMB)雖能夠滅活內(nèi)毒素和抑制革蘭 陰性細(xì)菌，但由于其對腎有毒副作用，以及難以從血液中清除，因此血液給 PMB治療內(nèi)毒素血癥受到限制。因此，亟需開發(fā)一類效果可靠、副反應(yīng)較 少、應(yīng)用簡單的藥物填補這一領(lǐng)域的空白。
硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)，包括Trx、 Trx還原酶(TrxR)、 NADPH和 Trx過氧化物酶(TrxP)，是一個控制細(xì)胞氧化/還原(redox)狀態(tài)和細(xì)胞 增殖/生存的、在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)的氧化還原酶系統(tǒng)。在Trx的催化中心含
有兩個氧化還原敏感的胱氨酸組成的保守序列胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-胱氨 酸，即Trx的活性中心。Trx可以還原狀態(tài)(硫氫鍵)或氧化狀態(tài)(二硫鍵) 存在，該活性中心硫氫鍵和二硫鍵的可逆轉(zhuǎn)換參與細(xì)胞內(nèi)的氧化/還原過 程。因此，Trx系統(tǒng)被認(rèn)為是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD) 系統(tǒng)之外的另一內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)。除了氧化/還原酶的活性之外，Trx可 通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活性及遷移而發(fā)揮抗炎作用。重組人源性硫氧還蛋白 (rfiTrx)可治療一些伴有白細(xì)胞浸潤的疾病，包括細(xì)胞因子或抗癌藥物誘 導(dǎo)的肺損傷、短暫定位性腦缺血、自體免疫性心肌炎等。然而，rhTrx可否 用于治療內(nèi)毒素血癥在國內(nèi)外卻鮮有報道，更不清楚其拮抗內(nèi)毒素的機制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供確認(rèn)重組人源性硫氧還蛋白(rhTrx)用于制 備治療內(nèi)毒素血癥藥物的應(yīng)用，并確認(rèn)rhTrx對內(nèi)毒素血癥的療效、尤其是 其對內(nèi)毒素血癥中發(fā)生的器官損傷的作用，并解釋其具體作用機制，以期為 應(yīng)用小分子蛋白質(zhì)藥物治療感染性疾病領(lǐng)域，如內(nèi)毒素血癥，提供直接依據(jù)。
申請人研究表明，重組人源性硫氧還蛋白(rhTrx)分子量小，生物學(xué)活
性強，而且給藥后反應(yīng)迅速，生物利用度好，有著很好的臨床應(yīng)用前景。
申請人在研究中發(fā)現(xiàn)
1、 外源性給予動物L(fēng)PS處理，可使肝臟Trx活性降低，同時也對肝臟 造成了明顯的損傷。
2、 在機制方面，申請人在國際上首次發(fā)現(xiàn)，LPS可通過糖基化反應(yīng)與 Trx快速結(jié)合生成果糖胺(Fructosamin,FA)，其后，LPS組分之一的核心多 糖可顯著抑制Trx活性，該效應(yīng)呈現(xiàn)劑量及時間依賴性的特點。
3、 另一方面，外源性給予rhTrx治療，可逆轉(zhuǎn)LPS對機體及肝臟的損
在內(nèi)毒素血癥中發(fā)揮器官保護(hù)作用，提示rhTrx在內(nèi)毒素血癥、尤其是發(fā)生 器官損傷時的潛在治療價值。


圖1是外源性給予動物L(fēng)PS處理，可使肝臟Trx活性降低。A.高劑量 LPS (20ng/g)處理可時間依賴性地抑制肝臟Trx活性；B. LPS處理12小時 后可抑制肝臟Trx活性；C.LPS處理可使肝臟Trx表達(dá)增加。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng) 計學(xué)處理后，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，**表示與Sham假手術(shù)組相比，,0.01， 即有非常顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
圖2是給予LPS處理，可使肝臟發(fā)生損傷；外源性給予rhTrx (4ng/g) 治療，可逆轉(zhuǎn)LPS對機體及肝臟的損傷，但給予糖基化Trx則沒有該作用。 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，**表示與Sham假手術(shù)組 相比，/7<0.01;"表示與LPS組相比，,0.01; #表示與LPS/Trx組假手術(shù)組相比， ; O.Ol。
