專利名稱：蛇孢假殼素(ophiobolin)類二倍半萜烯化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用焦曲霉094102 (^^/ /〃m"Wm094102)制備蛇孢假殼素(ophiobolin) 類二倍半萜烯化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑 中的用途。
背景技術(shù)：
蛇孢假殼素(ophiobolin)類二倍半萜烯化合物已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，該類化合物顯示了 廣譜的抗菌活性，如抗線蟲、抗真菌及抗細(xì)菌等，此外還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒 活性。據(jù)報(bào)道，該家族的ophiobolin A能抑制鈣離子活化的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的活性并導(dǎo) 致小鼠白血病細(xì)胞L1210細(xì)胞的凋亡。
到目前為止已發(fā)現(xiàn)該類化合物30余種，該類化合物的結(jié)構(gòu)特征是均具有一個(gè)三輪列的 5-8-5環(huán)結(jié)構(gòu)。此外，有14、 17位形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)的，如ophiobolin A、 ophiobolin J等(Antonio, E., Anna, A.， Alessio C., et al. Ophiobolin E and 8-一-ophiobolin J produced by Z>ecfe7era g/ga"/e朋,a potential mycoherbicide of weedy grasses.尸/z少toc/zem/rf^y, 2006, 67, 2281-2287); 有16、 17位雙鍵被氫化而飽和的，如ophiobolins B—D、 ophiobolin F、 ophiobolin M等 (Athanasios T., Akinlolu A. A., Jan S. T,, et al. Ophiobolin M and Analogues, Noncompetitive Inhibitors of Ivermectin Binding with Nematocidal Activity.Afed C7^肌,1996， 4, 531-536);有5、 21位之間形成內(nèi)酯環(huán)或半縮酮的，如ophiobolin A lactone 、 ophiobolinH、 ophiobolin L等(Hong W., Takuya I., Masahiro K., et al. Cytotoxic sesterterpenes, 6-—-ophiobolin G and 6-ep/-ophiobolin N, from marine derived fungus五OTen'ce〃a濯'eco/or GF10. 7fe/m/2^ra"， 2004, 60， 6015-6019)。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)焦曲霉094102 (^pwg/〃z^ ^ft^ 094102)液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細(xì)胞壞死活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn) 行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了三個(gè)蛇孢假殼素(ophiobolins)類二倍半萜烯化合物具有抗腫瘤活性， 目前尚未見對(duì)該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見有與 此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有細(xì)胞增殖抑制以及直接殺傷癌細(xì)胞等抗腫瘤活性 的新化合物。
本發(fā)明的目的還在于提供一類新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細(xì)胞增殖 抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
本發(fā)明首次從焦曲霉094102 "^^g///2^船to 094102)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的蛇
3物，如式I、式II所示:
其結(jié)構(gòu)特征是式I中R" R2為氫、烴基、?；?，式n中&為氫、烴基。
本發(fā)明的式i 、式n化合物優(yōu)選其中化合物i中& R2均為甲基，2i位的甲氧基為e構(gòu)
型；和化合物2中RiR2均為甲基，21位的甲氧基為a構(gòu)型。所述的式II化合物3中&為 甲基。
上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由紅樹林來(lái)源的焦曲霉094102(A/^g/〃M 094102) 的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-丙酮3: 1的洗
脫物，再經(jīng)凝膠柱層析以氯仿-甲醇1: 1為洗脫劑，洗脫產(chǎn)物再經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水
為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，甲醇-水85: 15洗脫產(chǎn)物經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水90: 10
洗脫得式I1和2、式II化合物3。
本發(fā)明采用SRB法測(cè)試了化合物1， 2， 3對(duì)A549人肺癌細(xì)胞株的抗腫瘤活性，采用MTT
法測(cè)試了化合物l，2，3對(duì)HL-60人白血病細(xì)胞株的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這3個(gè)化合物
對(duì)這兩種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用。
因此本發(fā)明的式I 、式II化合物可用作細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。
