專利名稱：一種基于人源化抗體的用于腫瘤診斷的磁共振對比劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種用于腫瘤診斷的磁共 振對比劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)制備了很多針對腫瘤相關(guān)標(biāo)志的單克隆 抗體，抗體在腫瘤治療中起到越來越重要的作用。要使抗體治療發(fā)揮更有效的 作用，必須明確病人腫瘤的分子分型。尤其是對于不適合手術(shù)的病人，研究敏 感的無創(chuàng)診斷手段用于腫瘤分子診斷特別重要。
磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging, MRI)是一種可反復(fù)使用 的無創(chuàng)診斷技術(shù)，具有很好的空間分辨率和對比度。常規(guī)的MRI對于腫瘤組織 與正常組織的分辨能力仍然不夠，因此必須研究新的成像方法，將具有腫瘤靶 向性能的分子探針交聯(lián)于合適的MRI成像對比劑，即可能通過MRI對腫瘤進(jìn)行 分子影像診斷，這要求選擇合適的高效對比劑和高特異性的腫瘤探針。
納米粒子在生物醫(yī)學(xué)中已有廣泛應(yīng)用，超細(xì)超順磁性氧化鐵顆粒 (ultrasmall superparamagnetic iron oxide particle, USPIO)用作MRI成像 對比劑的研究已有超過十年的歷史，與傳統(tǒng)的MRI成像對比劑釓劑相比，USPIO 有低毒性，高敏感性的優(yōu)點(diǎn)。近來，人們還通過對USPIO的結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行優(yōu) 化，制備出比傳統(tǒng)USPIO磁性更強(qiáng)的USPIO。 USPIO作為MRI成像對比劑，已被 用于胃腸道、肝臟、脾臟的成像，以及良、惡性淋巴結(jié)腫大的鑒別，但在這些應(yīng)用中，USP工O是通過被動靶向被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而發(fā)揮增強(qiáng)作用的，不 能用于腫瘤的分子分型。
目前用于研制腫瘤靶向MRI對比劑的腫瘤耙向探針較少，主要是幾種抗體
及其他的特異性不高的受體類分子，如黃體生成素、葉酸等。突出的問題是耙 向性不高，特異性差。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人將人源化的SM5--1單克隆抗體交聯(lián)至 制備的納米粒子USPIO上，制備得到具有靶向性的MRI對比劑，命名為SM-USPIO。 通過流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微鏡觀察及體外培養(yǎng)細(xì)胞的MRI證實(shí)在體外SM-USP10 可通過交聯(lián)的抗體與SM5-1抗原陽性的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，并可被腫瘤細(xì)胞 內(nèi)吞；荷瘤小鼠體內(nèi)注射SM-USP工O后，MRI結(jié)果顯示腫瘤組織的T2信號明顯降 低，因此SM--USP工O可用于SM5-1抗原陽性腫瘤的體內(nèi)診斷。
更具體地，本發(fā)明公開了
1. 一種基于人源化抗體的磁共振對比劑SM-USPIO，為人源化SM5-1抗 體與超順磁性氧化鐵顆粒USP工O交聯(lián)而得。
2. 上述1所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，包括以下步驟 步驟a:制備超順磁性氧化鐵顆粒USPIO，
步驟b:制備人源化抗體，
步驟c:制備磁共振對比劑SM-USPIO。
3. 上述2所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中步驟a中超 順磁性氧化鐵顆粒USPIO的制備通過共沉淀方法得到.-
步驟A:將葡聚糖溶解于水中，加入鐵鹽，攪拌；步驟B:在加熱的條件下將聚乙烯醇溶解在水中；
步驟C:將步驟B得到的溶液加入歩驟A得到的溶液中混合，用堿 調(diào)pH至10 — 12，繼續(xù)攪拌后加熱得到沉淀； 歩驟D:收集沉淀物并對其進(jìn)行后處理。
4. 上述3所述的磁共振對比劑SM--USPIO的制備方法，其中步驟A中使 用的鐵鹽為FeCl:,'6H20和FeS0WH20，其中三價鐵和二價鐵的摩 爾比是為3: 2。
5. 上述3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中步驟C中所 述的堿為氨水。
