專利名稱：：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒變異株，尤其涉及一株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)變異株，本發(fā)明還涉及該病毒變異株的培育方法和應(yīng)用，屬于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的病原，該病以妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡段豬的呼吸道疾病和高死亡率為特征(BE斯特勞，SD阿萊爾，WL蒙加林，等主編.豬病學(xué)[M].趙德明，等譯.第8版，2000，205-238)。Wensvoort等首次分離該病病原，相繼許多國家報(bào)道本病流行(WensvoortQTepstraC，PolJMA，etal.MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VetQ，1991,13(3):121-130.)。郭寶清等證實(shí)本病在中國存在，并從流產(chǎn)胎兒中分離到PRRSVCH-la株(郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996，2:3-7.)。PRRSV具有抗原變異性、嗜巨噬細(xì)胞性、持續(xù)感染性及抗體依賴增強(qiáng)性作用，臨床上常與其它病原混合感染使臨床表現(xiàn)形式復(fù)雜化。在自然感染中，PRRSV容易發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致病毒的致病性、細(xì)胞嗜性、生物學(xué)特性等發(fā)生較大改變。Halbur等從美國衣阿華州分離到一株P(guān)RRSV變異株能夠引起更嚴(yán)重的母豬繁殖障礙和仔豬較高死亡率，并證實(shí)變異株由基因突變演化而來(HalburPQPaulPS,MengXJ,etal.ComparativepathogenicityofnineU.S.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isolatesafive-week-oldcesarean-derived，colostrums畫deprivedpigmodel[J].JVetDiagnInvest,1996，8:11-20.)。2006年中國南方爆發(fā)的"豬高熱綜合征"，病原學(xué)研究表明由一種新的PRRSV變異株引起，證明變異株編碼的Nsp2基因第483和535563位氨基酸存在缺失(童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(5):323-327.)。大量研究表明，PRRSV在復(fù)制過程中，基因組內(nèi)容易發(fā)生很高頻率的突變，導(dǎo)致臨床上流行不同的毒株，而不同的分離株引起的疫病臨床表現(xiàn)不盡—致(YoshiilM,KakuY，MurakamilY，etal.GeneticvariationandgeographicdistributionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinJapan[J].ArchVirol，2005，150:2313-2324;EnricM,MargaM，DolorsV.Geneticdiversityandphylogeneticanalysisofglycoprotein5ofEuropean-typeporcinereproductiveandrespiratoryvirusstrainsinSpain[J].JGenVirol，2003，84:529-534;TruongHM,LuZ,KutishGF，etal.AhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusgeneratedfromaninfectiouscDNAcloneretainstheinvivovirulenceandtransmissibilitypropertiesoftheparentalvirus[J].Virology,2004,325:308-319;ChaSH，ChoiEJ，ParkJH，etal.MolecularcharacterizationofrecentKoreanporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusesandcomparisontootherAsianPRRSviruses[J].VetMicrobiol,2006,117:248-257.)。如歐洲型毒株感染豬常觀察到耳、乳頭、鼻、頸腹部皮膚呈藍(lán)紫色，而北美型毒株出現(xiàn)幾率較低(BE斯特勞，SD阿萊爾，WL蒙加林，等主編.豬病學(xué)[M].趙德明，等譯.第8版，2000，205-238.)。自2006年我國流行的高致病性PRRSV變異株屬北美型，臨床病例常見有典型藍(lán)耳或皮膚發(fā)紫癥狀，致死率較經(jīng)典毒株顯著提高，基因測序結(jié)果顯示流行毒株與經(jīng)典毒株有較大差異，集中表現(xiàn)在Nsp2基因發(fā)生缺失現(xiàn)象(童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(5):323-327.)。