專利名稱：：采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便提取物在制備抗腫瘤藥物中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種昆蟲新的醫(yī)療用途，尤其是采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途，屬于天然藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是危害人民生命健康的頑癥之一，現(xiàn)有的抗腫瘤藥物都不能徹底有效地治愈。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)資料表明，全世界癌癥每年發(fā)病約1000萬人，死亡約700萬人，已成為僅次于心血管病的人類第二殺手。同時(shí)由于新型腫瘤的不斷發(fā)現(xiàn)，迫使人們努力尋找新的抗腫瘤藥物。肝癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，是我國(guó)位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年男性。因其惡性度高、病情進(jìn)展快，病人早期一般沒有什么不適，但一旦出現(xiàn)癥狀就診，就已經(jīng)屬于中晚期，故肝癌的治療難度大。由于化學(xué)合成的抗腫瘤藥物具有較大的毒副作用，因此從天然產(chǎn)物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分仍是近年國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)之一。而昆蟲作為中藥入藥，在我國(guó)有著悠久的歷史。尤其是近幾十年對(duì)其研究有了較大發(fā)展，并發(fā)現(xiàn)了一些昆蟲中含有抗癌等活性物質(zhì)，在治療某些疑難雜癥放方面取得了可喜的成績(jī)和苗頭。早在南宋時(shí)期就有斑螫(地膽)治療癌癥的記載。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明斑螫素對(duì)小鼠腹水腫癌、網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤有抑制作用，在臨床上可治療原發(fā)性肝癌；蟑螂提取物AF2可用于治療原發(fā)性肝癌(陳利銘，1986)等。長(zhǎng)春花(Caf/^ra"Awrow^)是夾竹桃科的一種重要藥用植物。在海南分布于萬寧、陵水、三亞、東方、?？诘鹊?。我國(guó)山東、江蘇、福建、廣東等省份有分布，原產(chǎn)于非洲東部，現(xiàn)各熱區(qū)均有栽培。全草藥用，具有鎮(zhèn)靜安神，平肝降壓之功效?？捎糜谥委煱籽　⒎伟?、胃癌、子宮癌、淋巴肉瘤、乳癌、卵巢癌、睪丸癌、等癥。夾竹桃天蛾(Da;^m's"en'!'L.)就是一種新發(fā)生的尤其危害夾竹桃科植物較為嚴(yán)重的害蟲。它為鱗翅目天蛾科白腰天蛾屬昆蟲，別名粉綠白腰天蛾、鷹紋天蛾，其幼蟲主要取食夾竹桃和長(zhǎng)春花等植物的新梢葉片及嫩莖。國(guó)外有少量對(duì)采食夾竹桃葉的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便中強(qiáng)心苷類化學(xué)成分的研究，發(fā)現(xiàn)其糞便提取物中含有大多數(shù)夾竹桃葉中的強(qiáng)心苷類成分且有些成分明顯高于其幼蟲和夾竹桃葉的含量，并從糞便中獲得了大量的歐夾竹桃甙乙和其他9種強(qiáng)心苷類化合物，由于歐夾竹桃苷丙發(fā)生脫乙酰作用導(dǎo)致歐夾竹桃甙乙的增加，從而降低了自體中毒，得出夾竹桃葉中的強(qiáng)心苷類成分可以在采食其葉的夾竹桃天蛾幼蟲的整個(gè)生長(zhǎng)過程中以生物活性成分的形式通過消化道(Phytochemistry,1996);國(guó)內(nèi)僅有關(guān)于夾竹桃天蛾幼蟲形態(tài)、取食表現(xiàn)方面的文獻(xiàn)報(bào)道(臺(tái)灣昆蟲，2001)。本發(fā)明所述的采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途，至今尚未見國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道和專利公開。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲的新用途，即采食長(zhǎng)春花P+的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的內(nèi)容是采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲及其糞便提取物在制備抗腫瘤藥物中的用途，所述采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物可通過下述步驟獲得是用水和有機(jī)溶劑作為提取劑，從采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便中提取得到夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物。其中，所述有機(jī)溶劑具體可為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。所述提取溶劑具體可為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。所述提取可為冷浸提取，溫度為常溫。至少提取一次，每次提取時(shí)間為l-3天。所述腫瘤可為肝癌、胃癌或?qū)m頸癌。根據(jù)以上方法所制備的預(yù)防和/或治療腫瘤藥物可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入機(jī)體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包埋后導(dǎo)入機(jī)體。還可以添加適當(dāng)?shù)乃幱幂o料，按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)制劑工藝，即可制成片劑、粉劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑、口服液等口服藥物制劑和注射藥物制劑。本發(fā)明的采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物，方法簡(jiǎn)單、成本低廉、變害為益。實(shí)驗(yàn)證明，該提取物能夠有效的抑制人腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如人肝癌、胃癌或?qū)m頸癌細(xì)胞。同時(shí)初步臨床療效觀察顯示本發(fā)明所提供的采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲的糞便提取物對(duì)制備抗腫瘤藥物，尤其是抗肝癌、胃癌、宮頸癌藥物具有重要意義。一、體外活性篩選下面是采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物的體外活性篩選試驗(yàn)及其結(jié)果。1.抗腫瘤活性測(cè)試采用MTT法。MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。其原理為MTT化學(xué)名3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的甲臜結(jié)晶(formazan)，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原)。2.