專利名稱：：紅活麻提取物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及中藥，特別涉及中藥材提取物，尤其是具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用的中藥材提取物。
背景技術：
：紅活麻是分布于湖北恩施自治州、宜昌、神農(nóng)架、襄樊等地，主要來源于蕁麻科植物珠芽艾麻Laporteabulbifera(Sieb.etZucc.)Wedd.的干燥根，其干燥莖皮與葉、珠芽亦可藥用。紅活麻性味辛、苦、溫，具有祛風除濕，利水消腫，活血止痛之功效。當?shù)夭烧罆裰笏胨?，治療風濕關節(jié)痛、跌打損傷、營養(yǎng)不良性水腫，效果顯著。因藥材資源分布的局限，目前對它的研究甚微，且僅局限在生藥鑒定方面，對其藥理作用及物質(zhì)基礎的研究國內(nèi)外均未涉及。對于自身免疫病，目前在國內(nèi)外除糖皮質(zhì)激素及毒性較大的免疫抑制藥如CsA和FK506等外，并無較為有效的治療藥物。因此，在我國資源豐富的中藥材中尋找類似糖皮質(zhì)激素作用的抗炎免疫抑制藥是中藥現(xiàn)代化的主要方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的任務是采用活性導向分離提取紅活麻有效部位，觀察其鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用，試圖尋找和發(fā)現(xiàn)其活性部位和作用，旨在提供新的具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用有效提取物和藥物制劑，即提供類似糖皮質(zhì)激素作用的抗炎免疫抑制藥物。實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是本發(fā)明提供的紅活麻提取物是按以下方法制備的提取物a.將紅活麻洗凈晾干，切斷或搗碎，用95%醫(yī)用酒精浸泡，使沒過藥材，每次泡三天，連續(xù)泡五次，混合浸泡液，蒸餾回收酒精，得乙醇濃縮液；b.將所得乙醇濃縮液用蒸餾水混勻后用分析純石油醚萃取，每次萃取體積比為濃縮液與石油醚l:3，混勻后靜置分層，分離石油醚層，重復上述萃取操作若干次，至石油醚層的顏色基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得石油醚部位膏質(zhì)和殘留濃縮液；C.將步驟b所得殘留濃縮液用分析純乙酸乙酯萃取，每次萃取體積比為殘留濃縮液體直至萃取液基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得鄉(xiāng)工'活麻乙酸乙酯部位膏質(zhì)，即本發(fā)明會工活麻提取物。本發(fā)明提供的紅活麻提取物可用于制備具有鎮(zhèn)痛、抗炎和/或免疫抑制作用的藥物，即以紅活麻提取物為活性成分，按常規(guī)方法制備成藥劑，如乳劑、膠囊劑等。本發(fā)明實驗資料一、材料與方法(一)材料1.藥材紅活麻于11月采摘于湖北恩施鶴峰縣曬坪，經(jīng)同濟醫(yī)學院藥學院中藥系生藥學專家鑒定，其根部入藥。2.主要試劑和儀器95%醫(yī)用酒精(湖北省武漢市惠昌物資貿(mào)易公司封裝)、石油醚(沸程60—9(TC)、乙酸乙酯、正丁醇(以上三種試劑均由天津市化學試劑三廠生產(chǎn))，二甲苯、冰醋酸，化學試劑均為分析純；磷酸鹽緩沖液(PBS)、NH4CL紅細胞裂解液、RPMI一1640完全培養(yǎng)液(GIBCO公司，美國)、刀豆蛋白(ConA)(sigma公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Amresco公司，美國)、胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司);IL-4和INF-Y試劑盒(R&D公司);IL-2盒IL-10試劑盒(eBioScience公司);環(huán)胞霉素(CsA)(山東新華制藥股份有限公司)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、YLS-6A智能熱板儀、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、高速冷凍離心機(HERMLE，德國)、XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)、二氧化碳培養(yǎng)箱(Napco，法國)3.