由于PRRSV變異毒株感染豬引起嚴(yán)重的臨床疾病，對(duì)其致病機(jī)理、遺傳變異規(guī)律及防控對(duì)策尚待深入研究，分離得到增殖性能穩(wěn)定的PRRSV變異毒株是開展上述研究的前提或關(guān)鍵技術(shù)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一株增殖性能穩(wěn)定的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從臨床"高熱綜合征"病例分離到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株，經(jīng)細(xì)胞傳代和蝕斑克隆，培育得到增殖性能穩(wěn)定的新毒株，命名為PRRSV-HBR;所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的Nsp2序列中第483和535563位氨基酸存在缺失；其傳代毒株的N印2基因的第31163127位核苷酸發(fā)生突變，添加了12個(gè)核苷酸序列(GAGATCGCCTTT，SEQIDNO.1);另夕卜，對(duì)本發(fā)明PRRSV-HBR株第5和40代毒種進(jìn)行0RF5基因序列比較發(fā)現(xiàn)，0RF5框架內(nèi)的第566位核苷酸由C突變?yōu)門;本發(fā)明所述毒株的微生物保藏號(hào)是CGMCC.2657;分類命名是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(尸ord"ere/ro(iw"/vere5/^>ato77j^"c/ro附eWn^);〈呆藏時(shí)間是2008年8月29日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明所分離的PRRSV-HBR毒株接種細(xì)胞后能夠產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，隨傳代次數(shù)增加毒價(jià)顯著提升，第4555代毒價(jià)測定達(dá)10"TCID5。/mL。采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)檢測，發(fā)現(xiàn)病毒抗原分布在細(xì)胞漿中；電鏡觀察到的病毒粒子呈圓形，直徑約5055nm。本發(fā)明所分離的PRRSV-HBR變異株，根據(jù)其基因序列與致病性特點(diǎn)，屬于高致病性PRRSV變異株，經(jīng)過細(xì)胞傳代與克隆純化培育的新毒株，又發(fā)生了較大變異，在Nsp2基因添加了12個(gè)堿基序列，獲得的這種遺傳標(biāo)志為今后開展變異株的致病性、遺傳變異與毒力的相關(guān)性及分子標(biāo)記疫苗的研制開辟了新途徑。關(guān)于南方發(fā)生的"高熱綜合征"的報(bào)道較多，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為高致病性PRRSV變異株為原發(fā)病原，也證實(shí)有其它病原混合感染存在。用本發(fā)明所分離的PRRSV變異株第5代培養(yǎng)物滴鼻接種試驗(yàn)豬(1X1045TCID5。)，試驗(yàn)結(jié)果表明該毒株能夠引起豬只嚴(yán)重的臨床癥狀，出現(xiàn)持續(xù)高熱、精神萎靡、食欲減退、皮膚充血、進(jìn)行性消瘦、眼瞼水腫等癥狀，發(fā)病率達(dá)100%(10/10)，死亡率為30%左右(3/10)。然而，試驗(yàn)豬并沒有復(fù)制出臨床上的皮膚發(fā)紫、耳部發(fā)紺現(xiàn)象，這與相關(guān)的報(bào)道存在一定差異(童光志，周艷君，郝曉芳，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(5):323-327.)?；蛐蛄斜砻?，盡管本發(fā)明PRRSV-HBR株與HUN4-07-China和JXAl-06-Chian株序列同源性較高，但毒力較后兩者低一些。由于高致病性PRRSV變異株易發(fā)生遺傳變異，通過細(xì)胞傳代后毒力下降較快，本發(fā)明人用本毒株第13代培養(yǎng)物接種2頭試驗(yàn)豬，沒有引起顯著的臨床反應(yīng)，證明毒株經(jīng)細(xì)胞傳代毒力下降很快。用分離的本發(fā)明毒株感染試驗(yàn)豬接種后第2d可檢測到病毒血癥，第7d檢測到血清抗體。病毒急性感染期，感染豬多種臟器中病毒抗原與核酸檢測均呈陽性，表明病毒在這些臟器有大量繁殖；但感染后主要分布諸如扁桃體、脾臟、淋巴結(jié)組織，表明變異株的組織嗜性發(fā)生了一定改變。由于病毒在這些組織中大量增殖，釋放較多的組織胺，從而刺激神經(jīng)中樞系統(tǒng)調(diào)節(jié)體溫，導(dǎo)致臨床上持續(xù)高熱。持續(xù)高熱期與病毒血癥呈正相關(guān)，高熱期內(nèi)RT-PCR檢測血清中病毒核酸陽性率極高，而體溫下降后毒血癥逐漸消退。病毒感染急性死亡與耐過豬臟器病毒抗原和核酸檢測顯示，感染急性死亡豬只多種臟器均呈陽性，而耐過豬以淋巴結(jié)、脾臟和扁桃體等組織陽性檢出率高，這對(duì)本病診斷有一定意義?？傊?，本發(fā)明通過靶動(dòng)物感染試驗(yàn)及免疫學(xué)檢測，證實(shí)了本發(fā)明所分離毒株P(guān)RRSV-HBR具有高致病性和遺傳變異性；通過細(xì)胞傳代馴化，產(chǎn)生了標(biāo)志性基因突變，獲得了帶有遺傳標(biāo)志的新毒株，該毒株體外繁殖能力穩(wěn)定，這對(duì)新型疫苗的研制具有重要參考價(jià)值，也為今后病毒致病機(jī)理、遺傳變異、鑒別診斷及分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。