活性測(cè)試方法為實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組(水)、DMSO溶劑對(duì)照組、陽性對(duì)照組(絲裂素C)和8個(gè)不同濃度(O.l，0.2，0.4，0.8，1.6,3.2,6.3,12.5)的待測(cè)樣品，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按每孔4500個(gè)癌細(xì)胞量接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于5。/。C02、濕度90%以上、37。C溫箱中培養(yǎng)。24h后取出加入一定量的待測(cè)樣品，繼續(xù)培養(yǎng)3d后取出置于顯微鏡下觀察每孔細(xì)胞形態(tài)，記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況，接著每孔加入5mg/mL的MTT溶液(溶于平衡鹽溶液PBS)50^L，37'C反應(yīng)4h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，每孔加入100nLDMSO將Formazane充分溶解，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于MK3酶標(biāo)儀上，用570nm波長(zhǎng)測(cè)各孔的吸光度(A)，按下列公式求生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(％)=(1——用鄉(xiāng)TOAit■陰性對(duì)照組平均A值7以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，作圖并求出抑制率為50%時(shí)樣品的濃度(1<:50)，樣品活性結(jié)果即以半數(shù)抑制濃度(IC50)表示。3.活性測(cè)試結(jié)果為樣品對(duì)四種腫瘤細(xì)胞株的毒性作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>幼蟲糞便提取物注毒性值ICso,即藥物對(duì)細(xì)胞殺滅50%時(shí)的濃度值。ICso值越大則毒性越小。二、初步臨床療效觀察下面是采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物治療100例肝癌的臨床療效情況統(tǒng)計(jì)1.病例選擇IOO例病人，均經(jīng)各大醫(yī)院確診為肝癌晚期患者，其中男42例，女58例，年齡最小者35歲，最大者65歲。2.治療方法對(duì)確診為肝癌晚期患者，給予本發(fā)明成藥(約含O.Olg采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物的2號(hào)膠囊)服用，一日二次，每次一粒，開水沖服。每40天為一個(gè)療程，連續(xù)兩個(gè)療程后停藥休息一周，詳細(xì)觀察病情變化進(jìn)行檢査。然后進(jìn)行第三個(gè)療程治療，在服藥期間停服其它藥品c3.療效標(biāo)準(zhǔn)臨床治愈癥狀及客觀檢査陽性征象消失，連續(xù)半年無復(fù)發(fā)者。臨床顯著癥狀基本消失，癌灶縮小一半以上，其它客觀檢查有明顯好轉(zhuǎn)，觀察半年以上不再發(fā)展者。臨床有效癥狀有所改善，病灶基本穩(wěn)定，觀察在一個(gè)月以上者。臨床無效癥狀及客觀檢査無改善，或僅有短期改善，而又迅速惡化者。4.療效觀察結(jié)果療效總例數(shù)百分比備注臨床治愈臨床顯著臨床有效臨床無效253735325%37%35%3%擴(kuò)散轉(zhuǎn)移本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、本發(fā)明無須煎煮，治療方便，有效率達(dá)97%。2、本發(fā)明能夠控制癌細(xì)胞增生，防止癌細(xì)胞擴(kuò)散，使癌細(xì)胞枯萎脫落消失。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便(400g)，用11倍量95%乙醇分3次(5、3、3倍)浸提，常溫提取時(shí)間分別為3、2、1天，合并提取液減壓回收乙醇，濃縮干燥得到浸膏粉，浸膏粉加入淀粉適量，混均、制粒、干燥、整粒，裝入膠囊，制成1000粒即可。'實(shí)施例2取釆食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便(300g)，用9倍量卯％乙醇冷浸提取2次，每次2天，減壓濃縮滲漉液至無醇味得濃縮液，加入淀粉等適量輔料混均，冷凍干燥，粉碎成粉末、壓制成1000片即可。實(shí)施例3取采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便(500g)，用10倍量90%乙醇冷浸提取1次，常溫提取3天，減壓濃縮滲漉液至無醇味得濃縮液，加入淀粉等適量輔料混均，冷凍干燥，粉碎成粉末、壓制成1000片即可。權(quán)利要求1、采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲在制備抗腫瘤藥物中的新用途，其特征在于所述夾竹桃天蛾為采食長(zhǎng)春花葉的鱗翅目天蛾科白腰天蛾屬昆蟲夾竹桃天蛾(DaphnisneriiL.)，藥用其糞便。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的新用途，其特征在于該提取物可按照如下方法制備是用水和/或有機(jī)溶劑作為提取劑，從采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲的糞便中提取得到該提取物。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的新用途，其特征在于所述有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、苯或甲苯。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的新用途，其特征在于所述提取溶劑為體積百分含量為95%的乙醇水溶液。5、根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取為冷浸提取。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的提取溫度為常溫。7、根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取中，至少提取一次，每次提取的時(shí)間為1-3天。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為肝癌、胃癌或?qū)m頸癌。9、根據(jù)權(quán)利要求2所述采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物，其特征在于所述該提取物含有生物堿類化合物。全文摘要本發(fā)明公開了一種采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物及其在抗腫瘤藥物中的新用途。所述提取物是按照如下方法制備的將采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲的糞便用水和/或有機(jī)溶劑為提取劑，從中得到該提取物。本發(fā)明所提供的采食長(zhǎng)春花葉的夾竹桃天蛾幼蟲糞便提取物具有較好的抗腫瘤作用。文檔編號(hào)A61K35/56GK101416988SQ20081018691公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2008年12月7日優(yōu)先權(quán)日2008年12月7日發(fā)明者嬌吳,戴好富,梅文莉申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所