6. 上述3所述的磁共振對比劑SM- USPIO的制備方法，其中步驟D中利 用磁場收集沉淀物。
7. 上述3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中后處理步驟 包括利用水洗、用檸檬酸溶液重懸沉淀、超聲、在去離子水中透析 去除多余的檸檬酸。
8. 上述2所述的磁共振對比劑SM--USPIO的制備方法，其中步驟c制備 磁共振對比劑SM-USPIO的歩驟包括將UPSIO進(jìn)行活化，分離活化后 的粒子，將粒子和含抗體的PBS混合，攪拌，經(jīng)磁柱處理而得。
9. 上述1的磁共振對比劑SM-USPIO在腫瘤診斷方面的用途。
10. 上述9的用途，其中腫瘤為SM5-l結(jié)合蛋白陽性的腫瘤。 本發(fā)明的發(fā)明人將人源化的SM5-1抗體與共沉淀法獲得的超順磁性氧化鐵
顆粒(USPIO)交聯(lián)，獲得了一種納米尺度的靶向MRI對比劑，命名為SM-USPIO。 其平均水化直徑為25. 3nm，該納米尺度保證了它的體內(nèi)長循環(huán)周期及靶向效率本發(fā)明的發(fā)明人利用多種方法檢測了 SM--USPIO特異性結(jié)合能力。流式細(xì)胞 術(shù)結(jié)果顯示，與游離的人源化SM5-1單克隆抗體相比，SM-USPIO具有相似的與 SM5-1結(jié)合蛋白陽性人肝癌細(xì)胞ch-h印-3結(jié)合的能力，而對照品H-USPIO的結(jié) 果是陰性的。在不同細(xì)胞株中，SM-USPI0處理后的平均熒光強(qiáng)度與各細(xì)胞的 SM5-1結(jié)合蛋白的表達(dá)水平正相關(guān)；共聚焦顯微鏡的結(jié)果顯示SM-USPIO可特異 性結(jié)合于SM5-1結(jié)合蛋白陽性的腫瘤細(xì)胞，且可被該細(xì)胞內(nèi)吞。MRI檢測證實(shí) SM-USPIO處理過的陽性腫瘤細(xì)胞有明顯的T2信號減弱，而對照對比劑H-USPIO 及空白對比劑USPIO加人源化SM5-1單克隆抗體無此效果。以上的結(jié)果提示 SM-USPIO可通過抗體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入并積累于SM5-1結(jié)合蛋白陽性人肝癌 細(xì)胞；荷瘤小鼠內(nèi)注射SM-USPI0后山現(xiàn)腫瘤區(qū)域的T2信號減弱，且1251標(biāo)記的 SM-USPIO也明顯聚集于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，因此，在體內(nèi)SM-USPIO同樣能通過抗體介 導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入并積累T腫瘤局部，發(fā)揮MRI造影對比劑的作用。
上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，交聯(lián)了人源化SM5-1單克隆抗體的USPIO可用于 SM5-1結(jié)合蛋白陽性的腫瘤的診斷。
其他有腫瘤高特異性靶向抗體也可以按本發(fā)明公開的方法和USPIO進(jìn)行交 聯(lián)從而應(yīng)用于腫瘤的診斷，這些腫瘤高特異性靶向抗體包括但不限于 高親和力抗Her-2單克隆抗體、高親和力抗EGFR單克隆抗體等。


圖1: SM-USPIO透射電鏡檢測的照片和激光散射粒徑分析儀測定SM-USPIO 的粒徑，圖l一l: SM-USPIO透射電鏡檢測的照片，顯示粒子核徑在8 — 10nm之 間，圖l一2:激光散射粒徑分析儀測定SM-USPIO的粒徑，顯示其水合半徑為 25. 3土2. lnm。圖2:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，圖2 — 1: ch-hep-:3細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，其中 深色虛線代表PBS處理組，細(xì)實(shí)線為H-USP工0處理組，粗實(shí)線為SM-USPIO處理 組，而淺色虛線為游離抗體處理組，圖2 — 2: SM-USP工O與三種不同的細(xì)胞結(jié)合 能力的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，圖2-2-1為ch-h印-1細(xì)胞，圖2-2-2為ch-h印-6細(xì) 胞，圖2-2-3為ch-h印-3細(xì)胞，其中淺色實(shí)線代表PBS處理的細(xì)胞，深色實(shí)線 代表SM-]SPIO。