式I、式II化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，
用于腫瘤的治療。
式i、式n化合物還可作為抑制細(xì)胞增殖的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究，作為 探針應(yīng)用時(shí)，式I、式II化合物可溶于甲醇中，也可溶于二甲基亞砜中加以應(yīng)用。
本發(fā)明的式I、式II化合物可通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；
也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)修飾方法合成獲得。
需要特別說(shuō)明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式i、式n化合物的方法可采用其它任 何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備 式i、式n化合物。
本發(fā)明的實(shí)施例中列舉了利用焦曲霉094102株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I、式II化合物的實(shí)例。該真菌094102株由從文昌頭苑紅樹林木欖土壤中分離，并經(jīng)分類學(xué)研究和分子生物學(xué) 研究鑒定為焦曲霉A^e一/^^to，并由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(編號(hào)CCTCCM 208153，日期2008年10月10閂，地點(diǎn)中國(guó)武漢、武漢大學(xué))。
該焦曲霉094102 a印erg///^ z^ftw 094102 )株具有如下微生物菌學(xué)特征 菌落在査氏培養(yǎng)基28'C培養(yǎng)7天的直徑25 35mm，培養(yǎng)15天的直徑45 60mm;菌落 呈灰褐色，有白色邊緣，質(zhì)地棉絮狀，無(wú)滲出液；菌落反面不均勻的黃褐色。分生孢子梗 發(fā)生于氣生菌絲，分生孢子頭幼時(shí)為球形，老后成為輻射形。孢梗莖400~800 pm x 10-16 Hm，具褐色，壁光滑。頂囊球形或半球形，6 13 pm，大部分表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)雙層， ?；?~9 pm x 3 3.5 pm，瓶梗4~10 |am x 2 3 分生孢子球形，3~5 (im，明顯粗糙，具 小突起。
該焦曲霉094102 C4s^rg/〃^Mft^094102)株具有如下分子生物學(xué)特征 ITS序列信息
TAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAA
18S序列信息CCGAAAGGGGGTCGAGGGAACA
需要特別說(shuō)明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I、式II化合物的方法可采用其它任何 能生產(chǎn)蛇孢假殼素(ophiobolin)類二倍半萜烯化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的 微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I、式II化合物。
具體實(shí)施例方式
在如下的實(shí)施例中所指的化合物1、 2、 3的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字 是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)
26
式I中化合物1的R!R2均為甲基，21位的甲氧基為e構(gòu)型；化合物2的R,R2均為甲基， 21位甲氧基為a構(gòu)型。式II中化合物3的R,為甲基。
6實(shí)施例1化合物1、 2、 3的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制 1發(fā)酵生產(chǎn)
生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取焦曲霉094102 (A;^gz7to wWz^ 094102)適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。
取斜面培養(yǎng)4天的焦曲霉094102 "^erg/〃w 094102)適量，接種到裝有120 mL 培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)甘露醇20.0，麥芽糖20.0，葡萄糖IO.O，味精10.0，酵母膏 3.0，玉米漿1.0，磷酸二氫鉀0.5，硫酸鎂0.3， pH6.5]的500mL錐型瓶中，在28。C、 120 轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時(shí)，獲得焦曲霉094102 (J印wg///^ 094102)的種子培養(yǎng) 液。將該種子培養(yǎng)液按10%接種量分別接種于裝有300毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/ 升)甘露醇20.0，麥芽糖20.0，葡萄糖IO.O，味精10.0,酵母膏3.0，玉米漿1.0，磷酸 二氫鉀0.5，硫酸鎂0.3， pH6.5]的1000mL三角燒瓶中，進(jìn)行為期30天24°C的靜置生產(chǎn)發(fā) 酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。 2浸膏的獲得
用絹布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮破碎浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮， 所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液 減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共15.0 克。
3化合物的分離精制