圖3是給予LPS處理可降低血糖水平；外源性給予rhTrx (4pg/g)治療， 可部分恢復(fù)血糖，但給予糖基化Trx則沒有該作用。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理 后，用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，^表示與Sham假手術(shù)組相比，pO.01; t表示與LPS 組相比，；t<0.05，即有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
圖4是給予LPS處理可增加肝臟Caspase-3活性，即促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡； 外源性給予rhTrx或糖基化Trx治療則沒有該作用。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理 后，用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，**表示與Sham假手術(shù)組相比，p<0.01。
圖5是給予LPS處理，可使肝臟Trx活性降低，Trx活性降低不依賴于 NOx水平或硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP，通過與Trx相互作用而調(diào)節(jié)機體 氧化還原反應(yīng))表達(dá)。A. LPS處理后血漿NOx水平；B. LPS處理后肝臟NOx 7jC平；C. LPS處理后肝臟TXNIP表達(dá)水平。
圖6是給予LPS處理，可在離體水平使Trx活性降低。A. LPS (37。C，2H
LPS=lmg/ml)可抑制Trx活性；B. LPS組分之一的核心多糖可顯著抑制Trx 活性，其另一組分脂質(zhì)A的抑制效果相對弱些；C. LPS可劑量依賴性地抑 制Trx活性；D. LPS可時間依賴性地抑制Trx活性。
圖7是LPS可與Trx結(jié)合，使其分子量增加。A.檢測Trx水平的Western blot結(jié)果，1:LPS (lmg/ml，37。C 2H)處理后的Trx水平，2:對照組(37°C 2H) Tix水平，3:未處理組Trx水平;B.檢測與Trx結(jié)合的LPS水平的Western blot 結(jié)果，1:未處理組(Tix)， 2:Trx+LPS (lmg/ml,37°C2H)處理組，3:LPS (lmg/ml) 組；C.此圖與B圖所用的是同一張膜，所加入的是Tdc抗體，可觀察到LPS 處理后Trx條帶更強。
圖8是LPS通過糖基化反應(yīng)與Trx結(jié)合。A.在離體水平，Trx被LPS 糖基化，M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，P:陽'艦照，C:陰'艦照，l:hTnc (IO嗎)，2:hTix (IO嗎)+LPS (5mg/ml)， 3: LPS (5mg/ml)， 4:hTrx (IO嗎)，5: hTrx (IO叫)+LPS (10mg/ml)， 6: LPS (lQmg/ml); B. LPS處理后Trx分子量增加，分組與圖A 相同；C. Trx被LPS糖基化生成初始產(chǎn)物果糖胺(Fructosamin,FA)。
圖9是標(biāo)準(zhǔn)的糖基化方法檢測結(jié)果顯示，用單糖處理Trx，可使其發(fā)生 顯著的糖基化反應(yīng)。A.三種不同的單糖使Trx發(fā)生糖基化反應(yīng)；B.標(biāo)準(zhǔn)糖 基化處理后Trx活性；C.標(biāo)準(zhǔn)糖基化反應(yīng)劑量及時間依賴性地增加Trx分 子量；D.標(biāo)準(zhǔn)糖基化反應(yīng)劑量及時間依賴性地抑制Trx活性。
以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實驗及其結(jié)果對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì) 說明。
具體實施例方式
1、建立動物內(nèi)毒素血癥模型及研究方案
用脂多糖(LPS,20ng/g)腹腔注射處理成年小鼠，檢測機體多個器官的 Trx活性，并觀察肝臟損傷情況。
1)在LPS處理前10分鐘給予Trx或糖基化Trx (4ng/g)，檢測Trx活
性及肝臟損傷情況。
2) 用LPS與重組人源性硫氧還蛋白(hTRX)共同孵育，檢測LPS不 同組分、LPS不同濃度、不同時間點對Trx活性的影響。其中，重組人源性 硫氧還蛋白(hTRX)按常規(guī)的方法在大腸桿菌中克隆并表達(dá)hTRX，純化 rhTRX蛋白，細(xì)胞凋亡指標(biāo)采用Caspase-3活性及FACS方法檢測，MTT法 檢測細(xì)胞增殖。
3) 用Western blot檢測LPS與Trx的結(jié)合情況，用PAS染色及果糖胺 檢測研究Trx糖基化反應(yīng)。
4) 用標(biāo)準(zhǔn)糖基化方法檢測Trx糖基化反應(yīng)及作用。 2.研究結(jié)果
1) 外源性給予動物L(fēng)PS處理，可使肝臟Trx活性降低，但同時可使其 表達(dá)增加；Trx活性降低不依賴于硝基化、亞硝基化反應(yīng)或硫氧還蛋白結(jié)合 蛋白(TXNIP,通過與Trx相互作用而調(diào)節(jié)機體氧化還原反應(yīng))表達(dá)。同時， LPS對肝臟造成了明顯的損傷。