圖3:共聚焦顯微鏡檢SM5-1結(jié)合蛋白內(nèi)吞結(jié)果，其中A為PBS處理的細(xì)胞， B為SM-USPIO處理的細(xì)胞，C為H-USPIO處理的細(xì)胞；第一列為熒光視野，第 二列為相差視野，第三列為二者疊加。
圖4:磁共振成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖示為其矢狀位T2加權(quán)圖像。從左到右分別 是ch-h印-l、 ch-h印-6和ch-h印-3，每種細(xì)胞從上到下各層分別是經(jīng)PBS、 USPIO、 USPI0 +游離抗體、SM-USPIO和H-USPIO處理的樣品。
圖5:體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖為其T2加權(quán)圖像。第一行為注射SM--USPIO的 動物，第二行為注射H USPT()的動物，第一列為注射前的圖像，第二列為注射 后8小時的圖像，第三列為注射后72小時的圖像。
圖6:體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖6 — 1為8小時處死組動物的臟器放射性分布結(jié) 果，圖6 — 2為72小時處死組動物的臟器放射性分布結(jié)果，圖6 — 3為,標(biāo)記的 SM-USPIO和^I標(biāo)記的HHJSPIO在血液屮的清除曲線。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例、實(shí)驗(yàn)例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明 的限制。
材料與方法
8細(xì)胞、抗體及其他材料
肝癌細(xì)胞系ch-h印1、 ch h印-3和ch-hep 6由第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所 建立并提供，這些細(xì)胞系各自的SM5 ]結(jié)合蛋白的表達(dá)水平不同，其中ch-h印-3 高表達(dá)，ch-h印-6中等水平表達(dá)，而ch-h印-l為陰性，其公開資料參見Zhao J， Wang H, Wei L， et al. The cytotoxic effect of EIB 55-kDa mutant adenovirus on human hepatocellular carcinoma cell lines, Cancer Gene Ther 2001; 8:333-341，人源化的SM5-l抗體按文獻(xiàn)方法制備Li B, Wang H， Zhang D， et al. Construction arid characterization of a high—affinity humanized SM5—1 monoclonal antibody. Biochcm Biophys Res Commun 2007; 357:951-6。 FITC 標(biāo)記的羊抗人IgG (H十L)購自Zymed公司(San Francisco, CA)。人源化的 anti-Her2抗體按照中國發(fā)明專利申請?zhí)?1132225.X，發(fā)明名稱為《人源化抗 服R2單克隆抗體及其制法和藥物組合物》中公開的方法制備。實(shí)驗(yàn)中用到的有 機(jī)溶劑均為HPLC級，其他試劑均為可購買到的最高級別。
實(shí)驗(yàn)用小鼠為6 — 8周齡的Balb/c裸鼠(18 — 22克)購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動物中心，按 SPF級別飼養(yǎng)于該中心。所有動物實(shí)驗(yàn)均獲得第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)。
透射電鏡JEM-100CX，日本JE0L公司；
激光散射粒徑分析儀Zeta Sizer 3000HS， Malvern Instruments, UK; 流式細(xì)胞儀Becton _ Dickinson, San Jose, CA; 共聚焦顯微鏡Zeiss CLSM 510， 德國Zeiss公司；
4.7T Bruker Biospec" "小動物磁共振成像系統(tǒng)Bruker Biosciences, Germany;
9伽馬計(jì)數(shù)器HPGe ADCAMTM918型，美國ORTEC公司。 實(shí)施例l USPIO， SM-USPIO及H-USPIO的制備