浸膏(15.0克)用氯仿-甲醇(9:1)混合溶劑溶解后，加70克200~300目硅膠H (青 島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為溶劑 進(jìn)行梯度洗脫，分為IO個(gè)流份。Fr-6 (1.8克，石油醚-丙酮9: 3洗脫物)，再經(jīng)凝膠柱層 析以氯仿-甲醇l: l為洗脫劑，洗脫產(chǎn)物再經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水為溶劑進(jìn)行梯度洗脫， 其中甲醇-水85: 15洗脫產(chǎn)物經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水90: IO洗脫得式I、式II 化合物l (16mg)、 2 (14mg)、 3 (3mg)。
化合物l，白色無(wú)定型粉末，[a]D2()+34.7° (c 0.1, MeOH)，分子式C27H4204; UV^axiim inMeOH: 238; IR vmax cm-1 (KBr): 3400、 2966、 2864、 1728、 1643、 1275、 1088; &及 UCNMR數(shù)據(jù)見表1和表2。
化合物2，白色無(wú)定型粉末，[a]D2()+72.6° (c 0.1, MeOH)，分子式C27H4204; UV^狀nm inMeOH: 238; IR vmax cm.1 (KBr): 3420、 2958、 2813、 1710、 1655、 1290、 1088; &及 UCNMR數(shù)據(jù)見表1和表2。
化合物3，白色無(wú)定型粉末，[a]D2G +58.2° (c 0,1, MeOH)，分子式C25H3802; UV ^ax nm inMeOH: 238; IRvmaxcm" (KBr): 3435、 1670、 1659、 1376、 1230、 1154; iH及。CNMR 數(shù)據(jù)見表1和表2。表l化合物1 3的(600MHzinCDCl3)
H123
11.41 (1H,m), 1.56 (1H， m)1.40 (1H, m)， 1.62 (1H， m)1.35(1H，m), 1.66(1H,m)
22.28 (1H, m)2.32 (1H, m)
41.94(1H,d,13.6), 2.28(1H,d,13.6)1.94(1H,d,13.9), 2.03(1H,d,13.9)2.38(1H,d,19.1), 2.51(1H,d,19.1)
63.26(1H,m)3.17(1H,m)3.38 (1H, d, 9.9)
85.92 (1H, m)5.99(1H, m)5.59 (1H, t, 8.4)
92.61 (1H, m)， 1.74(1H，m)2.57(1H,m), 1.53 (1H, m)2.37(1H, m), 1.72(1H, m)
101.61 (m,n^1.66(1H，m)1.53(1H, m)
121.35(1H，m), 1.40(1H, m)1.36(1H,m、 1.44(1H, m)1.40 ^1H,mi 1.39(1H, m)
131.25(1H,m), 1.81 (1H, m)1.24(1H, m;, 1.77(1H，m51.25^1H,m), 1.61 (1H,m5
142.05 (1H, m)2.08 (1H， m)2.03 (1H, m)
152.67 (1H,2.68 (1H, m)2.68 (1H, m)
165.16(1H,m)5.21 (1H， m)5.18 (m， rr^
175.98 (1H, m)5.99 (1H, m)5.98 (1H, m)
185.98 (1H, m)5.99 (1H, m)5.98 (1H, m)
201.23 (3H， s)1.21 (3H,s)1.41 (3H, s)
215.34 (1H, s)5.36 s)1.68 (3H, s)
220.89 (3H, s;0.92 (3H,0.93 (3H, s;
230.87 (3H， d, 6.6)0.88 (3H, d, 6.6)0.88 (3H, d, 6.6)
241.72 (3H, s)1.73 (3H, s)1.73 (3H, s)
251.79 (3H, s)1.80 (3H, s)1.80 (3H, s)
263.36 (3H,s)3.25 (3H,s)
273.45 (3H, s)3.45 (3H, s)
3-OH2.42 (1H, s)4.29 (1H, s)
表2化合物1~3的"CNMR數(shù)據(jù)(150 MHzin CDCI3)
C 12 3
135.6136.3 t34.5 t
250.5 d51.0d50.2 d
79.8 s79.7 s77.6 s
448.4151.1 t54.4 t
119.1 s120.9 s219.8 s
652.0 d50.3d52.8 d
140.0 s139.2 s129.6 s
8130.1 d130.9 d132.3 d
925.0 t24.9 t24.2 t
1054.8 d54.7 d55.2 d
1143.4 s43.5 s43.5 s
1243.0 t43.0 t42.9 t
1326.8 t26.6 t26.6 t
1447.1 d47.3 d47.0 d
1535.5 d35.4 d35.8 d
16137.7 d137.8 d137.6 d
17121.8 d121.8d121.7 d
18120.2 d120.3 d120.2 d
19135.2 s135.1 s135.1 s
2026.0 q26.4 q27.0 q
21106.8 d107.6 d21.5 q
2218.5 q18.6 q18.8 q
2320.2 q20.2 q20.4 q
2418.1 q18.1 q18.1 q
2526.5 q26.4 q26.5 q
2651.2q50.6 q
2755.4 q55.6 q
實(shí)施例2抗腫瘤活性的測(cè)試 1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法
被測(cè)樣品溶液的配制測(cè)試樣品為上述實(shí)施例1中分離精制的純品化合物1;3。準(zhǔn)確稱 取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測(cè)試。
8細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)活性測(cè)試采用A549和HL-60細(xì)胞系。各種細(xì)胞均用含 10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37°C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。 細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試方法(SRB法和MTT法)