圖lPRRSV-HBR株感染Marcl45細(xì)胞產(chǎn)生的病變(A:病毒感染；B:細(xì)胞對(duì)照)。圖2PRRSV-HBR株的病毒蝕斑克隆純化。圖3IPMA法檢測PRRSV-HBR株感染細(xì)胞病毒抗原；(A:病毒感染；B:細(xì)胞對(duì)照)。圖4PPRSV-HBR株電鏡形態(tài)學(xué)觀察；A:病毒免疫復(fù)合物；B:感染細(xì)胞切片。圖5直接免疫熒光法檢測PRRSV-HBR株感染豬脾臟中病毒抗原；A:感染豬脾臟免疫熒光陽性；B:健康對(duì)照呈陰性。圖6PRRSV-DIFA法檢測本發(fā)明病毒株在MARC-145細(xì)胞繁殖動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果。圖7DIFA法檢測PRRSV-HBR毒株人工感染豬臟器組織抗原分布(200X);A:心臟；B:肝臟；C:脾臟；D:肺臟；E:腎臟；F:下頜淋巴結(jié)；J:腸系膜淋巴結(jié)；H:腹股溝淋巴結(jié)；I:空腸；J:扁桃體；K:腦；L:睪丸。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1PRRSV-HBR毒株的分離和鑒定1材料和方法1.1病毒分離1.1.1樣品處理從臨床患"豬高熱綜合征"病例采集血清，經(jīng)4000r/min離心30min，0.22um微孔濾膜除菌，用培養(yǎng)液按5%稀釋后接種Marcl45細(xì)胞分離病毒。1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)Marcl45細(xì)胞株本室保存，培養(yǎng)液為RPMI1640含5y。滅活的犢牛血清(FCS)和青、鏈霉素各100U(ug)/mL，按常規(guī)法進(jìn)行細(xì)胞傳代。1.1.3病毒傳代病毒培養(yǎng)物接種Marcl45細(xì)胞單層，37'C孵育lh，加入含1%FCS培養(yǎng)液和青、鏈霉素各100U(iig)/mL，于37°C5%0)2培養(yǎng)72h96h，出現(xiàn)75%細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收毒，凍融3次后進(jìn)行病毒傳代，毒種于-8(TC保存?zhèn)溆谩?.2常規(guī)病毒學(xué)鑒定1.2.1血清學(xué)鑒定采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)法(IPMA)進(jìn)行病毒血清學(xué)鑒定(譚斌，劉長明，危艷武，等.PRRSV—IPMA抗體檢測試劑盒的研制及應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36(11):858-862)。PRRSV陽性血清自制，抗體效價(jià)為12800倍，用于病毒檢測；豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)參考血清用于交叉試驗(yàn)。1.2.2毒價(jià)測定不同代次病毒培養(yǎng)物進(jìn)行10倍系列稀釋，分別接種于96孔板培養(yǎng)的單層細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)4孔，同設(shè)不加病毒的正常細(xì)胞作對(duì)照，置37i:5%C02培養(yǎng)，逐日觀察記錄CPE，按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。1.2.3蝕斑克隆病毒培養(yǎng)物經(jīng)10倍系列稀釋，接種于6孔板培養(yǎng)的單層細(xì)胞，于37°C5XC02感作lh，吸出接種物后覆蓋第1層營養(yǎng)瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)72h后覆蓋第2層含0.05%中性紅營養(yǎng)瓊脂糖，挑選單斑進(jìn)行病毒克隆純化。1.2.4病毒形態(tài)觀察取分離毒株感染細(xì)胞制作電鏡切片樣品；用病毒3次凍融培養(yǎng)物，經(jīng)12000r/min離心20min，取上清液加入1%的P欣SV陽性血清混合后4"C過夜，離心取沉淀，病毒與抗體形成的免疫復(fù)合物用于制作電鏡負(fù)染樣品。上述兩種樣品進(jìn)行電鏡觀察與拍照。1.3分子病毒學(xué)鑒定1.3.1引物設(shè)計(jì)與合成參考GenBank發(fā)表的PRRSV變異株序列(EF635006)，采用DNAstar軟件設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增N印2基因引物序列Nsp2-F2508:5，-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3，(SEQIDNO.2);Nsp2-R3350:5,-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3，(SEQIDNO.3);PCR產(chǎn)物為843bp。擴(kuò)增0RF5基因引物序列0RF5-F13695:5，-AGTATGGTGGGGAAGTGCTTGAC-3，(SEQIDNO.4);ORF5-R14297:5，-GAGACGACCCCATAGTTCCGC-3，(SEQIDNO.5);PCR產(chǎn)物為603bp。