USPIO是在含有葡聚糖的溶液中通過共沉淀方法制備的，它包括氧化鐵的核 心及外層包裹的低分子量的葡聚糖。1克葡聚糖(分子量40kDa)溶解于15ml 去離子水中，加入FeCb 6I-W) 24. 35mg和FcSO., 7^0 16. 68mg，在氮?dú)獗Ｗo(hù) 下攪拌。聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol,分子量]750±50)在8(TC的條件下 加入去離子水中配制飽和溶液，取10ml與上述溶液混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)和持續(xù)攪 拌的情況下，滴加7X的氨水調(diào)節(jié)pH至10—12。當(dāng)有黑色氧化鐵顆粒出現(xiàn)后， 繼續(xù)攪拌10分鐘，之后加熱至85。C維持60分鐘；通過磁場收獲沉淀物，去離 子水洗滌數(shù)遍以去除可溶性鐵離子。用檸檬酸溶液(1克檸檬酸溶解于30ml去 離子水)30ml重懸沉淀，700w超聲20分鐘，得到的產(chǎn)物于1L去離子水中透析 48小時以去除多余的檸檬酸；最終，獲得的USPIO按鐵濃度調(diào)整至0.25mol/L 備用。
人源化的SM5-1抗體按下述方法交聯(lián)于制備的人源化的SM5-皿1抗體上，抗體 按5mg/ml的濃度溶解于pH 7.4的PBS (5醒ol/L磷酸鹽，0.9%氯化鈉)中，EDC (l-Ethyl-3--[3-dimethylami卿ropyl]carbodiimide Hydrochloride,卜乙基 -3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)和NHS (N-hyd皿ysu丄fosuccinimide, N— 羥基琥珀酰亞胺)均按50 mg/m]的濃度溶解于pH 6. 0的PBS (5ramol/L磷酸鹽， 0.9%氯化鈉)中，取lml USPI0懸液，與上述EDC/NHS溶液2. 5ml混合，室溫?cái)?拌30分鐘以活化粒子；之后反應(yīng)液上PD-IO脫鹽柱去除多余的活化劑，分離活化 后的粒子，粒子分散于3ml的PBS中，立即加入300pl上述制備的抗體，室溫?cái)嚢?2小時，粒子經(jīng)磁柱(Miltenyi Biotech GmbH， Germany)(按說明書操作，不超過磁柱流速限制)并去離子水洗多遍以去除未結(jié)合的抗體，最后結(jié)合了人源
化的SM5-l抗體的USPIO (命名為SM-USPIO)重懸于pH7. 4的10mmol/L PBS中， 并再次按鐵濃度調(diào)整至O. 25mol/L備用。未結(jié)合的SM5- l人源化抗體的濃度通過 MicroBCA蛋白測定試劑盒(Pierce， Rockford， IL)測定磁柱流穿上清中的蛋 白濃度獲得，并可因此計(jì)算出抗體的交聯(lián)效率及粒子上抗體的交聯(lián)量；相同的 方法在USPIO上交聯(lián)人源化anti-Her2抗體，獲得粒了命名為H--USPIO。
納米粒子的粒徑和結(jié)構(gòu)通過透射電鏡和激光散射粒徑分析儀獲得。 透射電鏡結(jié)果顯示SM-USPI0的鐵核直徑為8-10mn (圖1-1)，激光散射粒 徑分析儀顯示其水合半徑為25. 3±2. lnm(98。/。在17服 50皿之間)(圖1-2)。 SM-USPIO調(diào)整至濃度為14mg Fe/ml，即0. 25mmol/ml的鐵濃度保存，抗體濃度 為10±2|_ig/mg Fe，抗體的交聯(lián)率為60%;保存時，體系中添加了 4. 16mg/ml 的檸檬酸水溶液及60mg/ml的甘露醇作為穩(wěn)定劑；結(jié)果證明SM-USPIO在室溫條 件下可穩(wěn)定6月。
實(shí)驗(yàn)例l靶向USPIO的放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
通過氯氨一T方法(Hunter WM， Greenwood FC (1962). Preparation of iodine, mI-labelled human growth hormone of high specific activity. Nature 194: 495—496 )用125工-Na對SM-USPIO和H-USPIO進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后仍采用磁柱 (Miltenyi Biotech GmbH， Germany)分離去除游離的125I-Na ，標(biāo)記后的 SM-USPIO和H--USPIO用于代謝實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)例2流式細(xì)胞術(shù)檢測SM-USPI0與SM5-l結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合活性實(shí) 驗(yàn)
