專利名稱：：翻譯調(diào)節(jié)元件及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及用于在mRNA翻譯水平調(diào)控基因表達的翻譯調(diào)節(jié)元件。具體地，本發(fā)明涉及hairless基因5'-UTR中的翻譯調(diào)節(jié)元件及其用途。本發(fā)明還涉及用于診斷MarieU皿a遺傳性稀毛癥的方法、寡核苷酸和試劑盒。
背景技術：
：毛囊(hairfollicles,HF)是毛發(fā)發(fā)生周期性生長和脫落的器官。出生后，盡管毛囊及毛發(fā)形態(tài)可在雄激素作用下發(fā)生改變，但毛囊數(shù)量將不再增加。毛發(fā)的生長是一個周期性循環(huán)的過程，可分為生長期或活動期(anagen)(伴隨細胞的增生、遷移和分化)、移行期或退行期(catagen)(具有顯著的細胞凋亡現(xiàn)象)和休止期(telogen)三個階段[1'2]。來自真皮乳頭間充質(zhì)細胞的信號可以激活毛囊外毛根鞘(outerrootsheath，0RS)內(nèi)的上皮多能干細胞的遷移，并分化再生出新的毛球(hairbulb);毛球?qū)a(chǎn)生新的毛發(fā)[3]。這樣，毛發(fā)周期便從休止期重新進入下一個生長期。絕大多數(shù)臨床上所見毛發(fā)丟失(如脫發(fā)(alopecia)、無毛癥(atrichia)和稀毛癥(hypotrichosis))及過度毛發(fā)生長(多毛癥)都是HF循環(huán)周期發(fā)生紊亂所致[1]。Wnt信號通路協(xié)同多種其他因子啟動毛囊的新生和更新[4-8]。1926年Brooke首次報道了小鼠hairless(Hr)基因突變體，表型特征為出生時毛發(fā)正常，而出生后毛發(fā)開始脫落并不再生長導致無毛[9]。1996年Thompson等人克隆了小鼠的Hr基因，經(jīng)Northern原位雜交顯示該基因在皮膚和腦組織中大量表達[1°]。人類的Hairless(HR)基因定位于染色體8p21區(qū)域，編碼1189個氨基酸，與小鼠和大鼠的Hr基因的同源性較高，分別具有81.0%和81.1%的序列一致性，表明該基因在人、小鼠、大鼠中高度保守[11]。HR基因編碼一種核受體共阻遏蛋白，可以直接抑制Wnt通路拮抗劑Wise和Soggy的表達，從而調(diào)節(jié)HF循環(huán)周期和HF再生激活所需的Wnt信號通路[12—14]。HR基因的失去功能性突變可以導致常染色體隱性先天性無毛癥(0MIM203655，0MIM209500)的發(fā)生[11'15'16]。MarieUnna遺傳性稀毛癥(MUHH;OMM146550)是一種常染色體顯性遺傳的毛發(fā)缺失疾病，由德國皮膚科醫(yī)師MaireU皿a首先報道，患者特征為出生時毛發(fā)稀少或缺如；兒童期的毛發(fā)較粗，質(zhì)硬而無光澤；青春期則發(fā)生進行性的毛發(fā)脫落[17]。國內(nèi)外五個研究小組利用不同家族來源的家系將MUHH基因座定位于染色體8p21，但一直不能確定MUHH是否與HR基因有關[18—22]。許多遺傳性疾病的致病基因突變都可引起mRNA翻譯的改變[23]。一旦成熟mRNA的翻譯被激活，mRNA序列上的許多順式作用元件便開始調(diào)節(jié)蛋白合成的效率。許多蛋白可從一個mRNA分子合成，并不僅僅是通過mRNA的可變剪切，同時還可通過選擇翻譯起始密碼子而實現(xiàn)[24'25]。翻譯起始密碼子的選擇以及翻譯的效率受到mRNA特異性元件，例如5'-非翻譯區(qū)(5，-untranslatedregion,5，-UTR)的GC含量、5'-UTR的大小以及激活的上游起始密碼子(uAUG)在5'-UTR中的位置的調(diào)控。人類所有的mRNA大約有50X含有一個或多個uAUG或上游開放閱讀框(upstreamopenreadingframe,u0RF)[26'27]。根據(jù)經(jīng)驗，uAUG/uORF通常通過影響核糖體到達并起始主要開放讀碼框(mainopenreadingframe,mORF)而降低mORF的翻譯效率。由于mRNA分子上調(diào)控元件(如uAUG/uORF)的改變引起下游基因表達的異?？梢娪谌祟愡z傳病中。多數(shù)人類遺傳病是由相關基因的蛋白編碼區(qū)的突變，如無義突變、錯義突變、移碼突變或由于內(nèi)含子的突變引起前mRNA(pre-mRNA)加工異常引起，但不斷有報道指出由突變影響mRNA翻譯效率而引起的遺傳性疾病[28—3°]。小鼠的毛囊在毛發(fā)生長初期具有HrmRNA的轉(zhuǎn)錄，但卻缺乏相應蛋白的翻譯[13'，說明該基因存在翻譯水平的表達調(diào)控。先前在MUHH家系中均未能發(fā)現(xiàn)在HR基因編碼區(qū)存在的任何致病性突變[18—22]。因此，可推測HR基因編碼區(qū)之外的順式作用元件，諸如uORF可能是MUHH發(fā)生的原因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即人Hairless(HR)基因的成熟mRNA5'-UTR中的一些上游開放讀碼框(uORF)，具體為命名為U1HR和U2HR的uORF，能夠調(diào)節(jié)其下游HR基因主要開放讀碼框(mORF)的翻譯。在一方面，本發(fā)明提供相應于U2HR的多核苷酸，其包含編碼如SEQIDNO:l所示氨基酸序列的核苷酸序列。在一個具體的實施方式中，所述多核苷酸包含如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。出乎預料地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該U2HR能夠作為通用的翻譯調(diào)節(jié)元件抑制靶基因mRNA中mORF的翻譯。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制靶基因表達的方法，其包括將本發(fā)明的相應于U2HR的多核苷酸插入至靶基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為靶基因mRNA中的5'-UTR元件抑制其下游的耙基因mORF的翻譯。為此，本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的相應于U2HR的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供一種多肽，其包含如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種抗體，其特異性結(jié)合一種多肽，所述多肽包含如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，或者所述抗體特異性結(jié)合通過在SEQIDNO:l所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明人還進一步證實，人HR基因的成熟mRNA5'-UTR中的U2HR的突變可以使該U2HR失去功能，進而導致HR基因成熟mRNA中mORF翻譯水平提高，即HR基因的獲得功能性表達，并由此引起MarieUnna遺傳性稀毛癥(MUHH)。因此，在另一方面，本發(fā)明提供用于診斷MUHH的方法，其包括檢測人HR基因的成熟mRNA5'-UTR的U2HR中或人HR基因的相應于該U2HR的區(qū)域中是否存在突變的步驟。所述方法包括例如PCR或核酸雜交的步驟。為此，本發(fā)明提供寡核苷酸，所述寡核苷酸可作為引物和/或探針，用于本發(fā)明的診斷MUHH的方法。因此，本發(fā)明提供一種用于診斷MUHH的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用作引物，用于通過PCR方法從人HR基因的成熟mRNA的整個5'-UTR中或者從人HR基因的相應于該整個5'-UTR的區(qū)域中特異性擴增相應于編碼如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的一段核酸序列。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸與位于SEQIDN0:5的第1-370位或第476-691位核苷酸內(nèi)的一段核苷酸序列互補。通過使用所述寡核苷酸進行特異性擴增而得到的擴增產(chǎn)物具有編碼如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，例如具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；或者所述擴增產(chǎn)物具有編碼SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的突變體的核苷酸序列，所述突變體具有通過在SEQIDNO:l所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，所述寡核苷酸具有選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核苷酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，所述寡核苷酸特異性結(jié)合如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其突變體。