動物昆明種小鼠(由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供)雌雄兼用。(二)方法1.藥材提取，藥物制備取湖北恩施產(chǎn)紅活麻6kg，把藥材晾干后剪碎，用95%醫(yī)用酒精浸泡，使沒過藥材，每次泡三天，連續(xù)泡五次，混合浸泡液，蒸餾回收酒精，得乙醇濃縮液1311ml，用蒸餾水混勻后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，混合萃取液，所用試劑均為分析純，蒸餾回收各種溶劑，得到以下不同部位浸膏水部位10.54g;正丁醇部位4.15g;乙酸乙酯部位8.96g;石油醚部位9.60g。每個部位各取500mg,用5mlNS溶解配成高濃度溶液或懸液。從上述高濃度溶液中取出2ml加入2mlNS，配成低濃度溶液(或懸液)。每只小鼠按高f農(nóng)度10mg/10g體重和5mg/10g體重給藥;MTT實驗藥物原濃度為10mg/ml,取10mg用lml蒸餾水溶解，每孔給予10uL。具體提取技術路線及供試液的配制和得率見圖6和圖7。體內(nèi)動物實驗前，將各部位膏劑溶于適量水中制成混懸液，灌胃給藥。體外實驗則采用水溶及DMSO助溶，過濾除菌，配制成不同濃度使用。2.活性部位篩選采用熱板法篩選紅活麻鎮(zhèn)痛作用部位。取體重為22g左右的昆明種小鼠95只，適應性飼養(yǎng)三天后，測定每只小鼠給藥前痛域。將合格的小鼠隨機分成9組，四個部位每個部位高低濃度各一組，每組十只。A組(水提取物高濃度組)、B組(水提取物低濃度組)、C組(正丁醇高濃度組)、D組(正丁醇低濃度組)、E組(乙酸乙酯高濃度組)、F組(乙酸乙酯低濃度組)、G組(石油醚高濃度組)、H組(石油醚低濃度組)、I組(雙蒸水陰性對照組)。其中高低濃度組分別按膏質(zhì)10呢/10g體重和5mg/iOg體重給藥，空白組灌胃給予等劑量雙蒸水，每天給藥一次,連續(xù)給藥一周，在末次給藥后30min、120min、27(kin分別測定其痛域。給藥后痛域超過60秒的按60秒計算。3.MTT比色法體外篩選活性部位制備脾細胞懸液，取正常小鼠的脾臟，PBS洗凈后用尼龍網(wǎng)研成懸液。懸液用PBS洗滌，在1800r/min離心10min，棄去上清液后加入6mL0.84柳仏CL，靜置4rain后加6mlPBS，1800r/min離心7min,棄上清后加10mlPBS混勻。細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1X107ml。配制各個部位的藥用濃度，并依次稀釋為四個濃度梯度，見圖2。將細胞懸液加到96孔板里，每孔100ixL，ConA組每孔加100ul濃度為20ug/ml的ConA，對比組加入與ConA等量的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，給藥量為每孔10yL。陽性藥為環(huán)孢菌素A(CsA)，采用與測試藥相同的配制方法制得10ug/ml溶液。將96孔板置于37。C、5XC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)44小時，于每孔加入20uL的MTT，混勻后再培養(yǎng)46小時，離心去上清，加入150yL的DMSO，混勻靜置數(shù)分鐘后于酶標儀490nm處測定每孔的吸光度值。4.抗炎活性研究乙酸乙酯部位對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響。取健康昆明小鼠40只。體重1822g，隨機分為4組，每組10只。分別按表3所示劑量給藥，每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥一周。陰性對照組灌胃給予等容量NS，陽性對照組腹腔給予阿司匹林80tng/kg體重。末次給藥后1小時(陽性對照組30分鐘)，用微量移液器精密吸取25yL二甲苯于各鼠右耳前后兩面致炎，半小時后再吸取25uL二甲苯涂于同一位置。末次涂完15分鐘后，將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳。用直徑8mm的打孔器分別在兩耳同一部位打下圓耳片，迅速以電子天平稱重。每鼠右耳片減去左耳片重量即為耳片炎癥腫脹度。腫脹抑制率-I對照組平均腫脹度一給藥組平均腫脹度I/對照組平均腫脹度X100X。5.鎮(zhèn)痛作用研究乙酸乙酯部位對熱板法所致疼痛的影響。同上述熱板法，取健康小鼠40只，分成四組，分別為空白組、陽性對照組、乙酸乙酯高濃度組和乙酸乙酯低濃度組。各組的給藥量如表4所示。6.鎮(zhèn)痛作用研究乙酸乙酯對醋酸致小鼠扭體法的影響。