1.3.2病毒RNA提取與RT-PCR鑒定用BIOZOL總RNA提取試劑盒(博日公司)從病毒培養(yǎng)液提取總RNA為模板，采用TaKaRaOneSt印RNAPCRKit(AMV)試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件RT:50°C30min，94。C2min;PCR:[94。C30s，58。C30s，72。Clmin]X35個(gè)循環(huán)，72X:延伸7min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.3.3核苷酸序列測定PCR產(chǎn)物克隆到pcDNA3.1/V5-HisTOPOTA載體上(Invitrogen)，篩選3個(gè)陽性克隆重組質(zhì)粒，純化后送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，采用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析與比較。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1病毒分離病毒血癥樣品接種Marcl45細(xì)胞帶毒盲傳3代，第4d5d出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，病變細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮、聚堆、拉網(wǎng)、破碎(圖1A)，對(duì)照細(xì)胞無明顯變化(圖1B)。分離毒株經(jīng)細(xì)胞傳代，適應(yīng)性明顯增強(qiáng)，CPE出現(xiàn)的時(shí)間提前，病變程度加重。2.2病毒蝕斑克隆對(duì)PRRSV-HBR分離株進(jìn)行了3次蝕斑克隆，形成的蝕斑直徑約12mm，挑取單斑進(jìn)行克隆純化(圖2)，將獲得的克隆毒株命名為PRRSV-HBR株。2.3血清學(xué)鑒定用克隆后的PRRSV-HBR分離株接種Marcl45細(xì)胞，經(jīng)固定后與已知PRRSV陽性血清進(jìn)行IPMA法檢測，病毒感染的細(xì)胞染成棕紅色(圖3A)，病毒抗原局限于細(xì)胞漿內(nèi)，對(duì)照細(xì)胞無著色反應(yīng)(圖3B)。IPMA檢測與其它幾種豬病毒參考血清(PCV2、CSFV、PPV、TGEV和PEDV)均呈陰性反應(yīng)，證明無其他病毒污染。2.4毒價(jià)測定PRRSV-HBR株經(jīng)細(xì)胞連續(xù)傳55代，不同代次取樣測定毒價(jià)，結(jié)果見表l。分離株隨細(xì)胞傳代次數(shù)遞增毒價(jià)顯著升高，第4555代毒價(jià)可穩(wěn)定在107'5TCID50/mL。_表lPRRSV-HBR株細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株不同代次毒價(jià)測定_代次(Passages)5101520253035404555毒價(jià)(TCID5。/mU10451048105°1055105'6106'3l(f。1073107.51072.5病毒形態(tài)學(xué)觀察免疫電鏡觀察到病毒粒子呈圓形或橢圓形外觀，也見有少量條形粒子，直徑約5055nm(圖4A);電鏡切片觀察到數(shù)十個(gè)帶囊膜的成熟病毒粒子，帶有核心，位于細(xì)胞空泡內(nèi)，直徑約50nm左右(圖4B)。2.6Nsp2與0RF5序列分析9對(duì)所分離的本發(fā)明PRRSV-HBR變異株的Nsp2與0RF5基因進(jìn)行了序列分析。結(jié)果表明，在Nsp2基因編碼的第483和535563位氨基酸存在缺失，PRRSV-HBR株屬于變異株基因群，與GenBank發(fā)表的國內(nèi)變異毒株序列HUN4-07-China(EF635006)、JXA1-06-China(EF112445)、HUB1-06-China(EF075945)核苷酸同源性均達(dá)98.3%左右。對(duì)PRRSV-HBR株第5和40代毒種進(jìn)行Nsp2基因序列比較發(fā)現(xiàn)，第40代毒種的第31163127位核苷酸發(fā)生突變，新突變毒株添加了12個(gè)堿基序列(GAGATCGCCTTT)，該序列為HBR傳代毒株特有的遺傳標(biāo)志序列。此外，對(duì)PRRSV-HBR株第5和40代毒種進(jìn)行0RF5基因序列比較發(fā)現(xiàn)，0RF5框架內(nèi)的第566位核苷酸發(fā)生點(diǎn)突變(C—T),導(dǎo)致編碼的氨基酸序列發(fā)生絲氨酸(Ser)—亮氨酸(Leu)突變。試驗(yàn)例1PRRSV-HBR毒株感染動(dòng)物試驗(yàn)一、試驗(yàn)方法選用35日齡非免疫健康仔豬9頭，PRRSV抗體檢測呈陰性，用第5代PRRSV-HBR株(實(shí)施例l所分離)培養(yǎng)物原液(1045TCID5。/mL)經(jīng)滴鼻途徑接種試驗(yàn)豬10頭，每頭劑量lmL;同設(shè)未接種病毒對(duì)照豬3頭。試驗(yàn)豬隔離飼養(yǎng)，逐日觀察臨床反應(yīng)，測定直腸體溫，每周測量體重并采集血清樣品。采用IP區(qū)法檢測血清抗體效價(jià)，RT-PCR法檢測病毒血癥。病毒接種后28d迫殺，取臟器組織進(jìn)行病理學(xué)檢驗(yàn)，冷凍切片進(jìn)行直接免疫熒光法檢測病毒抗原分布。