所述寡核苷酸可用作探針，用于診斷MUHH。本發(fā)明也提供上述寡核苷酸在制備用于診斷MUHH的診斷試劑盒中的用途，以及包含上述寡核苷酸的用于診斷MUHH的診斷試劑盒。在另一方面，本發(fā)明提供相應于UIHR的多核苷酸，其包含編碼如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個具體的實施方式中，所述多核苷酸包含如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種上調(diào)靶基因表達的方法，所述方法包括將本發(fā)明的相應于UIHR的多核苷酸插入至靶基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為靶基因mRNA中的5'-UTR元件上調(diào)其下游的靶基因mORF的翻譯。為此，本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的相應于U1HR的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明還提供一種多肽，其包含如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種抗體，其特異性結(jié)合一種多肽，所述多肽包含如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列，或者所述抗體特異性結(jié)合通過在SEQIDN0:3所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。此外，本發(fā)明還提供篩選能夠調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率的化合物的方法，所述方法包括在合適的系統(tǒng)中，使候選化合物與具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的多肽或具有如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列的多核苷酸相接觸，由此篩選能夠增強或抑制所述多肽或多核苷酸調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率的能力的化合物。圖1:HR基因5'-UTR區(qū)的核苷酸序列。四個uORF分別命名為U1HR(虛線)、U2HR(實線)、U3HR(雙實線)和U4HR(雙實線)。U1HR和U2HR的推定的氨基酸序列以單字母表示，HR基因的mORF以方框表示，圖示起始和最后六個核苷酸。圖2:15種哺乳動物U2HR核苷酸序列的比對。星號表示相同的核苷酸。圖3:U2HR對下游HR基因mORF翻譯的抑制作用。(a)圖示帶有HR基因5'-UTR的HR-熒光素酶報告載體，以及野生型(WT)及突變體的相對熒光素酶活性。四種突變體為ATG起始密碼子的T向C的突變，分別表示為UlHRm、U2HRm、U3HRm和U4HRm。(b)圖示帶有HR基因5'-UTR的HR-EGFP表達載體和UlHRm及U2HRm突變體的表達分析。下左實時定量RT-PCR(qRT-PCR)提示HeLa細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T、UlHRm或U2HRm載體后測得的HR-EGFPmRNA表達水平相似。下中免疫印跡提示細胞轉(zhuǎn)染UlHRm和U2HRm突變體后，HR-EGFP蛋白水平改變的模式。下右細胞轉(zhuǎn)染UlHRm和U2HRm突變體后，HR-EGFP蛋白表達水平相對野生型分別為O.56和2.91。這些改變HR-熒光素酶的熒光素酶活性相一致。(c)U1HR和U2HR可翻譯性的檢測。左圖示構(gòu)建的表達載體U2HRno-stop和U2HRno-stop。中免疫印跡說明融合蛋白具有比對照EGFP更高的分子量水平。右抗-U2HR多克隆抗體證實了U2HR-EGFP融合蛋白的翻譯。圖4:U2HR的突變消除了對HR基因下游m0RF翻譯的抑制作用。(a)轉(zhuǎn)染帶有各種U2HR突變的HR-熒光素酶報告載體的細胞均呈現(xiàn)增強的熒光素酶活性。(b)轉(zhuǎn)染帶有各種U2HR突變的HR-EGFP載體的細胞熒光信號強度均增強。(c)轉(zhuǎn)染帶有各種U2HR突變的HR-EGFP載體的細胞具有與野生型(WT)構(gòu)建體相似的相對HR-EGFPmRNA表達水平(上)，但卻具有增強的HR-EGFP蛋白表達水平(中和下)。圖中WT:野生型；M1:c.2T>C(p.O);M2:c.104A>G(p.X35Wextll63X);M3:c.7C>T(p.Q3X);M4:c.71T>A(p.I24N);M5:c.73C>G(p.P25A);M6:c.82G>C(p.D28H);M7:c.76G>A(p.E26K)。圖5:野生型U2HR對下游熒光素酶基因翻譯的抑制作用。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Luc質(zhì)粒的相對熒光素酶活性達497.5，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.l-U2HR-Luc質(zhì)粒的相對熒光素酶活性僅有61.8，提示U2HR對下游熒光素酶基因翻譯強烈的抑制作用。圖6:野生型U2HR對下游EGFP基因翻譯的抑制作用。與空載體pEGFP-Nl(Clontech)相比，pEGFP-Nl-U2HR的EGFP表達量顯著降低，說明了U2HR顯著抑制下游EGFP基因的翻譯。具體實施例方式在本發(fā)明中，術語"5'-UTR"，即"5'非翻譯區(qū)"，又稱為"前導序列(leadersequence)"，是指成熟mRNA和編碼所述成熟mRNA的DNA序列中的特殊區(qū)域，其始于轉(zhuǎn)錄起始位點，而止于下游編碼區(qū)的起始密碼子(通常是AUG)前端。通常情況下，5'-UTR負性調(diào)控下游基因表達，核糖體結(jié)合于5'-UTR的帽子結(jié)構(gòu)并沿5'向3'方向滑動掃描AUG起始密碼子。因此，mORF上游uAUG可被核糖體識別和/或起始翻譯，從而調(diào)節(jié)mORF的翻譯水平，這種調(diào)控機制已在少數(shù)人類遺傳病的發(fā)病機理中得到證實[28—3°]。在本發(fā)明中，術語"uORF"，S卩"上游開放讀碼框(upstreamopenreadingframe)"，是指成熟mRNA的5'-UTR區(qū)中存在的閱讀框架，其具有起始密碼子AUG和終止密碼子UAG或UAA或UGA特征，能夠根據(jù)三聯(lián)密碼子規(guī)則進行翻譯成相應的肽分子。在本發(fā)明中，術語"mORF"，即"主要開放讀碼框(mainopenreadingframe)"，是指相對于uORF而言，基因在生理條件下按此讀碼框(mORF)進行翻譯，因此mORF又可稱為真實的開方文讀碼框(genuineopenreadingframe)或生理性開方文讀碼框(physiologicalopenreadingframe)。在生物信息學分析的基礎上，本發(fā)明人采用連鎖分析方法將MUHH的致病基因定位在染色體8p21的區(qū)域內(nèi)，并對所述區(qū)域中的候選基因FGF17、HR和FAM160B2進行突變篩查，結(jié)果僅在HR基因5'-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了致病性突變。本發(fā)明人通過生物信息學方法進行序列分析，并采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)，將HR基因的5'_UTR向上游延伸至691nt，并在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)四個u0RF。如圖l所示，按照5'至3'方向?qū)⑦@四個uORF分別命名為U1HR、U2HR、U3HR和U4HR。其中U2HR具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列，推定其編碼一種具有34個氨基酸的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示；UIHR具有如SEQIDN0:4所示的核苷酸序列，推定其編碼一種具有16個氨基酸的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDN0:3所示；U3HR具有如SEQIDNO:8所示的核苷酸序列；U4HR具有如SEQIDNO:9所示的核苷酸序列。通過序列保守性分析發(fā)現(xiàn)，在眾多哺乳動物中，U1HR、U2HR和U4HR在序列本身及序列大小上都很保守。