lX10(i /ml的細(xì)胞(ch-hcp-3)與0. lml的PBS fC孵育l小時，分別含有10)ug/ml的人源化SM5-1、 SM USPIO或H-USPIO (均以抗體量計(jì)算，包括游離的和 結(jié)合在粒子上的)，細(xì)胞洗滌后與FITC標(biāo)記的羊抗人IgG (H + L) 4。C孵育30分 鐘，細(xì)胞再次洗漆后用FACScan流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。
結(jié)果表明見圖2-1，結(jié)果表明用H-USPIO處理的細(xì)胞與PBS處理組之間無 顯著性差異，SM-USPIO及人源化SM5-1抗體處理的ch-h印-3細(xì)胞顯示有很高的 熒光強(qiáng)度，而PBS和H-USPIO處理組均為陰性，提示SM USPIO和SM5-1結(jié)合蛋 白的結(jié)合能力與游離抗體相似，該結(jié)果提示人源化SM5-1抗體結(jié)合到USPIO后 依然保持了其與SM5'1結(jié)合蛋白的高親和力。
之后，我們又在三株SM5-1結(jié)合蛋白表達(dá)水平不同的人肝癌細(xì)胞ch-h印-l、 ch-h印-3、 ch-h印-6上檢測了 SM-USPIO的結(jié)合能力(方法同上)，結(jié)果如圖 2-2所示，結(jié)果表明SM-USPIO處理的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與細(xì)胞的SM5-1結(jié)合 蛋白表達(dá)水平相吻合。Ch-h印3的SM5-1結(jié)合蛋白表達(dá)水平最高，其平均熒光 強(qiáng)度也最高；ch-h印-1的SM5-1結(jié)合蛋白表達(dá)陰性，其平均熒光強(qiáng)度為陰性； ch h印-6的SM5■ l結(jié)合蛋白表達(dá)水平中等，其平均熒光強(qiáng)度介于二者之間。該 結(jié)果顯示SVhUSPIO與靶細(xì)胞結(jié)合具有良好的特異性。 實(shí)驗(yàn)例3利用共聚焦顯微鏡檢測SM5-1結(jié)合蛋白內(nèi)吞SM-USPIO實(shí)驗(yàn)
為驗(yàn)證Ch-h印-3細(xì)胞是否會通過SM5-1結(jié)合蛋白內(nèi)吞SM-USPIO，我們對其進(jìn) 行了共聚焦顯微鏡觀察Ch-h印-3細(xì)胞(lX10s)與10嗎/ml的SM-USPIO、 H-USP1U 或PBS (以抗體量計(jì))各O. lml 3TC共孵育1小時，PBS洗滌，以4%多聚甲醛4丌 固定10分鐘，之后以O(shè). 1% TritonX 100室溫孵育5分鐘進(jìn)行破膜處理，隨后以l %的牛血清白蛋白封閉30分鐘；再與FITC標(biāo)id的羊抗鼠lgG在室溫下孵育2小時， PBS洗滌，細(xì)胞經(jīng)固定、封片并通過Zeiss 510激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍攝照片。
結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明ch h印--3細(xì)胞單純與FITC標(biāo)記的二抗孵育， 細(xì)胞無明顯背景熒光出現(xiàn)，但在二抗孵育前，細(xì)胞與SM-USPI0在37'C共孵育1 小時，則在細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的熒光，而H-USPIO處理的細(xì)胞則與陰性細(xì)胞 無差異，這說明SM-USPTO可特異性地與ch-七印--3細(xì)胞結(jié)合并被細(xì)胞內(nèi)化。 實(shí)驗(yàn)例4磁共振成像實(shí)驗(yàn)