二、試驗(yàn)結(jié)果1、臨床發(fā)病情況病毒接種后2d3d起發(fā)熱，直腸溫度達(dá)40.5。C41.5。C，持續(xù)高熱9d12d。病程前期臨床表現(xiàn)為食欲不振、精神沉郁、眼瞼水腫、皮膚充血、呼吸困難、便秘；病程后期表現(xiàn)為生長緩慢、消瘦、四肢無力、喜臥、皮膚蒼白、被毛粗亂、體表淋巴結(jié)腫大，糞便干硬并帶白色粘膜，有的排醬油色稀便。病毒接種后5d19d死亡3頭豬，發(fā)病率為100%(10/10)，死亡率為30%(3/10)。第28d迫殺時(shí)，尚有1頭試驗(yàn)豬表現(xiàn)極度消痩、皮膚極度蒼白、貧血，其余6頭逐漸耐過康復(fù)。2、病理學(xué)變化感染豬腹股溝淋巴結(jié)腫大，肺肉樣病變，腸系膜淋巴結(jié)腫大，脾臟梗死，腎於血、水腫，肝臟呈現(xiàn)灰白色壞死灶和黃疸，心包積液，腦充血水腫，胃底淤血。組織病變頜下淋巴結(jié)淋巴小結(jié)體積縮小，淋巴細(xì)胞減少呈現(xiàn)空泡狀，淋巴小結(jié)周圍伴有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，邊緣伴有出血；脾臟紅髓增生，白髓減少，動(dòng)脈周圍淋巴鞘變薄，無明顯淋巴小結(jié)；心肌纖維結(jié)構(gòu)散亂，伴有肌纖維的斷裂，纖維間有大量紅細(xì)胞；扁桃體淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞缺失、呈現(xiàn)出小空泡狀；肺臟嚴(yán)重淤血，肺泡腔內(nèi)在紅細(xì)胞，伴有黑色顆粒附著；腹股溝淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞減少，淋巴小結(jié)呈現(xiàn)小空泡狀，周圍伴有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤；肝臟間質(zhì)水腫增寬，匯管區(qū)內(nèi)有少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞無明顯壞死，竇狀隙內(nèi)有少量紅細(xì)胞；腎臟間質(zhì)輕度增寬，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤；小腸粘膜上皮壞死、脫落，固有層內(nèi)有大量嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤；腸系膜淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞壞死崩解減少。3、毒血癥、血清抗體檢測與臟器抗原分布病毒接種后第2d可檢測到病毒血癥，持續(xù)14d19d消退；接種后7d可檢測到血清抗體，28d達(dá)到高峰，抗體效價(jià)達(dá)32006400倍。直接免疫熒光法檢測感染豬多種組織臟器中病毒抗原呈陽性反應(yīng)，其中以脾、淋巴結(jié)、扁桃體及小腸組織中抗原含量較高(圖5A)。在試驗(yàn)過程中，未接種病毒對(duì)照組豬無臨床反應(yīng)，PRRSV抗原與抗體檢測均呈陰性結(jié)果。試驗(yàn)例2本發(fā)明PRRSV-HBR毒株在直接免疫熒光診斷方法中的應(yīng)用1、試驗(yàn)材料與方法1.1毒株、細(xì)胞系、試劑PRRSV-HBR變異毒株為實(shí)施例1所分離鑒定；MARC-145傳代細(xì)胞系用于病毒增殖，異硫氰酸熒光素(FITC)、TritonX-100、伊文思藍(lán)均為Sigma產(chǎn)品，NP-40為Amresco產(chǎn)品，抗熒光衰減封片劑為北京普利萊產(chǎn)品，其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。1.2豬抗PRRSV高免血清的制備用PRRSV-HBR毒株第5代培養(yǎng)物(1045TCID5。/mL)經(jīng)滴鼻途徑接種35日齡PRRSV抗體陰性的非免疫健康仔豬3頭，劑量為lmL/頭。攻毒耐過豬于第5周頸靜脈采血，采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)(IPMA)測定血清抗體效價(jià)，達(dá)到l:12800者用于抗體純化和熒光標(biāo)記。1.3免疫球蛋白(IgG)的提取與熒光素標(biāo)記采用硫酸銨鹽析法提取血清中IgG，純化的IgG進(jìn)行FITC熒光標(biāo)記，在280nm、495nm波長下測定標(biāo)記抗體的OD值，計(jì)算F/P值(吸光值比率)，選取適當(dāng)組分合并，加入終濃度0.02%疊氮鈉分裝，4'C避光保存。1.4PRRSV-DIFA操作程序1.4.1病毒感染單層細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測MARC-145細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板內(nèi)形成單層，按1%毒種劑量接種PRRSV-HBR株毒種，置37'C5y。C02培養(yǎng)24h。病毒感染細(xì)胞經(jīng)PBS浸洗1次，用33%丙酮-PBS液室溫下固定20min。細(xì)胞干燥后用PBS浸洗1次，每孔加入50uL含伊文思藍(lán)-PBS稀釋的標(biāo)記抗體工作液，置濕盒內(nèi)37'C感作一定時(shí)間取出。輕輕倒掉熒光抗體染液并用濾紙吸干，用PBS洗3次，每次5min，再用蒸餾水洗lniin。每孔加入50"L抗熒光衰減封片劑，用熒光倒置顯微鏡觀察與拍照。