其中U2HR尤為保守，在15種已知的由哺乳動物的U2HR所編碼的肽序列中，有31個氨基酸完全一致(圖2)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，人HR基因的成熟mRNA5'-UTR中的一些uORF，具體為U1HR和U2HR，能夠調(diào)節(jié)其下游HR基因mORF的翻譯。其中U2HR的突變可以使該U2HR失去功能，進而導致HR基因成熟mRNA中mORF翻譯水平提高，即HR基因的獲得功能性表達，并由此引起MUHH?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，可以通過測定來自患者的生物學樣品中的U2HR的核苷酸序列或由其編碼的氨基酸序列上的突變來診斷MUHH。因此，在一方面，本發(fā)明提供一種多核苷酸，其包含編碼如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者由編碼如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的核苷酸序列組成。在一個具體的實施方式中，所述多核苷酸包含如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列。在另一個具體的實施方式中，所述多核苷酸由SEQIDN0:2所示的核苷酸序列組成。如上所述，人HR基因的成熟mRNA5'_UTR中的U2HR的突變可以導致mRNA中的下游mORF翻譯水平提高，引起HR基因的獲得功能性表達，并導致MUHH。因此，本發(fā)明提供用于診斷MUHH的方法，其包括檢測人HR基因的成熟mRNA5'-UTR的U2HR中或人HR基因的相應于該U2HR的區(qū)域中是否存在突變的步驟。所述突變包括例如表2中所示的突變。所述方法包括例如PCR或核酸雜交的步驟。為此，本發(fā)明提供寡核苷酸，所述寡核苷酸可作為引物和/或探針，用于本發(fā)明的診斷MUHH的方法。為此，本發(fā)明提供一種用于診斷MUHH的寡核苷酸，所述寡核苷酸可用作，例如，引物，用于通過PCR方法從人HR基因的成熟mRNA的整個5'-UTR中或者從人HR基因的相應于該整個5'-UTR的區(qū)域中特異性擴增相應于編碼如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列的一段核酸序列。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的寡核苷酸與位于SEQIDNO:5的第1-370位或第476-691位核苷酸內(nèi)的一段核苷酸序列互補，該段核苷酸序列的長度例如為10至50個核苷酸，優(yōu)選地為18至25個核苷酸。通過使用所述寡核苷酸進行特異性擴增而得到的擴增產(chǎn)物具有編碼如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，例如具有SEQIDN0:2所示的核苷酸序列；或者所述擴增產(chǎn)物具有編碼SEQIDN0:1所示的氨基酸序列的突變體的核苷酸序列，所述突變體具有通過在SEQIDN0:1所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的氨基酸序列。所述寡核苷酸的長度約為10至50個核苷酸，優(yōu)選地為18至25個核苷酸。在一個具體的實施方式中，所述寡核苷酸具有選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核苷酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，所述寡核苷酸特異性結(jié)合如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其突變體。所述寡核苷酸可用作探針，用于診斷MUHH。本發(fā)明也提供如上所述的寡核苷酸在制備用于診斷MUHH的診斷試劑盒中的用途，以及包含如上所述的寡核苷酸的用于診斷MUHH的診斷試劑盒。本發(fā)明人在此提供的結(jié)果說明U2HR編碼的肽負性調(diào)控HR基因的翻譯，并首次提出在人類遺傳性疾病中存在序列依賴性uORF調(diào)節(jié)功能的異常。本發(fā)明人還進一步證實了U2HR中的所有失去功能性突變可以引起HR基因mORF翻譯水平的提高，說明了引起MUHH的分子機制為HR基因的獲得性功能表達。不僅如此，本發(fā)明人還出乎預料地發(fā)現(xiàn)，人HR基因的成熟mRNA5'-UTR中的一個uORF，即U2HR，能夠作為通用的翻譯調(diào)節(jié)元件抑制耙基因mRNA中的下游mORF的翻譯。uORF的破壞是人類遺傳性疾病的一種新的突變機制[23'28]。uORF在人類mRNA的5，-UTR區(qū)很常見^劃，長度大于400nt的人類5'-UTR平均含有4個uORF[32]。多數(shù)的抑制性uORF可能單純通過阻礙核糖體到達下游mORF的起始密碼子[34]。而在某些人類遺傳性疾病，例如在遺傳性血小板增多癥和家族性皮膚黑色素瘤案例中[29'3°]，丟失或新生一個抑制性uORF可分別導致獲得功能性和失去功能性的作用。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抑制靶基因表達的方法，其包括使用抑制性5'-UTR元件來抑制耙基因mRNA中的下游mORF的翻譯。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種抑制靶基因表達的方法，其包括將本發(fā)明的相應于U2HR的多核苷酸插入至靶基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為耙基因mRNA中的5'-UTR元件抑制其下游的耙基因mORF的翻譯，所述多核苷酸包含編碼如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。為此，本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的相應于U2HR的多核苷酸。在一個實施方式中，所述載體是基因治療載體。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種抑制靶基因表達的方法，其包括使用由本發(fā)明的相應于U2HR的多核苷酸所編碼的多肽來抑制靶基因mRNA中的下游mORF的翻譯。為此，本發(fā)明還提供一種多肽，其包含如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。此外，本發(fā)明還提供一種抗體，其特異性結(jié)合一種多肽，所述多肽包含如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，或者所述抗體特異性結(jié)合通過在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的抗體可用于調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。在一個具體的實施方式中，所述靶基因是HR基因。在另一方面，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含一種多肽，所述多肽包含如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成。在另一方面，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗體。在另一方面，本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明還提供篩選能夠調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率的化合物的方法，所述方法包括在合適的系統(tǒng)中，使候選化合物與具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的多肽或具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸相接觸，由此篩選能夠增強或抑制所述多肽或多核苷酸調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率的能力的化合物。合適的系統(tǒng)包括例如本說明書實施例中所使用的系統(tǒng)。本發(fā)明人的結(jié)果證實了引起MUHH的突變僅發(fā)生在抑制性U2HR中，但這并不能排除在與其他毛發(fā)表型相關的個體中正性活性UIHR所發(fā)揮的作用。在另一方面，本發(fā)明提供相應于UIHR的多核苷酸，其包含編碼如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個具體的實施方式中，所述多核苷酸包含如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種上調(diào)靶基因表達的方法，所述方法包括將本發(fā)明的相應于UIHR的多核苷酸插入至靶基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為靶基因mRNA中的5'-UTR元件上調(diào)其下游的靶基因mORF的翻譯。