專利名稱：：一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜及制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜及制備方法，屬于生物材料領域。
背景技術：
：通過對醫(yī)用高分子材料的表面改性，一方面可以提高血液相容性，另一方面還可保持其原有的良好物理機械性能。材料表面改性的方法包括(l)吸附或涂層，技術簡便有效但改性表面不能長效穩(wěn)定存在。(2)等離子體、輝光放電和電暈放電技術，應用廣泛但表面接枝不均一，工藝難以放大。(3)表面接枝聚合，可以將特定的官能團固定在材料表面，具有長效性。(4)表面分子自組裝，分子自發(fā)通過化學鍵牢固吸附在固體表面而形成的一種有序分子組合體。這些表面改性的方法可以綜合分為共價和非共價的改性。其中，共價改性的穩(wěn)定性最好，在醫(yī)用材料領域更能延長生物活性分子的壽命，防止代謝和持續(xù)活性。因此，近年來利用共價連接生物組分對高分子進行修飾改性成為高分子材料領域的研究焦點。在抗凝血材料的研究中，表面肝素化是直接且行之有效的方法。在人體內，內皮細胞等與血液接觸的細胞能夠分泌硫酸肝素或肝素等物質，保持血液在循環(huán)的過程中不凝固。肝素是由硫酸D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸組成的粘性多糖，作為目標抗凝血藥物需要測到極微量，正常人血漿中含量極少，僅0.09mg/L。其抗凝血作用主要通過抗凝血酶ni和肝素輔助因子n、活化的蛋白抑制物發(fā)揮抗凝作用，其中ATin占80n/。。利用肝素提高醫(yī)用高分子材料的抗凝血性能已經(jīng)有幾十年的歷史，眾多的實驗及臨床效果早已肯定了肝素對提高材料抗凝血性能的積極作用，而且近年來的研究結果表明肝素可減少高分子材料介入所引起的細菌感染。肝素可以通過物理或化學的方法與醫(yī)用高分子材料結合。物理方法具有簡單、有效的優(yōu)點，但有效期短。物理方法主要有物理共混(包括表面共混和、均相共混)和物理吸附(涂層法)。從肝素的利用效果考慮，物理方法不夠理想。化學方法是通過化學鍵將肝素固定于材料上，肝素利用率高，長期效果較好。如果直接把肝素固定在材料表面，會影響肝素的活性。一般是采用先在材料表面接上間隔臂，再將肝素固定在間隔臂上。目前抗凝血藥物主要有肝素、水蛭素、香豆素類，以及抗凝血酶m、尿激酶等，化學接枝的方法由于苛刻的反應條件，容易破壞藥物的生物活性。因此，亟待開發(fā)一種方法，不僅能夠保持抗凝血藥物生物活性、而且能夠使材料具有緩釋長效的抗凝血功能。微膠囊是藥物控釋應用廣泛的方法，而且微膠囊能夠將酶、蛋白質和激素等生物活性物質包封在選擇透過性膜中，形成"生物微膠囊"，對生物活性分子控釋的同時也起到很好的保護作用。通過兩種或兩種以上帶相反電荷的聚合物電解質在模板核上凝聚而成的，即層層自組裝(layer-by-layerself-assembly)的微膠囊技術，層層自組裝法制備條件溫和，微囊大小、厚度和釋放可調控，而且微膠囊結構和性能多樣。聚乳酸是繼聚乙醇酸之后第二類經(jīng)FDA批準可用于人體的可降解聚合物材料。相對于其他的人工合成高分子材料，它具有良好的生物相容性、可降解吸收性和一定的機械強度等優(yōu)點。本發(fā)明通過引入層層自組裝的微膠囊對抗凝血物質進行保護與可控釋放，然后利用共價連接將微膠囊固定在聚乳酸膜材料表面，最終獲得了具有良好抗凝血活性的抗凝血材料。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種應用在抗凝血醫(yī)用材料上的利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜及其制備方法。本發(fā)明的目的由以下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明的一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，由共價鍵連接的聚乳酸膜和載肝素微膠囊組成，其中載肝素微膠囊是以海藻酸鈣模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。其組分質量百分比如下聚乳酸膜90%~99%海藻酸鈣微球0.1%~10%聚烯丙胺0.001%~1%肝素0.001%~1%所述的聚乳酸膜厚度為50100pm，聚乳酸的分子量為200~500Kd。所述海藻酸鈣微球尺寸大小250|im，載肝素含量150pg/個微膠囊。本發(fā)明的一種利用載肝素微膠囊表面修飾聚乳酸膜的方法，其具體制備步驟如下步驟一、將聚乳酸在溫度140。C180。C，壓力2025MPa的高溫高壓條件下在注塑機器中制成厚度為50100,的聚乳酸膜。步驟二、室溫下將異辛垸、司班(span)85和1%4%wt海藻酸鈉水溶液以50:1:50~200:1:200的質量比混合，超聲乳化560min，再加入異辛烷和吐溫(Tween)85，繼續(xù)超聲乳化20min以上，然后逐滴加入10%wtCaCl2溶液，充分攪拌20min以上，離心即可得到海藻酸鈣微球；其中再次加入的異辛烷和Tween85與一次乳化后混合液質量比為1:2;200，CaCb與二次乳化后的混合液體積比l:1;步驟三、采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊；步驟四、將第一歩制備好的聚乳酸膜用0.05%wt的NaOH溶液活化5分鐘以上，其中聚乳酸膜與NaOH溶液的質量比為1:1，再用去離子水洗干凈；在室溫，將活化好的聚乳酸膜與l-乙基-3-(3-二甲基氨丙萄-碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在pH為4~7的醋酸-醋酸鈉緩沖液中活化10120min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜。其中，EDC/NHS的摩爾比例為1:1h8，EDC/NHS與聚乳酸膜的材料質量比為1:1~1:5。步驟五、將第三步制得的微膠囊經(jīng)過99.5°/。wt的三乙胺清洗5min以上，其中微膠囊與三乙胺的質量比為1:3~1:10;清洗后的微膠囊與第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜，在pH為4~7的醋酸-醋酸鈉緩沖液孵化10120min，其中微膠囊、具有羧基中間體的聚乳酸膜和醋酸-醋酸鈉緩沖液的質量比為1:100:5001:200:1000;之后將取出孵化后的聚乳酸膜用10%Wt的十二烷基磺酸鈉(SDS)水溶液搖床清洗5分鐘以上，其中每lg的聚乳酸膜需要100ml的SDS水溶液清洗，最后用去離子水洗干凈，即得目標產(chǎn)物。本發(fā)明的一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，可應用于制備具有高效抗凝血活性的復合生物醫(yī)用材料，例如人工血管，心臟瓣膜等血液接觸性有效結果本發(fā)明的利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，無毒，生物相容性好、可降解、具有良好的力學性能和穩(wěn)定長效的抗凝血性能，能夠干燥儲存和運輸，可以廣泛用于抗凝血材料和藥物控制釋放材料。圖l層層自組裝的載肝素微膠囊表面電位；圖2層層自組裝的載肝素微膠囊的紅外光譜對比圖3聚乳酸膜和共價連接微膠囊的聚乳酸膜紅外光譜對比圖。具體實施例方式本發(fā)明以聚乳酸膜為基質材料，采用層層自組裝技術制備的抗凝血微膠囊，采用EDC/NHS催化的共價鍵連接，將微膠囊固定在聚乳酸膜表面，得到力學性能好、抗凝血性能持續(xù)時間長、活性高的聚乳酸膜。本發(fā)明所述的載肝素微膠囊表面修飾聚乳酸膜的制備方法，以下結合實施例進一步說明實施例l1.聚乳酸膜的制備將5公斤聚乳酸放入已經(jīng)預設好溫度140C，壓力25MPa，預設厚度100)om的不銹鋼注塑機器中成膜。2.海藻酸鈣微球模板的制備異辛垸50g、lg的span85和1%(wt)海藻酸鈉水溶液50g，室溫混合，超聲乳化20min，再加入lg的異辛烷和2g的Tween85，繼續(xù)超聲乳化20min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液與10%(wt)CaCl2體積比l:1，充分攪拌20min，離心即可得到海藻酸鈣微球。3.采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。微膠囊囊尺寸、質量、載肝素含量不限制。4.載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的制備將第一步制備好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH溶液5min，用去離子水洗干凈；將活化好的聚乳酸膜與EDC/NHS以10:4:1的比例在pH4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液活化15min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜。5.將第三步制得的微膠囊經(jīng)過0.002M99.5%(wt)的三乙胺清洗5min;微膠囊和第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜在pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中反應20min，之后用10%(wt)十二烷基磺酸鈉(SDS)搖床清洗5分鐘，最后用去離子水洗干凈，得到目標產(chǎn)物。實施例21.聚乳酸膜的制備將5公斤聚乳酸放入已經(jīng)預設好溫度150C，壓力25MPa，預設厚度lOOpm的不銹鋼注塑機器中成膜。2.海藻酸鈣微球模板的制備異辛烷、span85和2%(wt)海藻酸鈉水溶液50:1:50,室溫混合，超聲乳化30min，再加入異辛烷lg和Tween852g，繼續(xù)超聲乳化20min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液與10°/。(wt)CaCl2體積比l:1，充分攪拌20min，離心即可得到海藻酸鈣微球。3.采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。微膠囊囊尺寸、質量、載肝素含量不限制。4.載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的制備將制備好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5min，用去離子水洗干凈；將活化好的聚乳酸膜與EDC/NHS以10:5:l的比例，在pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液活化10min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜。5.將第三步制得的微膠囊經(jīng)過0.002M99.5。/。(wt)的三乙胺清洗5min;微膠囊和第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜在pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中反應30分鐘。之后用10%(wt)十二垸基磺酸鈉(SDS)搖床清洗5分鐘，最后用去離子水洗干凈，得到目標產(chǎn)物。實施例31.聚乳酸膜的制備將5公斤聚乳酸放入已經(jīng)預設好溫度160C，壓力25MPa，預設厚度50|im的不銹鋼注塑機器中成膜。2.海藻酸鈣微球模板的制備異辛烷150、span852g禾卩2%(wt)海藻酸鈉水溶液150g，室溫混合，超聲乳化40min，再加入異辛烷lg和Tween852g，繼續(xù)超聲乳化60min，逐滴加入10%(wt)CaCb溶液，混合液與10°/。(wt)CaCl2體積比l:3，充分攪拌20min，離心即可得到海藻酸鈣微球。3.采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。4.載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的制備將制備好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5min，用去離子水洗干凈；將活化好的聚乳酸膜與EDC/NHS以10:4:3的比例，在pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液活化20min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜。5.將第三步制得的微膠囊經(jīng)過0.002M99.5Q/。(wt)的三乙胺清洗5min;微膠囊和第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜在pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中反應60分鐘。之后用10%(wt)十二烷基磺酸鈉(SDS)搖床清洗5分鐘，最后用去離子水洗干凈，得到目標產(chǎn)物。實施例41.聚乳酸膜的制備將5公斤聚乳酸放入己經(jīng)預設好溫度170C，壓力25MPa，預設厚度lOOpm的不銹鋼注塑機器中成膜。2.海藻酸鈣微球模板的制備異辛烷200、span85lg和2%(wt)海藻酸鈉水溶液200g，室溫混合，超聲乳化50min，再加入異辛垸lg和Tween852g，繼續(xù)超聲乳化60min，逐滴加入10%(wt)CaCl2溶液，混合液與10%(wt)CaCl2體積比l:4，充分攪拌20min，離心即可得到海藻酸鈣微球。3.采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。4.載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的制備將制備好的聚乳酸膜采用0.05%(wt)的NaOH活化5分鐘，用去離子水洗干凈；將活化好的聚乳酸膜與EDC/NHS以10:4:4的比例，在pH6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液活化20min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜。5.將第三步制得的微膠囊經(jīng)過0.002M99.5。/。(wt)的三乙胺清洗5min;微膠囊和第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜在pH7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中反應120分鐘。之后用10%(wt)十二烷基磺酸鈉(SDS)搖床清洗5分鐘，最后用去離子水洗干凈，得到目標產(chǎn)物。上述獲得的載肝素層層自組裝微膠囊經(jīng)過表面Zeta電位分析(如圖1)和紅外光譜表征(如圖2)。微膠囊表面電位表現(xiàn)出有規(guī)律的正負交替變化，電位比較穩(wěn)定，即說明PAH成功地吸附到海藻酸鈉膠體粒子上，肝素也吸附在PAH包裹膠體粒子的表面。海藻酸鈣微球的表面帶有較強的負電，這使得帶正電的PAH納米膜吸附在海藻酸鈣微球的表面，從而微球表面電性改變，呈正電性。帶負電的肝素又吸附到微球的表面，所以微膠囊表面的電荷發(fā)生正負交替變化。海藻酸鈉、肝素、和PAH/Hep的海藻酸鈣微球的紅外表征見圖2，在1590cm'11470cm"左右是N-H和C-H的特征峰，1115cnf^1170cm"是-SC^的特征峰，1740cm"1540cm"是酰胺的特征峰，表明PAH膜上含有胺基基團，海藻酸鈉表面含有羰基基團。3000cm"處的豎峰是制備樣品中的空氣峰。海藻酸鈉具有在15卯cm—11470cm'1左右是N-H和C-H的特征峰，PAH在2800cm"處有C=C的特征峰和2000cm"左右的苯環(huán)特征吸收峰，肝素具有1115cm—11170cm"是-SC^的特征吸收峰，(PAH/Hep/PAH)膜的海藻酸鈣微微膠囊兼具海藻酸鈉、肝素和PAH的特征峰。