本發(fā)明采用SRB法和MTT法，測(cè)試評(píng)價(jià)了被測(cè)試樣品對(duì)癌細(xì)胞A549和HL-60增殖 的抑制活性?；罴?xì)胞線粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4,5-二甲基噻挫)-2,5-二苯 基四氮唑?yàn)樗{(lán)紫色的不溶于水的甲月替(formazan)， formazan的多少可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其 吸收度求得。由于formazan的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細(xì)胞的數(shù)目， 從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。
活性測(cè)試時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為 每毫升5xl(^個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37。C下培養(yǎng)24小 時(shí)后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。然后加入20 )^L含MTT 的IPMI-1640溶液(5 mg/L)，再培養(yǎng)4小時(shí)，移出150 培養(yǎng)液后加入150 DMSO溶 解formazan，在540 nm處測(cè)定其吸收度。按照IR%=(OD空白對(duì)照-OD樣品)/ OD空白對(duì)照x 100%式 計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR%)。 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
化合物1~3的細(xì)胞增殖抑制活性
表3.化合物1~3對(duì)A549和HL-60細(xì)胞的抑制率
A549 HL-60
化合物/濃度(pM)1001010.10.011001010.10.01
196.897.4卯.l2.72.284.085.684.81U4.7
96.391,317.61.31.083.886.884.62.01.4
391.342.31.81.11.883.977.87.42.90
3結(jié)論
化合物i~3對(duì)人癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的式i、式n化合物可作為抗 腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細(xì)胞增殖抑制的低分子生物探針用于 探索生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中。
權(quán)利要求
1.式I、或式II化合物式I 式11其中式I R1、R2為氫、烴基、?；絀I R1為氫、烴基。
2. 權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物，其中式I化合物為化合物1和化合物2，其 中化合物l中R, R2均為甲基，21位的甲氧基為e構(gòu)型；化合物2中R! R2均為甲基，21 位的甲氧基為a構(gòu)型；式II化合物為化合物3，其中Ri甲基。
3. 權(quán)利要求2所述式I或式II化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)焦曲霉094102 (^f^gz7/^ ^to 094102)，獲取含有上述式I、式II化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分 離純化出式I化合物1和化合物2、式II化合物3。
4. 權(quán)利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以石油醚-丙酮為 溶劑進(jìn)行梯度洗脫，石油醚-丙酮3: 1的洗脫物，再經(jīng)凝膠柱層析以氯仿-甲醇1: 1為洗 脫劑，洗脫產(chǎn)物再經(jīng)反相柱層析，以甲醇-水為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，甲醇-水85: 15洗脫產(chǎn) 物經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水90: IO洗脫得式I、式II化合物1、 2、 3。
5. 權(quán)利要求4所述的制備方法，其中所述蛇孢假殼素(ophiobolins)類二倍半萜烯化 合物的生產(chǎn)菌是焦曲霉094102 U^wgZ〃M 094102)。
6. 權(quán)利要求i所述的式i或式n化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑中 的用途。
7. 權(quán)利要求1所述的式I或式II化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的用途。
8. 權(quán)利要求i所述的式i或式n化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。
9. 焦曲霉094102 "sperg/Z/wswWws 094102)。
10. 權(quán)利要求9所述的菌株用于生產(chǎn)權(quán)利要求i所述的式i或式n化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛇孢假殼素(ophiobolin)類二倍半萜烯化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明用從文昌頭苑紅樹林植物木欖根系的土壤樣品中分離得到的焦曲霉094102(Aspergillusustus 094102，菌種保藏編號(hào)CCTCC M 208153)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的上述類型的化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101591314SQ20081017294
公開日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日
發(fā)明者盧圳域, 朱偉明, 葵 洪, 繆承杜 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué);中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所