為此，本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的相應于U1HR的多核苷酸。在另一方面，本發(fā)明還提供一種多肽，其包含如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明還提供一種抗體，其特異性結(jié)合一種多肽，所述多肽包含如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列，或者所述抗體特異性結(jié)合通過在SEQIDN0:3所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。實施例實施例1:MUHH致病基因的連鎖分析和突變篩查1、連鎖分析本發(fā)明人采得1個5代漢族MUHH家系中18個成員(包括11個受累個體、3個未受累個體和4個配偶)的血樣品，所有患者樣品的采集均簽署知情同意書?；蚪MDNA按照標準方法提取。在兩點連鎖分析中，本發(fā)明人從UCSC基因組瀏覽器(HumanMar.2006Assembly版本)中選取了HR基因座側(cè)翼的四個多態(tài)微衛(wèi)星標記(ATAAC、D8S405、D8S1786、D8S1733)并采用LINKAGE軟件包中的MLINK程序計算LOD值。連鎖分析所用的參數(shù)為常染色體顯性遺傳(autosomaldominantinheritance)、完全夕卜顯(penetrance)、零突變率(mutationrate)、等值性別重組率(male-femalerecombinationrate)、等值微衛(wèi)星等位基因頻率(microsatellite-allelefrequency)，疾病等位基因頻率為1/10000。表l為四個多肽微衛(wèi)星標記的引物序列和在基因組中的位置。表1:連鎖分析中所用多肽微衛(wèi)星標記的引物序列和在基因組中的位置標記序列號正向(5'-3')反向(5'-3')起始結(jié)束ATAACSEQIDN0:10禾口11TCTAGAAACCCGCTGAGAGGCTAGGGTGCATGTGGGTTTC2182992721830078D8S405SEQIDN0:12禾口13GGCTGTGGGATATCACTAGAAGGGGTGGGAAAACTGAGGGATTCAC2202466122024894D8S1786SEQIDN0:14禾口15CGAAAGATTGAGACCCCATGTTTCCACACCGAAGCC2248921422489578D8S1733SEQIDN0:16禾口17CACAGTCTCAAACTCCTGGGACGAAAAACCATGAACAAGA22576582225768362、突變篩查本發(fā)明人在上述中國人家系中的l個受累個體中的上述連鎖區(qū)域篩查3個已知基因FGF17、HR和FAM160B2的致病性突變。FGF17和FAM160B2基因的外顯子和內(nèi)含子區(qū)都用聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)擴增；而對于HR基因，本發(fā)明人擴增了整個基因組區(qū)域，包括16個重疊片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接測序。本發(fā)明人應用UCSC基因組瀏覽器(HumanMar.2006Assembly版本)檢測了5kb的基因組區(qū)域(chr8:22，041，880-22，046，879)，并集中于人8號染色體HR基因參考序列中的第1外顯子。本發(fā)明人選擇了RefSeq、HumanEST和Conservation參數(shù)，并將HR基因的5'-UTR向上游延伸至691nt，并應用NCBI網(wǎng)站的ORFFinder工具進行HR基因5'-UTR區(qū)的uORF預測，在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)了四個uORF，按照5'至3'方向分別命名為U1HR、U2HR、U3HR和U4HR(圖1)。HR基因的5'-UTR區(qū)uORF的存在提示MUHH可能由于所述uORF中某種突變所致。為證明此假設，本發(fā)明人首先在所述MUHH受累個體中篩查到U2HR的c.2T>C突變，該突變消除了U2HR中唯一一個ATG密碼子，亦即可能使自身的蛋白翻譯完全消失。對所有受累個體和617個無關的漢族人對照用引物HRUP3F1:AATCACGGGCTCCTGTTTCC(SEQIDNO:6)和HRUP3R1:CGTTCTCCCGCTCTGTCTGC(SEQIDNO:7)進行基因組PCR擴增，用Ncol限制性內(nèi)切酶消化擴增產(chǎn)物進行突變驗證，結(jié)果表明所述U2HR的c.2T>C突變僅存在于受累個體中。對于其他MUHH家系受累個體的突變篩查，采用上述同樣引物對進行PCR擴增，產(chǎn)物用HRUP3F1引物進行測序驗證。本發(fā)明人還從來自國內(nèi)外的18個臨床上確診為MUHH的家系，包括8個先前已經(jīng)報道連鎖在8p21的家系[18—22]中進一步篩查到了U2HR區(qū)域中的突變。所有19個不同來源的MUHH家系總共檢測到的13種不同的U2HR突變匯總于表2中。其中7個突變位于U2HR的起始密碼子或終止密碼子，分別導致翻譯不能起始或延遲終止。除外兩個無義突變，其他所有突變均為錯義突變。這樣的突變譜，特別是錯義突變和延遲終止密碼子突變都強烈提示U2HR可能編碼一種功能性多肽分子，而且引起MUHH的突變基本上為失去功能性的。此外，所有的錯義突變都集中位于編碼U2HR的2428位氨基酸的密碼子，說明了相應氨基酸殘基在功能上的重要性。表2:19個MUHH家系中發(fā)現(xiàn)的U2HR突變核苷酸改變氨基酸改變家系來源1c.lA〉G'1p.0#1澳大利亞l個英國l個2C.1A>Tp.O瑞士l個3c.2T>A*2p,O瑞士l個4c.2T>Cp.O美國l個比利時l個中國l個c.3G>Ap.O美國l個6c.7C>Tp.Q3X#2英國l個"7C.20OAp.S7X德國l個8c.71T>Ap.I24N荷蘭l個9c.73C〉Gp.P25A荷蘭l個英國l個意大利l個10c.76G>Ap.E26K法國l個11c.82G>Cp.D28K蘇格蘭l個12c.103T>Cp.X35Qextl263X#3德國l個13c.104A>Gp.X35Wextl263X中國2個*1:c.1A>G代表該突變造成U2HRcDNA(即SEQIDNO:2)第一位的A突變?yōu)镚;*2:c.2T>A代表該突變造成U2HRcDNA(即SEQIDNO:2)第二位的T突變?yōu)锳，以下類同；#1:p.0代表該突變造成U2HR多肽不表達；#2:p.Q3X代表該突變影響U2HR多肽第3位氨基酸，使之由Q突變?yōu)閄，以下類同；#3:p.X35Qextl263X代表突變使終止密碼子新生一個谷胺酰胺氨基酸，并隨后按三聯(lián)密碼子規(guī)則往下翻譯實施例2:U2HR對HR基因表達的影響1、克隆和誘變本發(fā)明人首先將寡核苷酸EcoRI-SacII-up:5'-AGCTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCAGAATTCGTCTGCAGGACCGCGGCA-3'(SEQIDNO:18)和寡核苷酸EcoRI-SacII-down:5'-CAT交片段在pGL3-Promoter(Promega)質(zhì)粒的Hindlll/Ncol位點處引入EcoRI和SacII克隆位點。HR基因的-642+81片段隨后用U2HR-WT-F與U2HR-WT-R引物對(見表3)從A375細胞系(ATCC)提取的總RNA(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成的cDNA(TaKaRa)為模板擴增而得并克隆入此改造的pGL3-Promoter質(zhì)粒的EcoRI和SacII克隆位點而產(chǎn)生pGL3_UTR-HR-Luc構(gòu)建質(zhì)粒。隨后本發(fā)明人將HR基因5'UTR區(qū)4個uORF各自的起始密碼子突變(ATG突變?yōu)锳CG)，4種突變體分別表示為UlHRm、U2HRm、U3HRm和U4HRm，并根據(jù)表2所示U2HR中的7種引起氨基酸改變的核苷酸突變類型，包括5種錯義突變M3(7C>T)、M4(71T>A)、M5(73C>G)、M6(82G>C)和M7(76G〉A);—個起始密碼子突變Ml，即U2HRm;和一個終止密碼子突變M2(104A>G)，分別通過PCR介導的誘變方法(所有誘變引物列于表3中)插入到pGL3-UTR-HR-Luc質(zhì)粒中。將分別包含在各pGL3-UTR-HR-Luc質(zhì)粒中的上述Ml-M7這7種突變體和UlHRm通過EcoRI-SacII克隆位點亞克隆入質(zhì)粒pEGFP-Nl(Clontech)中(Nec/0RF上游插入Flag標簽形成Flag-Nec/融合蛋白)，得到相應的8種HR-EGFP表達質(zhì)粒。