上述獲得的載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的經(jīng)電鏡照片觀察，顯示聚乳酸膜保持平整，微膠囊的形態(tài)保持完好，聚乳酸膜上的微膠囊數(shù)量大于0.1±0.021個/,2。如圖3，紅外光譜表明15701670cm"之間出現(xiàn)特征峰，說明存在酰胺鍵(酰胺I，1550-1670cm";酰胺II，1500-1570cm")，23002900cm—1之間出現(xiàn)鹵化氨基(PAH)的特征峰。2700-3200cm"之間的羥基峰顯著減少，16201820cm'1之間的羰基峰也顯著減少，說明羧基與氨基發(fā)生縮合反應。載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜的凝血時間實驗將載肝素微膠囊共價連接聚乳酸膜精密裁成3x5mm的小片，置于血凝儀比色杯底部，進行凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)的測定。從表l中可以看出載肝素微膠囊共價連接的聚乳酸膜能顯著延長血漿的血凝時間。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，其特征在于由共價鍵連接的聚乳酸膜和載肝素微膠囊組成，其中載肝素微膠囊是以海藻酸鈣模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊，其組分質量百分比如下聚乳酸膜90％～99％海藻酸鈣微球0.1％～10％聚烯丙胺0.001％～1％肝素0.001％～1％。2、如權利要求1所述的一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，其特征在于所述的聚乳酸膜厚度為50~100ixm，聚乳酸的分子量為200~500Kd，海藻酸鈣微球尺寸大小2~50|^im，載肝素含量150pg/個微膠囊。3、一種利用載肝素微膠囊表面修飾聚乳酸膜的方法，其特征在于具體制備步驟如下步驟一、將聚乳酸在溫度140。C180。C，壓力2025MPa的高溫高壓條件下在注塑機器中制成厚度為50100pm的聚乳酸膜；步驟二、室溫下將異辛烷、span85和1。/b4。/。wt海藻酸鈉水溶液以50:1:50~200:1:200的質量比混合，超聲乳化560min，再加入異辛烷和Tween85，繼續(xù)超聲乳化20min以上，然后逐滴加入10%wtCaCl2溶液，充分攪拌20min以上，離心即可得到海藻酸鈣微球；其中再次加入的異辛烷和Tween85與一次乳化后混合液質量比為l:2:200，CaCl2與二次乳化后的混合液體積比l:1;步驟三、采用靜電層層自組裝技術，以帶負電的海藻酸鈣微球作為模板，聚烯丙胺作為聚陽離子、肝素作為聚陰離子，制備具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊；步驟四、將第一步制備好的聚乳酸膜用0.05%wt的NaOH溶液活化5分鐘以上，其中聚乳酸膜與NaOH溶液的質量比為1:1，再用去離子水洗干凈；在室溫，將活化好的聚乳酸膜與l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)在pH為4~7的醋酸-醋酸鈉緩沖液中活化1(K120min，得到表面具有羧基中間體的聚乳酸膜；其中，EDC/NHS的摩爾比例為h8，EDC/NHS與聚乳酸膜的材料質量比為1:5;聚乳酸膜海藻酸鈣微球聚烯丙胺肝素卯％99%0.1%10%0扁％~1%0鹿％~1%。步驟五、將第三步制得的微膠囊經(jīng)過99.5。/。wt的三乙胺清洗5min以上，其中微膠囊與三乙胺的質量比為1:31:10;清洗后的微膠囊與第四步制得的具有羧基中間體的聚乳酸膜，在pH為47的醋酸-醋酸鈉緩沖液孵化10120min，其中微膠囊、具有羧基中間體的聚乳酸膜和醋酸-醋酸鈉緩沖液的質量比為1:100:5001:200:1000;之后將取出孵化后的聚乳酸膜用10%Wt的十二烷基磺酸鈉(SDS)水溶液搖床清洗5分鐘以上，其中每lg的聚乳酸膜需要100ml的SDS水溶液清洗，最后用去離子水洗干凈，即得目標產(chǎn)物。4、本發(fā)明的一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜，其特征在于用于制備具有高效抗凝血活性的復合生物醫(yī)用材料。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用載肝素微膠囊表面修飾的聚乳酸膜及制備方法，屬于生物材料領域。本發(fā)明由共價鍵連接的聚乳酸膜和載肝素微膠囊組成，其中載肝素微膠囊是以海藻酸鈣模板，具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊。本發(fā)明將采用靜電層層自組裝技術制備的具有聚烯丙胺/肝素/聚烯丙胺結構的3層膜微膠囊與經(jīng)EDC/NHS處理后聚乳酸膜反應，得到目標產(chǎn)物。本發(fā)明無毒，生物相容性好、可降解、具有良好的力學性能和穩(wěn)定長效的抗凝血性能，能夠干燥儲存和運輸，可以廣泛用于抗凝血材料和藥物控制釋放材料。文檔編號A61L33/10GK101444647SQ20081019296公開日2009年6月3日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權日2008年12月31日發(fā)明者娟李,楊新林申請人:北京理工大學