對于體外成像，1Xia'的細(xì)胞(分別為ch-h印-1， ch-h印-3， ch-h印-6)在 37。C條件下與以下成分孵育l小時SM-USP1:0、 II USPIO、 USPIO、 USPIO加人源 化SM5-1抗體及PBS，細(xì)胞經(jīng)三次洗滌，胰酶消化后以4%多聚甲醛固定，1000rpm 離心5分鐘使之在離心管中成為一個細(xì)胞團(tuán)，在上面添加一層1%瓊脂糖。不同 條件的同一種細(xì)胞收集在同一管的不同層面。磁共振成像在4.7T Bruker Biospec",小動物磁共振成像系統(tǒng)上進(jìn)行，采用螺旋回波序列。對于T2加權(quán)矢 裝位圖像，采用以下成像參數(shù)matrix二128X 128iim, F0V=45X45mm， section thickness二l鵬，TE=45ms , TR二3000ms， number of average=l。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，顯示的是瓊脂糖中細(xì)胞團(tuán)矢狀面的T2加權(quán)圖像。細(xì) 胞收集前與5(Vg/ml的SM-USPIO(按鐵含量計(jì)算)孵育1小時，對照組包括PBS、 USPIO、 H-USPIO及USPI0加人源化SM5-1抗體，其濃度均按鐵含量或抗體量計(jì) 算，與SM-USPIO劑量一致。在ch-h印-3細(xì)胞管的圖像上，SM-USPIO處理的細(xì) 胞團(tuán)顯示明顯的低信號，而其他四個細(xì)胞團(tuán)均表現(xiàn)為高信號。在ch-h印-l細(xì)胞 管的圖像上，5個細(xì)胞團(tuán)顯示相同的高信號。在ch-h印-3細(xì)胞管的圖像上， SM-USPIO處理的細(xì)胞團(tuán)的信號較其它四個細(xì)胞團(tuán)的信號略低，但遠(yuǎn)沒有對應(yīng)的 ch-h印-3細(xì)胞的明顯。在三種細(xì)胞中，USPIO加人源化SM5-1抗體處理的細(xì)胞均沒有出現(xiàn)信號的下降，這說明在相對短的培養(yǎng)時間內(nèi)，細(xì)胞既不能主動吞噬
游離的USPIO，游離的人源化SM5-1抗體也不會介導(dǎo)細(xì)胞吞噬USPIO。因此，只 有交聯(lián)了人源化SM5-1抗體的USP工0才會被SM5--1結(jié)合蛋白陽性的細(xì)胞特異性 地結(jié)合并吞噬。 實(shí)驗(yàn)例5體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)
體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中用的是接種人肝細(xì)胞肝癌ch-七印-3的荷瘤Baib/c裸鼠。 Balb/c裸鼠皮下接種2 X 1(f的ch-h印-3細(xì)胞，接種后25天后腫瘤直徑約5鵬。 此時尾靜脈注射制備的MRI對比劑SM-USPIO或II USPIO，劑量為200mg Fe/kg。 MRI 檢查前動物以巴比妥鈉腹腔麻醉，造影分別在注射前及注射后2小時、8小時、 24小時及72小時進(jìn)行，同樣用4. 7TBniker Biospec"",小動物磁共振成像系統(tǒng)， 參數(shù)如下TKK)00ms， TE-52ffls， n圓ber of avei.age二2， F0V=3. 5X 3. 5cm， mat r i x=128 X 128 pim 。每組動物三只。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5結(jié)果顯示腫瘤組織與附近的肌肉組織的信號差別不大，注 射后8小時，腫瘤區(qū)域的信號出現(xiàn)下降，注射后72小時，腫瘤區(qū)域的信號明顯 下降，且腫瘤的邊界清晰。實(shí)驗(yàn)對照組采用在相同的模型中注射相同劑量的 H-USPIO，結(jié)果顯示注射前后，腫瘤區(qū)域的信號無明顯變化，提示在該模型中 H-USPIO無靶向增強(qiáng)作用，而SM-USPIO有明顯的靶向增強(qiáng)作用。 實(shí)驗(yàn)例6生物學(xué)分布實(shí)驗(yàn)
'251標(biāo)記SM-USPIO的生物學(xué)分布也在接種人肝細(xì)胞肝癌ch-h印-3的荷瘤 Balb/c裸鼠上進(jìn)行。接種后25天，12只動物隨機(jī)分為2組， 一組經(jīng)尾靜脈1. 0 ^Ci的1251標(biāo)記的SM-USPIO，另一組注射同樣劑量的^I標(biāo)記的H-USPI0。每組 動物分別在注射后8小時和72小時各處死動物3只，取腫瘤組織及各正常組織，
14包括肺、心、肝、脾、胰、胃、結(jié)腸和腎，稱重并測定放射性。72小時處死的 各動物，分別在注射后5分鐘、l小日寸、4小時、8小時、24小時和72小時經(jīng) 剪尾取血測定放射性。放射性通過伽馬計(jì)數(shù)器測定。各器官的放射性以注射劑 量的百分?jǐn)?shù)來表示。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，以P〈0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。