所有構(gòu)建的質(zhì)粒都經(jīng)過測序驗證。表3:PCR誘變引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2、HR基因5'-UTR區(qū)u0RF對下游m0RF表達的影響u0RF對HR基因m0RF翻譯的影響HeLa細胞(ATCC)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并用LipofectamineTM2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。用上述帶有UlHRm、U2HRm、U3HRm和U4HRm的pGL3-UTR-HR-Luc構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，同時共轉(zhuǎn)染pRL-TK海腎熒光素酶載體(Promega)作為標化轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24小時，裂解細胞并參照DualLuciferase說明書(Promega)在TURNERDESIGNTD20/20儀器上測定熒光素酶活性。實驗重復三次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅UlHRm和U2HRm兩種突變可以顯著改變熒光素酶相對活性。UlHRm突變體仍有大約50%的熒光素酶活性，而U2HRm突變體使熒光素酶的活性提高了大約3倍(圖3a)，提示U1HR和U2HR分別作為一種剌激性和抑制性翻譯調(diào)控元件而行使功能。隨后將上述帶有UlHRm和U2HRm的HR-EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。細胞經(jīng)4。C預冷PBS洗滌兩遍，用RIPA緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1%NP_40，0.1%SDS)進行裂解。來自轉(zhuǎn)染細胞的蛋白樣品用12%NovexNuPAGETris-Bis膠(Invitrogen)分離，經(jīng)半干電轉(zhuǎn)儀(BioRad)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上。印跡膜經(jīng)含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(10mMTris，pH7.5，150mMNaCl，O.5%Tween-20)封閉后，用鼠源抗FLAGM2單克隆抗體(1:3000)(Sigma-Aldrich)進行雜交，隨后用免疫純(Imm皿oPure)過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(l:3000)(Pierce)的探針進行雜交，最后用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(Pierce)進行顯影。同樣的印跡在用1%SDS-25mM甘氨酸(pH2.0)緩沖液洗脫同一印跡膜后用鼠源抗GFP單克隆抗體(l:3000)(MBL)進行。免疫印跡的結(jié)果提示UlHRm突變體仍有大約50%的熒光活性，而U2HRm突變體使熒光活性提高了大約3倍(圖3b，中、右)，這與所述UlHRm和U2HRm兩種突變體在熒光素酶報告系統(tǒng)中的結(jié)果相一致。u0RF對HR某因m0RF轉(zhuǎn)錄的影響將上述帶有UlHRm和U2HRm的HR-EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取細胞總RNA(Invitrogen)并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa)。HR-EGFP和FLAG-Neor的實時定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測引物應用PrimerExpressv2.0軟件(AppliedBiosystems)進行設計。HR-EGFP的qRT-PCR檢測引物如下GFP-F:5'-TAAACGGCCACAAGTTCAGC-3'(SEQIDNO:38)，GFP-R:5，-GGTGGTGCAGATGAACTTCAGG-3，(SEQIDNO:39);FLAG-NeorqRT-PCR檢測引物如下Neo-F:5'-CTTGCCGAATATCATGGTGG-3'(SEQIDNO:40)，Neo-R:5'-AAGCTCTTCAGCAATATCACGG-3，(SEQIDNO:41)。qPCR的反應體系每管各20ii1，包括10ii1SYBRPremixExTaqTM(TaKaRa)，5的上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物(50ng)和5所述引物(各500nM)，每個樣品設四個平行管。反應在Rotor-Gene6000實時轉(zhuǎn)式分析儀(CorbettLifeScience)中進行，條件為95°C10min，40個循環(huán)的95°C10秒/60°C15秒/72°C20秒。HR-EGFPmRNA的表達水平用pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒上Nee/基因表達的mRNA水平進行標化，相對表達水平根據(jù)Rotor-Gene6000實時轉(zhuǎn)式分析儀(CorbettLifeScience)操作平臺中的比較AACT法確定，其用轉(zhuǎn)染野生型(WT)HR-EGFP質(zhì)粒細胞來源的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為標準品。qRT-PCR實驗重復操作三次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述UlHRm和U2HRm兩種突變體不影響下游HR基因m0RF的轉(zhuǎn)錄(圖3b，左)。因此提示U1HR和U2HR分別編碼活性肽并正性和負性調(diào)控下游HR生理性m0RF的蛋白翻譯。U1HR和U2HR可翻譯性的檢測U2HRno-stop質(zhì)粒的構(gòu)建通過在pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒上插入HR基因5'_UTR區(qū)的-642-220片段以將U2HR置于EGFP0RF的上游并形成通讀而完成。UlHRno-stop質(zhì)粒則是通過PCR介導的誘變將U1HR的終止密碼子TAG誘變?yōu)镃AG后將HR基因5'-UTR區(qū)的-642-221片段克隆入pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒而獲得(圖3c，左)。將此構(gòu)建所得質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞，各自的翻譯產(chǎn)物用鼠源抗GFP單克隆抗體(1:3000)(MBL)或定制的兔源抗U2HR多克隆抗體(1:3000)(AbMART)進行免疫印跡檢測。免疫印跡說明融合蛋白具有比對照EGFP更高的分子量水平(圖3c，中)，同時本發(fā)明人用所述抗-U2HR多克隆抗體證實了U2HR-EGFP融合蛋白的翻譯(圖3c，右)。3、U2HR對HR基因轉(zhuǎn)錄的影響在HR-EGFP表達分析中，本發(fā)明人采用qRT-PCR檢測融合性HR-EGFP的mRNA相對表達水平。用上述帶有Ml-M7突變體的HR-EGFP表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞后繼續(xù)培養(yǎng)24小時。提取細胞總RNA(Invitrogen)并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa)。HR-EGFP和FLAG-Neor的qRT-PCR檢測引物應用PrimerExpressv2.0軟件(AppliedBiosystems)進行設計。HR-EGFP的qRT-PCR檢測引物如下GFP-F:5'-TAAACGGCCACAAGTTCAGC-3'(SEQIDNO:38)，GFP-R:5'-GGTGGTGCAGATGAACTTCAGG-3'(SEQIDNO:39);FLAG-NeorqRT-PCR檢測引物如下Neo-F:5'-CTTGCCGAATATCATGGTGG-3'(SEQIDNO:40)，Neo-R:5'-AAGCTCTTCAGCAATATCACGG-3'(SEQIDNO:41)。qPCR的反應體系每管各20ii1，包括10ii1SYBRPremixExTaq(TaKaRa)，5ii1的上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物(50ng)禾P5ii1所述弓l物(各500nM)，每個樣品設四個平行管。反應在Rotor-Gene6000實時轉(zhuǎn)式分析儀(CorbettLifeScience)中進行，條件為95。