取健康昆明小鼠40只，體重1822g，隨機分為4組，每組10只。分別按表5所示劑量給藥，每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥一周。陰性對照組給予等容量NS,陽性對照組灌胃給予阿司匹林80mg/kg體重。給藥后60分鐘(陰性對照組30分鐘)，各鼠腹腔注射0.6X的醋酸溶液0.2ml/只。觀察注射后15分鐘內(nèi)扭體次數(shù)。(扭體的指標為腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸直、臀部高起、蠕行等)計算鎮(zhèn)痛的百分率，比較給藥組與對照組間差異的顯著性。7.免疫抑制作用研究乙酸乙酯部位對T淋巴細胞增殖的影響。實驗的準備工作如上所述，給藥劑量如上述MTT法，但只分空白組、陽性組、乙酸乙酯高濃度和低濃度四個組。8-免疫抑制作用研究乙酸乙酯部位對細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的影響。取細胞培養(yǎng)的上清液按照酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測定INF—Y、IL-2、IL-4和IL-10的含量，操作步驟按試劑盒說明進行。結果單位以pg/ml表示。9.統(tǒng)計方法采用學生t檢驗統(tǒng)計實驗結果。二、實驗結果1.熱板法篩選有效部位的鎮(zhèn)痛作用如表l所示，乙酸乙酯部位在連續(xù)給藥7天后，小鼠痛閾值均較給藥前有所提高，起效較快，藥效持續(xù)時間較長。其它組與乙酸乙酯部位比較，起效慢，作用相對較弱，且毒副作用較大，通過體重指數(shù)可初步判斷，見圖l。此外其它幾個部位的痛閾值不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)下降趨勢。因此乙酸乙酯部位具有一定的鎮(zhèn)痛作用，而且動物體內(nèi)未顯示任何不適和毒性表現(xiàn)。表l:熱板法篩選紅活麻鎮(zhèn)痛作用部位組別給藥且里g/kg給藥前痛閾(s)給藥后不同時間的痛閾(s)給藥30min后痛閾給藥120min后痛閾給藥270min后痛閾空白組陽性組水部位正丁醇部位NS17.50±9.640.0817.21±15.15131.58±11.820.524.56±9.58113.79±8.7322.43土13.4617.14±9.7917.57±10.2320.45±11.9120.83±10.8524.79±15.7942.5±16.5624.18±7.9327.26土9.9323.9±15.1521.23±10.4350±9.0547.87±21.0239.1±29.5619.76±4.46<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與NS比較，**P<0.012.MTT法篩選紅活麻免疫調(diào)節(jié)作用有效部位，見圖2。結果顯示紅活麻各溶劑提取部位中抗細胞增殖能力最強的部位是乙酸乙酯部位。在ConA組里乙酸乙酯部位原濃度組的抑制細胞增殖能力最強，與陽性對照組相當，其它幾個部位與乙酸乙酯部位相比，未見明顯抑制效應。說明乙酸乙酯部位為紅活麻發(fā)揮作用的有效部位。3.乙酸乙酯部位對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響由表2的實驗結果可以看出，高濃度組(浸膏10mg/10g)的腫脹抑制率基本上與陽性對照組相當，高達70.53%。與空白組比較低濃度組也有很高的抑制率，實驗結果表明乙酸乙酯部位具有很強的抗炎作用。表2:乙酸乙酯部位對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響組別劑量動物數(shù)腫脹度(g)腫脹抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>與NS比較*P<0.05，**P<0.01;4.乙酸乙酯部位對熱板法致小鼠疼痛的影響與空白組比較，乙酸乙酯部位高低濃度都具有一定的鎮(zhèn)痛作用，并且起效較快，持續(xù)時間較長，給藥后2個小時仍有一定的鎮(zhèn)痛效應，結果見表3。結合熱板法和醋酸扭體法，提示乙酸乙酯部位具有較好的鎮(zhèn)痛作用。