同設(shè)未接種病毒健康細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照。1.4.2病毒感染動(dòng)物組織冷凍切片的檢測取PRRSV-HBR毒株第5代感染豬臟器，用冷凍切片機(jī)制作5um組織切片，固定后自然干燥。將切片置PBS中浸洗10min，用組織通透劑處理。于每張切片上滴加lOOuL含伊文思藍(lán)-PBS稀釋的標(biāo)記抗體工作液，置濕盒內(nèi)37。C感作一定時(shí)間取出。排干殘留反應(yīng)液，用PBS浸洗3次，每次5min，再用蒸餾水浸洗2min。用濾紙吸去多余水分，每張切片滴加一滴抗熒光衰減封片劑，封片后用熒光倒置顯微鏡觀察與拍照。同設(shè)未感染病毒的健康豬臟器組織作為陰性對(duì)照。1.5PRRSV-DIFA反應(yīng)條件的優(yōu)化1.5.1固定劑與固定條件的選擇用己知人工感染豬淋巴組織切片對(duì)7種固定劑及固定方法進(jìn)行篩選，確定DIFA固定條件。1.5.2切片組織的通透劑處理PRRSV-HBR毒株人工感染豬淋巴結(jié)組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定后，分別用0.5%、1%、2%TritonX-100或NP-40分別處理5min、10min、20min，比較兩種試劑組織通透效果。1.5.3熒光抗體工作濃度和反應(yīng)條件的確定將標(biāo)記的熒光抗體按1:81:256系列稀釋，分別與已知病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行熒光染色，確定熒光抗體使用效價(jià)。熒光抗體工作濃度確定后，對(duì)抗體感作時(shí)間(30min、45min、60min)進(jìn)行測定。1.5.4伊文思藍(lán)工作濃度的確定分別用含0.01%0.001%伊文思藍(lán)的0.01mol/LPBS緩沖液(pH7.4)稀釋熒光抗體，對(duì)已知病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行熒光染色，確定伊文思藍(lán)襯染濃度。1.6PRRSV-DIFA特異性、敏感性、重復(fù)性及保存期用本方法對(duì)已知幾種豬病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行抗原交叉反應(yīng)試驗(yàn)，其中包括豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)。對(duì)己知PRRSV感染豬和健康對(duì)照豬的臟器組織切片進(jìn)行了檢測，檢驗(yàn)該方法的特異性和敏感性。取同批次PRRSV感染細(xì)胞培養(yǎng)板，在相同條件下不同時(shí)間進(jìn)行DIFA檢測，檢驗(yàn)本方法的重復(fù)性。在4"C條件下保存熒光抗體試劑至l、3、6個(gè)月進(jìn)行檢測，測定其保存期。1.7PRRSV-HBR毒株繁殖動(dòng)力學(xué)測定用1%PRRSV-HBR毒株毒接種96孔板培養(yǎng)的MARC-145細(xì)胞單層，接毒后0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、60h、72h、96h逐一取出固定。按DIFA操作進(jìn)行病毒繁殖動(dòng)力學(xué)測定。1.8人工感染豬及臨床病料采集選用35日齡非免疫健康仔豬15頭，經(jīng)IPMA法檢測PRRSV抗體陰性，用PRRSV-HBR毒株第5代病毒培養(yǎng)物(1045TCID5。/mL)，經(jīng)滴鼻途徑接種試驗(yàn)豬12頭，劑量lmL/頭；同設(shè)未攻毒健康對(duì)照豬3頭。病毒接種后28d迫殺，采集心、肝、脾、肺、腎、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體、腦等臟器，制作冰凍切片。臨床病料來自山東、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江等10個(gè)豬場送檢的38份病料。以上組織樣品用PRRSV-DIFA進(jìn)行檢測。1.9與RT-PCR方法比較試驗(yàn)按常規(guī)方法對(duì)PRRSV感染豬臟器病料進(jìn)行了RT-PCR法與DIFA平行檢測和結(jié)果比較，計(jì)算兩種方法的符合率。2試驗(yàn)結(jié)果2.1PRRSV-DIFA反應(yīng)條件的確定通過反復(fù)試驗(yàn)，最終確定病毒細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)33。/。丙酮-PBS固定20min、伊文思藍(lán)襯染濃度為0.002%，熒光抗體工作濃度為1:32稀釋，感作時(shí)間45min;組織冷凍切片采用甲醇一丙酮固定法，1%NP_40通透10min，伊文思藍(lán)襯染濃度為0.002%，熒光抗體工作濃度為l:32稀釋，感作時(shí)間為45min，為最佳反應(yīng)條件。用優(yōu)化的反應(yīng)條件對(duì)已知病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物和組織切片進(jìn)行熒光抗體試驗(yàn)，鏡下觀察到特異性黃綠色熒光較清晰，陽性細(xì)胞形態(tài)保持較好，組織背景和未被病毒感染的陰性細(xì)胞呈暗紅色，無非特異性熒光。用不同固定劑及固定方法染色效果的比較結(jié)果見表2。