ClOmin，40個循環(huán)的95°C10秒/60°C15秒/72。C20秒。同時用pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒上Nee/基因表達的mRNA水平進行標化，相對表達水平根據(jù)Rotor-Gene6000實時轉(zhuǎn)式分析儀(CorbettLifeScience)操作平臺中的比較AACT法確定，其用轉(zhuǎn)染野生型(WT)HR-EGFP質(zhì)粒細胞來源的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為標準品。qRT-PCR實驗重復操作三次。結(jié)果可見轉(zhuǎn)染帶有上述Ml-M7突變體的HR-EGFP載體的細胞具有與野生型(WT)構(gòu)建體相似的相對HR-EGFPmRNA表達水平(圖4c，上)。說明U2HR的所述M1-M7這7種突變體不影響下游HR基因的轉(zhuǎn)錄活性。4、U2HR對其下游HR基因mORF翻譯的影響HR-熒光素酶活性檢測HeLa細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。將帶有野生型(WT)及上述M1-M7突變體的各種pGL3-UTR-HR-Luc構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入24孔培養(yǎng)板的HeLa細胞中，同時共轉(zhuǎn)染pRL-TK海腎熒光素酶載體(Promega)作為標化轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24小時，裂解細胞并參照DualLuciferase說明書(Promega)在TURNERDESIGNTD20/20儀器上測定熒光素酶活性。實驗重復三次。結(jié)果可見，相對于野生型構(gòu)建體，所述Ml-M7各種構(gòu)建體的相對熒光素酶活性均有不同程度的增強(圖4a)。免疫印跡將帶有野生型(WT)及所述Ml-M7各種突變體的HR-EGFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入24孔培養(yǎng)板的HeLa細胞24小時后，細胞經(jīng)4。C預冷PBS洗滌兩遍，用RIPA緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1%NP_40，0.1%SDS)進行裂解。來自轉(zhuǎn)染細胞的蛋白樣品用12%NovexNuPAGETris-Bis膠(Invitrogen)分離，并經(jīng)半干電轉(zhuǎn)儀(BioRad)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上。印跡膜經(jīng)含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(10mMTris，pH7.5，150mMNaCl，0.5%Tween-20)封閉后，用鼠源抗FLAGM2單克隆抗體(1:3000)(Sigma-Aldrich)進行雜交，隨后用免疫純(ImmunoPure)過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(l:3000)(Pierce)的探針進行雜交，最后用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(Pierce)進行顯影。同樣的印跡在用1%SDS-25mM甘氨酸(pH2.0)緩沖液洗脫同一印跡膜后用鼠源抗GFP單克隆抗體(1:3000)(MBL)進行。結(jié)果可見，與野生型構(gòu)建體相比，所述M1-M7各種突變體的綠色熒光蛋白熒光強度獲得不同程度的增強(圖4b和圖4c，中、下)。熒光素酶(圖4a)和免疫印跡的結(jié)果(圖4b和圖4c，中、下)都說明了U2HR在翻譯水平對其下游HR基因的mORF進行表達調(diào)控。因此，本發(fā)明人從基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗證了HR基因5'-UTR區(qū)野生型(WT)和突變型U2HR的對下游基因mORF表達的影B向，RT-PCR的結(jié)果說明了突變型的U2HR對下游基因的轉(zhuǎn)錄沒有影響，而熒光素酶活性及免疫印跡的結(jié)果均從翻譯水平證實了突變型的U2HR可以不同程度地消除對下游基因的抑制作用。實施例3:U2HR編碼的多肽分子具有普遍的翻譯抑制功能1、U2HR編碼肽對下游熒光素酶基因翻譯的抑制作用質(zhì)粒構(gòu)建本發(fā)明人首先通過HindlII/BamHI雙酶切位點從pGL3-promoter質(zhì)粒(Promega)上將帶有完整熒光素酶基因編碼序列的片段克隆入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中形成pcDNA3.l-Luc構(gòu)建體。隨后通過U2HR-F:5'-AACGAATTCAAGCTTGCCACCATGGCGCAACCTACG-3'(SEQIDN0:42)禾PU2HR-R:5'-AATGAATTCAAGCTTCTAGGGCCGCAGGTT-3'(SEQIDNO:43)引物對從上述實施例2構(gòu)建的野生型(WT)HR-EGFP構(gòu)建體中擴增出U2HR片段，并插入pcDNA3.l-Luc質(zhì)粒的HindIII切點形成pcDNA3.l-U2HR-Luc質(zhì)粒，所有構(gòu)建的質(zhì)粒都經(jīng)過測序驗證。熒光素酶活性檢測HeLa細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。pcDNA3.I-Luc和pcDNA3.l-U2HR-Luc構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)染入24孔培養(yǎng)板的HeLa細胞中，所述兩種質(zhì)粒均設三個平行，同時分別共轉(zhuǎn)染pRL-TK海腎熒光素酶載體作為標化轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)對照質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24小時，裂解細胞并參照DualLuciferase說明書(Promega)在TURNERDESIGNTD20/20儀器上測定相對熒光素酶活性。實驗重復三次。由此結(jié)果(圖5)可見，轉(zhuǎn)染pcDNA3.l-Luc質(zhì)粒的相對熒光素酶活性達497.5，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.l-U2HR-Luc質(zhì)粒的相對熒光素酶活性僅有61.8，提示U2HR對下游熒光素酶基因翻譯強烈的抑制作用。2、U2HR編碼肽對下游EGFP基因翻譯的抑制作用質(zhì)粒構(gòu)建本發(fā)明人通過上述U2HR-F和U2HR-R引物對從上述野生型(WT)HR-EGFP構(gòu)建體中擴增出U2HR片段，并插入到pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒的EcoRI切點形成pEGFP-Nl-U2HR質(zhì)粒，所構(gòu)建質(zhì)粒進過測序驗證。免疫印跡pEGFP-Nl(Clontech)質(zhì)粒和pEGFP-Nl-U2HR構(gòu)建體轉(zhuǎn)染HeLa細胞24小時后，細胞經(jīng)4t:預冷PBS洗滌兩遍后用RIPA緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl，1%NP-40，0.1%SDS)進行裂解。來自轉(zhuǎn)染細胞的蛋白樣品用12%NovexNuPAGETris-Bis膠(Invitrogen)分離，并經(jīng)半干電轉(zhuǎn)儀(BioRad)將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)上。印跡膜經(jīng)含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(10mMTris，pH7.5，150mMNaCl，O.5%Tween-20)封閉后，用鼠源抗FLAGM2單克隆抗體(1:3000)(Sigma—Aldrich)進行雜交，隨后用免疫純(ImmunoPure)過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG(l:3000)(Pierce)的探針進行雜交，最后用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(Pierce)進行顯影。同樣的印跡在用1%SDS-25mM甘氨酸(pH2.0)緩沖液洗脫同一印跡膜后用鼠源抗GFP單克隆抗體(1:3000)(MBL)進行。結(jié)果提示，與空載體pEGFP-Nl(Clontech)相比，pEGFP_Nl_U2HR的EGFP表達量顯著降低(圖6)，說明了U2HR顯著抑制下游EGFP基因的翻譯。