表3:乙酸乙酯部位對熱板法致小鼠疼痛的影響給藥<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>17.50±20.4±25.3±24.7±空白組NS23.0±22.889.6413.4621.4225.7717.21±17.14±34.23±42.50±29.41±陽性組0.0815.159.7920.9616.5623.8015.06±25.34±38.2±34.9±高濃度140.3±17.365.464.42*24.9122.1818.21±12.02±22.38±19.54±40.94±低濃度0.513.477.1615.7515.1422.38與空白組比較*P<0.055.由表4的實驗數(shù)據(jù)可以看到，乙酸乙酯部位對化學剌激引起的疼痛具有很好的抑制作用，高濃度組的鎮(zhèn)痛率達到卯.74%，與阿司匹林的鎮(zhèn)痛效果相當。結合熱板法實驗數(shù)據(jù)，我們可以判斷乙酸乙酯部位具有比較好的鎮(zhèn)痛作用。表4:乙酸乙酯對醋酸致小鼠扭體的影響組另U動物數(shù)劑量反應的動物數(shù)平均扭體次數(shù)鎮(zhèn)痛率％空白組10一1040.5±9.14—陽性組100.08g/kg101.67±1.0395.88低濃度組100.5g/kg1022.5±8.02*44.44高濃度組10lg/kg103.75土2.99林90.74與NS組比*P<0.05，**P<0.016.乙酸乙酯部位MTT法抗細胞增殖作用，見圖3。由圖3可以看出，ConA組的吸光度值明顯比對照組大，這與實驗設計的結果吻合。同時還可以看出隨著給藥濃度的降低，其吸光度值呈上升趨勢，說明乙酸乙酯抑制細胞增殖能力在一定的濃度條件下與藥物的濃度呈現(xiàn)出一定的相關性。此外乙酸乙酯部位的原濃度組的吸光度值與陽性對照值接近，提示乙酸乙酯部位的原濃度組具有明顯的降低ConA刺激的小鼠脾臟T淋巴細胞增殖作用。7.乙酸乙酯部位對上清液INF-y濃度的影響，見圖4、圖5。由圖4的上清液INF-y濃度可以看出，ConA組藥物的原濃度具有明顯的抑制INF-y的作用，與陽性對照CsA相當，并且隨著藥物濃度的降低，上清液中INF-y的量呈上升趨勢，濃度與劑量呈相關性，而對不加CoM組幾乎沒有影響。圖5的結果表明乙酸乙酯部位加ConA8組原濃度具有很強的抑制T細胞分泌IL一2的功能，且與濃度呈相關。綜上所述，乙酸乙酯部位原濃度能顯著的抑制Thl型細胞因子的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的紅活麻提取物即紅活麻乙酸乙酯部位具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用。實驗結果顯示，小鼠連續(xù)給予紅活麻乙酸乙酯部位10mg/10g體重一周后，熱板法測得的小鼠痛閾值顯著提高，抗醋酸所致的炎性疼痛能力也有明顯加強，二甲苯致小鼠耳廓腫脹度與給藥前相比，也有顯著性降低，其對非特異性炎癥和化學刺激引起疼痛的作用與阿司匹林相當，顯示乙酸乙酯部位通過降低毛細血管通透性來發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎作用。在免疫應答的全過程中，不同細胞因子在不同環(huán)節(jié)中分別發(fā)揮重要作用。IFN等誘導抗原遞呈細胞表達MHC分子，從而促進抗原遞呈作用，激活巨噬細胞，促進吞噬和殺傷作用，此外它還是主要的促炎癥因子之一。體內(nèi)極少量的特異性T細胞僅在被抗原激活后通過克隆擴增而產(chǎn)生大量的效應細胞。IL-2在T細胞的增殖和活化過程中發(fā)揮了重要作用。激活的T細胞可表達高親和力的IL-2R(aeY)并分泌IL-2，通過自分泌及旁分泌作用，IL-2與T細胞表面的IL-2R結合，介導T細胞的增殖和分化。本研究發(fā)現(xiàn)，紅活麻乙酸乙酯部位具有很好的抑制T淋巴細胞增殖的作用，且與濃度相關。細胞因子分析顯示，乙酸乙酯部位可降低淋巴細胞上清液中IL-2和INF—Y的分泌。因此，本發(fā)明實驗結果顯示，紅活麻乙酸乙酯部位具有很好的免疫抑制作用，且無明顯的毒副作用。綜上所述，我們在紅活麻藥材中發(fā)現(xiàn)了鎮(zhèn)痛抗炎和細胞免疫抑制作用的有效部位，即紅活麻乙酸乙酯部位，并對其活性進行了多項藥理作用研究。根據(jù)其藥理作用特點，該藥可以作用免疫抑制藥開發(fā)，并用于抗類風濕關節(jié)炎、l型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫病的防治。由于自身免疫病目前在國內(nèi)外除糖皮質(zhì)激素及毒性較大的免疫抑制藥如CsA和FK506等外，并無較為有效的治療藥物。本發(fā)明在我國資源豐富的中藥材中尋找到了類似糖皮質(zhì)激素作用的抗炎免疫抑制藥，其意義重大，應用前景廣闊。