2) 在機制方面，申請人在國際上首次發(fā)現(xiàn)，LPS可與Trx結(jié)合，使其 分子量增加；之后，LPS組分之一的核心多糖可顯著抑制Trx活性，其另一 組分脂質(zhì)A的抑制效果相對弱些。申請人通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LPS與Trx 的結(jié)合其實質(zhì)是一種糖基化反應(yīng)，該反應(yīng)速度很快，結(jié)合后生成最初的糖基 化產(chǎn)物——果糖胺(Fructosamin, FA)，通過該反應(yīng)，LPS可劑量依賴性及 時間依賴性地抑制Trx活性。
3) 為驗證上述發(fā)現(xiàn)，申請人用標(biāo)準(zhǔn)的糖基化方法檢測Trx對糖基化反 應(yīng)的敏感性，結(jié)果顯示，用單糖處理Trx，可使其發(fā)生顯著的糖基化反應(yīng)， 該效應(yīng)也呈現(xiàn)劑量及時間依賴性的特點。
4) 另一方面，外源性給予rhTrx治療，可逆轉(zhuǎn)LPS對機體及肝臟的損 傷，但給予糖基化的Trx則沒有該作用。
綜上所述，申請人利用動物內(nèi)毒素血癥模型研究發(fā)現(xiàn)，該模型小鼠肝臟
Trx活性降低，且肝臟發(fā)生損傷，其機制與內(nèi)毒素通過糖基化反應(yīng)和Trx結(jié) 合有關(guān)；而給予rfiTrx腹腔注射可以很快使其肝臟損傷程度活性降低、同時 Trx活性有所恢復(fù)，從而明顯減輕內(nèi)毒素血癥癥狀，有潛在的臨床應(yīng)用價值。 內(nèi)毒素血癥可以出現(xiàn)在多系統(tǒng)的多種疾病中，發(fā)生率也相對較高急性 肝炎37-64%,爆發(fā)性肝炎58-100%，丙肝61.54%，膽石癥伴急性梗阻性化 膿性感染85%，燒傷85%，敗血癥70%,多器官功能衰竭100%，急性胰腺 炎90%,皮膚軟組織感染70-81.1%,腹腔感染72-84%，尿路感染70-80% (腎炎)、癌癥70%，肺炎100%，上感100%。除導(dǎo)致致死性感染性休克、 多器官功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等，內(nèi)毒素血癥通常還會直接或間接損 害肝臟，引起糖代謝紊亂及酶學(xué)、蛋白代謝的改變，病死率極高。內(nèi)毒素血 癥的主要治療原則之一減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，申請人則在國際上首次發(fā) 現(xiàn)硫氧還蛋白可通過糖基化反應(yīng)中和內(nèi)毒素，從而減輕肝細(xì)胞損傷、壞死， 促進(jìn)肝臟功能回復(fù)，在內(nèi)毒素血癥中發(fā)揮器官保護(hù)作用；且人源性重組硫氧 還蛋白分子量小，生物利用度好；相比于動物源性制劑，免疫原性?。桓骨?注射，簡單方便。因此，它在內(nèi)毒素血癥的治療方面有著良好的應(yīng)用前景。 本發(fā)明的使用對象是發(fā)生內(nèi)毒素血癥、尤其是還伴有肝臟損傷等癥狀的 患者。本發(fā)明簡單易行，且無特殊禁忌癥，可在大醫(yī)院、小診所等廣泛使用。
權(quán)利要求
1. 重組人源性硫氧還蛋白用于制備治療內(nèi)毒素血癥藥物的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的重組人源性硫氧還 蛋白制備的藥物為腹腔注射制劑或靜脈注射制劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物用于嚴(yán)重內(nèi)毒 素血癥并發(fā)重要臟器衰竭的患者，通過外源性給藥并發(fā)生糖基化反應(yīng)而中和 內(nèi)毒素，以減輕患者毒血癥反應(yīng)及保護(hù)機體重要臟器。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組人源性硫氧還蛋白用于制備治療內(nèi)毒素血癥藥物的應(yīng)用在制備治療內(nèi)毒素血癥中藥物的應(yīng)用，經(jīng)實驗證明，該蛋白在體內(nèi)或體外均能與內(nèi)毒素直接結(jié)合，并發(fā)生糖基化反應(yīng)，從而起到中和內(nèi)毒素并保護(hù)肝臟等重要臟器的作用。本發(fā)明的使用對象是發(fā)生內(nèi)毒素血癥、尤其是還伴有肝臟損傷等癥狀的患者。本發(fā)明簡單易行，且無特殊禁忌癥，可在大醫(yī)院、小診所等廣泛使用。
文檔編號A61K38/43GK101391100SQ20081015115
公開日2009年3月25日 申請日期2008年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日
發(fā)明者張海鋒, 王海昌, 凌 陶, 馬新亮 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)