_表2用7種固定劑進(jìn)行的PRRSV-DIFA檢測結(jié)果的比較_固定劑固定方法免疫熒光檢測結(jié)果效果評(píng)價(jià)甲醇一丙酮冷甲醇固定10min后，陽性細(xì)胞數(shù)適中，熒光亮度適中，優(yōu)用冷丙酮固定lmin組織細(xì)胞形態(tài)較好50%甲醇50%丙酮室溫固定10min陽性細(xì)胞數(shù)適中，熒光亮度適中，優(yōu)組織細(xì)胞形態(tài)較好60%丙酮40%乙醇一20'C固定5min組織細(xì)胞形態(tài)不很完整，熒光亮度稍良辱辱100%丙酮一20'C固定5min陽性細(xì)胞數(shù)較少，熒光亮度較強(qiáng)一般100%甲醇一20'C固定5min可保持細(xì)胞形態(tài)，熒光亮度減弱一般4%多聚甲醛室溫固定2min組織細(xì)胞形態(tài)保持較好，但熒光亮度差萄每95%乙醇5%乙酸一2(TC固定5min陽性細(xì)胞數(shù)極少，熒光強(qiáng)度極微弱差2.2PRRSV-DIFA特異性、敏感性、重復(fù)性及保存期試驗(yàn)用PRRSV-DIFA法僅與PRRSV感染細(xì)胞呈陽性反應(yīng)結(jié)果，而與PCV2、CSFV、PPV、PRV、TGEV、PEDV感染細(xì)胞無抗原特異性交叉反應(yīng)，同設(shè)各病毒抗原陽性對(duì)照組成立。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)熒光抗體做1:128稀釋后，仍能檢測到陽性細(xì)胞，敏感性較好。經(jīng)5次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該免疫熒光試驗(yàn)檢測結(jié)果穩(wěn)定，檢測的陽性細(xì)胞數(shù)量及熒光強(qiáng)度無較大變化，具有良好的重復(fù)性。保存期試驗(yàn)證明，該熒光抗體在4'C條件下保存6個(gè)月后，其抗體效價(jià)仍保持穩(wěn)定。2.3病毒繁殖動(dòng)力學(xué)檢測病毒感染單層細(xì)胞后4h12h，未能檢測到特異性陽性細(xì)胞；感染后16h開始出現(xiàn)單個(gè)陽性細(xì)胞，表明病毒抗原已完成復(fù)制與裝配；感染后20h，病毒從感染細(xì)胞中釋放，以初始感染細(xì)胞為中心，向周圍鄰近細(xì)胞擴(kuò)散，繼續(xù)增殖；感染后24h60h，陽性細(xì)胞逐漸增多，多數(shù)細(xì)胞在胞槳和胞膜上出現(xiàn)黃綠色特異熒光；感染后72h，幾乎所有細(xì)胞均被感染；感染96h后，細(xì)胞出現(xiàn)崩解，病毒釋放。同設(shè)的未感染病毒健康細(xì)胞均呈陰性結(jié)果。PRRSV-DIFA法檢測病毒繁殖動(dòng)力學(xué)結(jié)果見圖6。2.4人工感染豬臟器組織抗原檢測用PRRSV-DIFA法對(duì)12頭病毒感染豬的12種不同組織樣品檢測結(jié)果見表3。病毒抗原陽性檢出率最高的組織為腹股溝淋巴結(jié)、空腸和睪丸(100%);其次為脾臟、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)和扁桃體(91.7%);肺臟和肝臟檢出率較低(41.7%和33.3%);心、腎、腦均呈陰性。按平均熒光強(qiáng)度排序依次為空腸、腹股溝淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、睪丸、扁桃體、肺臟、肝臟。本試驗(yàn)對(duì)病毒人工感染豬臟器組織抗原檢測結(jié)果表明，以腹股溝淋巴結(jié)和空腸最為敏感(12/12)，其敏感性均達(dá)到100%。同設(shè)的3頭健康對(duì)照豬各臟器組織切片檢測結(jié)果均為陰性(36/36)，其特異性為100%。表3PRRSV-DIFA法對(duì)人工感染豬各組織臟器病毒抗原檢測結(jié)果臟器組織名稱樣品陽性數(shù)平均熒光強(qiáng)度*陽性數(shù)/樣品總數(shù)陽性檢出率心臟0o扁0/120%肝臟40.1674/1233.3%脾臟111.12511/1291.7%肺臟0.2925/1241.7%腎臟00.0000/120%下頜淋巴結(jié)111.54211/1291.7%腸系膜淋巴結(jié)111.50011/1291.7%15腹股溝淋巴結(jié)122.04212/12100%空腸112.45511/11100%扁桃體110.79211/1291.7%腦00.0000/70%睪丸31.0003/3100%*熒光強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn)以陰性樣品判為0;陽性細(xì)胞比例占整個(gè)視野的030%判為1;占3060%判為2;占>60%判為3;達(dá)100%判為4。每個(gè)樣品熒光強(qiáng)度值之和/被檢樣品總數(shù)=平均熒光強(qiáng)度。2.5人工感染豬病毒抗原分布特點(diǎn)PRRSV-HBR毒株感染豬臟器組織病毒抗原分布有如下特點(diǎn)在空腸的腸絨毛內(nèi)和固有層的腸腺周圍陽性細(xì)胞較集中。在腹股溝淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，陽性細(xì)胞位于淋巴結(jié)邊緣、被膜結(jié)締組織中及淋巴小結(jié)外。在脾臟，陽性細(xì)胞位于脾小梁周圍、白髓的中央動(dòng)脈周圍和脾小結(jié)外。在扁桃體的隱窩兩側(cè)、淋巴小結(jié)周邊及結(jié)締組織中陽性細(xì)胞較集中。