圖6顯示與12nI標(biāo)記的H USP工O相比，"I標(biāo)記的SM-USPI0注射后8小時及 72小時腫瘤局部積累明顯增多(P<0.05)(圖6-1、 6-2)。腫瘤局部的累積 是逐步的，與時間相關(guān)的，注射后72小時后可達(dá)8. 9±2. 3% ID g-1 (ID指注射 劑量，IDg-'指平均每克組織注射劑量)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同一時間的肝臟及脾臟的略 累積水平。相反，',標(biāo)記的H USP工O在腫瘤局部的累積明顯低，且注射后72 小時的水平低于注射后8小時的水平。標(biāo)記的SM-USPIO和'"I標(biāo)記的H-USPIO 在正常組織中的分布一致，，注射后72小時的水平均低于注射后8小時的水平 (圖6-1、 6-2) 。 "I標(biāo)記的SM-USP工O和'251標(biāo)記的H-USPIO在血液中的清除 曲線一致(圖6-3)。為比較"5工標(biāo)記的SM-USPIO和121—'I標(biāo)記的H-USPIO在腫瘤 組織中特異性累積的差別，我們計(jì)算了同一時間腫瘤組織與血液中放射性比值。 注射后72小時，1251標(biāo)記的SM-USPIO組動物的瘤./血比值為4. 93±0. 79，而'251 標(biāo)記的H—USPTO組動物的瘤/血比值為1. 26±0. 47，前者遠(yuǎn)大于后者(P〈0. 01)。
權(quán)利要求
1. 一種基于人源化抗體的磁共振對比劑SM-USPIO，為人源化SM5-1抗體與超順磁性氧化鐵顆粒USPIO交聯(lián)而得。
2. 權(quán)利要求1所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，包括以下步驟 步驟a:制備超順磁性氧化鐵顆粒USPIO，步驟b:制備人源化抗體，步驟c:制備磁共振對比劑SM -USPIO。
3. 權(quán)利要求2所述的磁共振對比劑SM--USPIO的制備方法，其中步驟a中超順磁 性氧化鐵顆粒USPIO的制備通過共沉淀方法得到，包括以下步驟歩驟A:將葡聚糖溶解于水中，加入鐵鹽，攪拌； 步驟B:在加熱的條件下將聚乙烯醇溶解在水中-，步驟C:將步驟B得到的溶液加入步驟A得到的溶液中混合，用堿調(diào)pH至 10—12，繼續(xù)攪拌后加熱得到沉淀； 步驟D:收集沉淀物并對其進(jìn)行后處理。
4. 權(quán)利要求3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中步驟A中使用的 鐵鹽為FeCl:, 和FeSCWiLO，其中三價鐵和二價鐵的摩爾比是為3: 2。
5. 權(quán)利要求3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中歩驟C巾所述的 堿為氨水。
6. 權(quán)利要求3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中步驟D中利用磁 場收集沉淀物。
7. 權(quán)利要求3所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中后處理步驟包括 利用水洗、檸檬酸溶液重懸沉淀、超聲后，在去離子水中進(jìn)行透析去除多余的 檸檬酸。
8. 權(quán)利要求2所述的磁共振對比劑SM-USPIO的制備方法，其中步驟c制備磁共 振對比劑SM-USPIO的步驟包括將UPSIO進(jìn)行活化，分離活化后的粒子，將粒子 和含抗體的PBS混合，攪拌，經(jīng)磁柱處理而得。
9. 權(quán)利要求1所述的磁共振對比劑SM USPIO在腫瘤^斷中的用途。
10. 權(quán)利要求9所述的用途，其中腫瘤為SM5丄結(jié)合蛋白陽性的腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種用于腫瘤診斷的磁共振對比劑及其制備方法，為人源化抗體的磁共振對比劑SM-USPIO，通過人源化SM5-1抗體與超順磁性氧化鐵顆粒USPIO交聯(lián)而得。本發(fā)明公開的SM-USPIO具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61K49/16GK101480494SQ20081018531
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者盛 侯, 健 趙, 郭亞軍, 菁 馬, 潔 高 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司