圖1為紅活麻不同溶劑部位給藥前后小鼠體重變化；圖2為MTT法篩選紅活麻免疫抑制作用部位；圖3為乙酸乙酯部位MTT法抗細胞增殖作用；圖4為乙酸乙酯部位對上清液INF-y濃度的影響；圖5為乙酸乙酯部位對上清液IL-2濃度的影響；圖6為本發(fā)明紅活麻提取技術路線圖7為本發(fā)明供試液配制；圖8為本發(fā)明紅活麻提取物提取工藝流程圖。具體實施方式實施例1本發(fā)明紅活麻提取物的制備取湖北恩施產(chǎn)紅活麻6kg，把藥材晾干后剪碎，用95%醫(yī)用酒精浸泡，使沒過藥材，每次泡三天，連續(xù)泡五次，混合浸泡液，蒸餾回收酒精，得乙醇濃縮液1311ml,將所得乙醇濃縮液用蒸餾水混勻后用分析純石油醚萃取，每次萃取體積比為濃縮液與石油醚1:3，混勻后靜置分層，分離石油醚層，重復上述萃取操作若干次，至石油醚層的顏色基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得到石油醚部位9.60g和殘留濃縮液，舍棄石油醚部位，將殘留濃縮液用分析純乙酸乙酯萃取，每次萃取體積比為濃縮液與石油醚1:3，混勻后靜置分層，分離石油醚層，重復上述萃取操作若干次，直至萃取液基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得到本發(fā)明紅活麻乙酸乙酯部位提取物8.96g。實施例2本發(fā)明紅活麻提取物乳劑的制備處方乙酸乙酯部位浸膏、硬脂酸甘油、硬脂酸、白凡士林、液狀石蠟、甘油、十二烷基硫酸鈉、輕苯乙脂、蒸餾水等。制法取硬脂酸甘油酷、硬脂酸、白凡士林及液狀石蠟加熱熔化為油相。另將甘油及蒸餾水加熱至90°C，再加入十二烷基硫酸鈉及輕苯乙醋溶解為水相。然后將水相緩緩倒入油相中，邊加邊攪，直至冷凝，即得乳劑型基質(zhì)，將備好的乙酸乙酯部位浸膏加入上述基質(zhì)中，攪拌均勻即可。實施例3本發(fā)明紅活麻提取物膠囊劑的制備處方紅活麻乙酸乙酯部位膏質(zhì)粉末、淀粉、微晶纖維素、滑石粉、縮甲基淀粉鈉、75%乙醇。制法將原輔料按一定比例混勻過IOO目篩，加潤濕劑75%乙醇，用玻璃棒攪拌制粒，烘干，灌膠囊。權利要求1.紅活麻提取物，其特征在于它是按以下方法制備的提取物a.將紅活麻洗凈晾干，切斷或搗碎，用95％醫(yī)用酒精浸泡，使沒過藥材，每次泡三天，連續(xù)泡五次，混合浸泡液，蒸餾回收酒精，得乙醇濃縮液；b.將所得乙醇濃縮液用蒸餾水混勻后用分析純石油醚萃取，每次萃取體積比為濃縮液與石油醚1∶3，混勻后靜置分層，分離石油醚層，重復上述萃取操作若干次，至石油醚層的顏色基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得石油醚部位膏質(zhì)和殘留濃縮液；c.將步驟b所得殘留濃縮液用分析純乙酸乙酯萃取，每次萃取體積比為殘留濃縮液體直至萃取液基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得紅活麻乙酸乙酯部位膏質(zhì)，即本發(fā)明紅活麻提取物。2.權利要求1所述的紅活麻提取物在制備鎮(zhèn)痛、抗炎和/或免疫抑制作用藥物中的應用。3.—種具有鎮(zhèn)痛、抗炎和/或免疫抑制作用藥物制劑，其特征在于，它是以權利要求l所述的紅活麻提取物為活性成分，按常規(guī)方法制備的藥劑。4.一種紅活麻提取物的制備方法，包括以下步驟-a.將紅活麻洗凈晾干，切斷或搗碎，用95%醫(yī)用酒精浸泡，使沒過藥材，每次泡三天，連續(xù)泡五次，混合浸泡液，蒸餾回收酒精，得乙醇濃縮液；b.將所得乙醇濃縮液用蒸餾水混勻后用分析純石油醚萃取，每次萃取體積比為濃縮液與石油醚1:3，混勻后靜置分層，分離石油醚層，重復上述萃取操作若干次，至石油醚層的顏色基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得石油醚部位膏質(zhì)和殘留濃縮液；C.將步驟b所得殘留濃縮液用分析純乙酸乙酯萃取，每次萃取體積比為殘留濃縮液體直至萃取液基本為無色，混合萃取液，蒸餾回收溶劑，得紅、活麻乙酸乙酯部位膏質(zhì)，即本發(fā)明鄉(xiāng):u舌麻提取物。全文摘要本發(fā)明提供了一種紅活麻提取物，它是將紅活麻經(jīng)95％醫(yī)用酒精浸泡，蒸餾回收酒精，將所得的乙醇濃縮液用石油醚萃取后的殘留濃縮液再經(jīng)乙酸乙酯萃取所得的膏質(zhì)。實驗證明，該紅活麻提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用。文檔編號A61P37/06GK101675942SQ20081019698公開日2010年3月24日申請日期2008年9月18日優(yōu)先權日2008年9月18日發(fā)明者明向,蘇志強申請人:華中科技大學