[O107]參考文獻l.PausR，CotsarelisG.Thebiologyofhairfollicles.N.Engl.J.Med.341，491-497(1999).2.Ste皿KS，PausR.Controlsofhairfolliclecycling.Physiol.Rev.81，449-494(2001).3.BeaudoinGM3rd，SiskJM，CoublombePA，ThompsonCC.HairtriggersreactivationofhairgrowthbypormotingWntsignaling.PNAS102，14653-14658(2005).4.AlonsoL，F(xiàn)uchsE.Stemcellsintheskin:wastenot,Wntnot.GenesDev.17，1189-1200(2003).5.HuelskenJ，VogelR，Erdma皿B，CotsarelisG，BirchmeierW.beta-Catenincontrolshairfolliclemorphogenesisandstemcelldifferentiationintheskin.Cell105,533-545(2001).6.AndlT，ReddyST，GaddaparaT，MillarSE.WNTsignalsarerequiredfortheinitiationofhairfollicledevelopment.Dev.Cell2,643-653(2002).7.VanMaterD，KolligsFT，DlugoszAA，F(xiàn)earonER.Transientactivationofbeta_cateninsignalingincutaneouskeratinocytesissufficienttotriggertheactivegrowthphaseofthehaircycleinmice.GenesDev.17，1219-1224(2003).8.ItoM，YangZ，AndlT，CuiC，KimN，MillarSE，CotsarelisG.Wnt-d印endentdenovohairfollicleregenerationinadultmouseskinafterwounding.Nature447,316-320(2007).9.Brooke,H.C.Hairlessmice.J.Hered.17:173—174(1926).10.Thompson,C.C.Thyroidhormone-responsivegenesindevelopingcerebellumincludeanovelsyn即totagminandahairlesshomolog.J.Neurosci.16:7832-7840(1996).ll.CichonS，AnkerM，VogtIR，RohlederH，PiitzstiickM，HillmerA，F(xiàn)arooqSA，Al_DhafriKS，AhmadM，HaqueS，RietschelM，ProppingP，KruseR，N6then亂Cloning，genomicorganization,alternativetranscriptsandmutationalanalysi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15gccgcgctctacctccatteg51ctggaggagga皿ccggcgg3gcagcttcc60atcagaggtcctgctgcgctctccgccgcg120ctgcgccctcgccggtgcctctctcctggg180gacccccttccccggcccctcggcctttcc240gtgttccccccggcccggcgccttctctcc300ccggccctccccgcggcgcagcacggagtc360ggcccagaagctggtgcggccgatccgcgc420cgacccctccaacctgcggccctegagcgc480gcgcgctgagcag3C3g3gcgggag皿cgc540gctggcccatggggagcaggcgcccggtgc600cgaccggccggtgaagcccagggacccccc66020tctggg卿gccccatgagggcagg卿gtg691〈210>6〈211>20〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉HRUP3F1〈400>6aatcacgggctcctgtttcc20〈210>7〈211>20〈212>醒〈213〉Artificial〈220〉〈223〉HRUP3R1〈400>7cgttctcccgctctgtctgc20〈210>8〈211>66〈212>DNA〈213>Homosapiens〈400>8atggggagcaggcgcccggtgccggccacgacgaccgccaccgcccgcgccgcgaccggc60cggtga66〈210>9<211>17〈212>DNA〈213>Homosapiens〈400>9EltgElgggCElgg卿gtg17〈210>10〈211>20〈212>DNA〈211>20〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉ATAACR<400>11ctagggtgcatgtgggtttc〈210>12〈211>23〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉D8S405F<400>12ggctgtgggatatcactegaagg〈210>13〈211>23〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉D8S405R〈400>13ggtgggaaaactgagggattcac〈210>14〈211>19〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉D8S1786F〈400>14Cg朋3g3ttg3g3CCCC3t〈210>15〈211>17〈212>DNA〈213〉Artificial〈220>〈223〉D8S1786R〈400>15gtttccacaccgaagcci兌明書19/26頁2023231917〈210>16〈211>20〈212〉DNA〈213〉Artificial<220>〈223〉D8S1733F<400>16cacagtctcaaactcctggg〈210>17〈211>20<212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223〉D8S1733R〈400>173cg朋a朋ccatg朋c朋g3〈210>18〈211>55〈212>DNA〈213〉Artificial〈220>〈223>EcoRI-SacII-up〈400>18agctggcattccggtectgttggtaaagccagaattcgtctgcaggaccgcggca〈210>19〈211〉55〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉<223>EcoRI-SacII-down〈400>19catgtgccgcggtcctgcagacgaattctggcttteccaacagteccggaatgcc〈210>20〈211>28〈212>醒〈213〉Artificial〈220〉〈223>UlHRm-F〈400>20gttgcgcttctggcgacggcg;atc3g3g<210>21〈211>28〈212〉DNA〈213〉Artificial<220>〈223>UlHRm-R〈400>21ctctgatcgccgtcgccagaagcgcaac<210>22〈211>24〈212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223>U3HRm-F〈400>22cccggagctggcccacggggagca<210>23〈211>24〈212>DNA〈213〉Artificial<220>〈223>U3HRm-R〈400>23tgctccccgtgggccagctccggg<210>24〈211>25〈212>DNA〈213>Artificial〈220〉〈223>U4HRm-F〈400>24gggagagccccacgagggc;agg卿〈210>25〈211>25〈212>DNAtctcctgccctcgtggggctctccc〈210>26〈211>27〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-7C〉T-F〈400>26gcgtcccatggcgtaacctecggcctc〈210>27〈211>27〈212>DNA〈213>Artificial〈220〉〈223>U2HR-7C〉T-R〈400>27gaggccgteggttacgccatggg3CgC〈210>28〈211>27<212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-71T>A_F〈400>28gtgccgcatcctgcagaacccggagtc<210〉29〈211>27〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-71T〉A-R〈400>29gactccgggttctgcaggatgcggcac〈210>30〈211>27〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉22/26頁2527272727〈223>U2HR-73C〉G-F〈400〉30catcctgcagatcgcggagtCCg3CCC〈210>31〈211>27〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-73C〉G-R〈400>31gggtcggactccgcgatctgcaggatg〈210>32〈211>25〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-82G>C_F〈400>32atcccggagtcccacccctcc皿cc〈210>33〈211〉25〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-82G〉C-R〈400>33ggttggaggggtgggactccgggflt〈210>34〈211>27〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-76G〉A-F〈400>34cctgcagatcccgaagtccgacccctc〈210>35〈211>27〈212>DNA〈213>Artificial23/26頁2727252527〈220〉〈223>U2HR-76G>A-R〈400>35gaggggtcggacttcgggatctgcagg〈210>36〈211〉20〈212>DNA〈213>Artificial〈220〉<223>GFP-F〈400〉36taaacggccacaagttcagc20〈210>37〈211>22〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>GFP-R〈400>37ggtggtgcagatgaacttcagg22<210>38〈211〉20〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>Neo-F〈400>38cttgccgaatatcatggtgg20〈210>39〈211>22〈212>DNA<213>Artificial〈220〉〈223>Neo_R〈400>39aagctcttcagcaatatcacgg22〈210>40〈211>36〈212>DNA27〈213〉Artificial<220>〈223〉U2HR-F〈400〉40aacgaattcaagcttgccaccatggcgc朋cctecg〈210>41〈211>30〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HR-R〈400>41朋tgaattcaagcttctegggccgcaggtt30〈210〉42<211>33〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223〉U2HR-WT-F〈400>42gcgaattcgagcagcttccccactctcagttgc33〈210>43〈211〉23〈212>DNA<213>Artificial<220>〈223〉U2HR-WT-R〈400〉43ctttcaggtgtcagaatgtgtgg23<210>44<211>21〈212〉DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HRm/Ml-F〈400>44gcgtcccacggcgcaacctac21〈210〉45〈211>21〈212>DNA〈213〉Artificial〈220〉〈223>U2HRm/Ml-R〈400>45gteggttgcgccgtgggacgc2權利要求一種多核苷酸，其包含編碼如SEQIDNO1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。2.權利要求1的多核苷酸，其包含如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。3.權利要求1或2的多核苷酸，其是翻譯調(diào)節(jié)元件。4.一種抑制靶基因表達的方法，所述方法包括將權利要求1至3中任一項的多核苷酸插入至耙基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為耙基因mRNA中的5'-UTR元件抑制其下游的靶基因mORF的翻譯。5.—種載體，其包含權利要求1至3中任一項的多核苷酸。6.—種多肽，其包含如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列。7.—種抗體，其特異性結(jié)合選自如下一組的多肽a)包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列組成的多肽；禾口c)通過在SEQIDN0:1所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。8.—種用于診斷MarieU皿a遺傳性稀毛癥的寡核苷酸，所述寡核苷酸與位于SEQIDNO:5的第1-370位或第476-691位核苷酸內(nèi)的一段核苷酸序列互補。9.權利要求8的寡核苷酸，其具有選自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核苷酸序列。10.—種用于診斷MarieU皿a遺傳性稀毛癥的寡核苷酸，所述寡核苷酸特異性結(jié)合如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列或其突變體。11.權利要求8至10中任一項的寡核苷酸在制備用于診斷MarieU皿a遺傳性稀毛癥的診斷試劑盒中的用途。12.—種用于診斷MarieU皿a遺傳性稀毛癥的診斷試劑盒，其包含一或多種權利要求8至10中任一項的寡核苷酸。13.—種多核苷酸，其包含編碼如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列。14.權利要求13的多核苷酸，其包含如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。15.權利要求13或14的多核苷酸，其是翻譯調(diào)節(jié)元件。16.—種上調(diào)靶基因表達的方法，所述方法包括將權利要求13至15中任一項的多核苷酸插入至耙基因的5'-UTR區(qū)的步驟，其中所述多核苷酸作為耙基因mRNA中的5'-UTR元件上調(diào)其下游的靶基因mORF的翻譯。17.—種載體，其包含權利要求13至15中任一項的多核苷酸。18.—種多肽，其包含如SEQIDN0:3所示的氨基酸序列。19.一種抗體，其特異性結(jié)合選自如下一組的多肽a)包含SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDN0:3所示的氨基酸序列組成的多肽；禾口c)通過在SEQIDN0:3所示的氨基酸序列中進行一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加而產(chǎn)生的多肽。20.篩選能夠調(diào)節(jié)耙基因的翻譯效率的化合物的方法，所述方法包括在合適的系統(tǒng)中，使候選化合物與具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的多肽或具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸相接觸，由此篩選能夠增強或抑制所述多肽或多核苷酸調(diào)節(jié)靶基因的翻譯效率的能力的化合物。21.—種藥物組合物，其包含權利要求1至3中任一項的多核苷酸、權利要求5的載體、權利要求6的多肽、或權利要求7的抗體。22.—種藥物組合物，其包含權利要求13至15中任一項的多核苷酸、權利要求17的載體、權利要求18的多肽、或權利要求19的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及用于在mRNA翻譯水平調(diào)控基因表達的翻譯調(diào)節(jié)元件。具體地，本發(fā)明涉及hairless基因5’-UTR中的翻譯調(diào)節(jié)元件及其用途。本發(fā)明還提供用于診斷MarieUnna遺傳性稀毛癥的方法、寡核苷酸和試劑盒。文檔編號A61K48/00GK101768591SQ20081018770公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權日2008年12月31日發(fā)明者何春滌,劉揚,華芮,孫淼,張學,溫雅然,王凱波,許藝明申請人:中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所