在肺臟和肝臟中，陽性細(xì)胞數(shù)量較少，在肺泡、氣管支氣管周圍、肝索中陽性細(xì)胞零星散在分布，肝小葉邊緣、匯管區(qū)相對(duì)集中。選擇其中一頭感染豬的12種臟器組織切片DIFA檢測結(jié)果見圖7。2.6DIFA與RT-PCR檢測符合率用PRRSV-DIFA和RT-PCR法對(duì)來自感染豬和健康對(duì)照豬135份樣品進(jìn)行了平行檢測。用RT-PCR檢測出80份陽性和55份陰性；DIFA法檢測出79份陽性和56份陰性。RT-PCR陽性樣品中DIFA檢測陰性者3份，RT-PCR陰性樣品中DIFA檢測為陽性樣品者2份。兩種方法檢測均為陽性77份，均為陰性53份。二種方法總符合率為96.3%。2.7臨床發(fā)病豬樣品檢測用PRRSV-DIFA法對(duì)來自山東、內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江等地10個(gè)豬場送檢的38份臨床發(fā)病豬樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表4。其中3個(gè)豬場送檢的病料陽性檢測率達(dá)75.0%;5個(gè)豬場陽性檢出率達(dá)66.7%;IO個(gè)豬場平均陽性檢出率達(dá)63.2%(24/38)。由此可見，我國部分豬場PRRSV感染情況較為嚴(yán)重。表4DIFA法對(duì)臨床發(fā)病豬組織樣品PRRSV抗原檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所<120>高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株及其應(yīng)用<130>KLPI08087<160>5<170〉Patentlnversion3.1<210><211><212><213>112DNAPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus<400〉1gagatcgccttt<210〉2<211>25<212>DNA<213>人工序劌12<400>2accatgg3gg3ggatctgct33站c<210〉3<211>21<212>DNA<213>人工序列25<400>3ctggtaagcagacgtgttgcg<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>421agtatggtggggaagtgcttgac23<210〉5<211>21<212〉DNA<213>人工序列<400>5gagacgaccccatagUccgc2l權(quán)利要求1、一株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)變異株，其特征在于所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的Nsp2序列中第483和535～563位氨基酸存在缺失；其傳代毒株的Nsp2基因的第3116～3127位核苷酸發(fā)生突變，添加了SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2、按照權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株，其特征在于:其第5代和40代毒種0RF5框架內(nèi)的第566位核苷酸由C突變?yōu)門。3、按照權(quán)利要求1所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株，其特征在于其微生物保藏號(hào)是CGMCC.2657。4、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株在制備預(yù)防或治療豬繁殖與呼吸綜合征疫苗中的用途。5、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株在制備鑒別或診斷豬繁殖與呼吸綜合征試劑中的用途。全文摘要本發(fā)明公開一株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC.2657。本發(fā)明從臨床“高熱綜合征”病例分離到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株，經(jīng)細(xì)胞傳代和蝕斑克隆，培育得到增殖性能穩(wěn)定的新毒株。本發(fā)明新毒株Nsp2序列中第483和535～563位氨基酸存在缺失，屬PRRSV變異株。該毒株第40代毒種序列的第3116～3127位核苷酸發(fā)生突變，添加了12個(gè)堿基序列。通過靶動(dòng)物感染試驗(yàn)及免疫學(xué)檢測，證實(shí)本發(fā)明毒株具有高致病性和遺傳變異性，該毒株帶有遺傳標(biāo)志，體外繁殖能力穩(wěn)定，對(duì)新型疫苗的研制具有重要參考價(jià)值，也為今后病毒致病機(jī)理、遺傳變異、鑒別診斷及分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。文檔編號(hào)A61P31/14GK101423821SQ20081017365公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年11月5日優(yōu)先權(quán)日2008年11月5日發(fā)明者劉長明,危艷武,張朝霞,婧袁,黃立平申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所