專利名稱：：一種莢膜多糖純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，尤其涉及有莢膜細(xì)菌的莢膜多糖的處理方法。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域熟知對(duì)于致病菌感染可以采用疫苗來進(jìn)行預(yù)防。目前，常用于預(yù)防致病菌感染的疫苗包括菌體疫苗和亞單位疫苗。菌體疫苗可以通過滅活細(xì)菌或?qū)χ虏【M(jìn)行減毒來制備，而亞單位疫苗則通過提取致病菌的蛋白質(zhì)和/或多糖來制備。多糖疫苗是通過純化細(xì)菌的多糖(例如莢膜多糖)而制備的一類疫苗。已經(jīng)上市使用的多糖疫苗包括b型流感桿菌多糖疫苗、腦膜炎球菌多糖疫苗、肺炎球菌多糖疫苗和傷寒Vi多糖疫苗等。然而，多糖疫苗對(duì)2歲以上兒童、少年、青年和成人有效，但對(duì)2歲以下幼兒效果不佳，有的還能導(dǎo)致免疫抑制等不良效果。將多糖偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上構(gòu)成多糖-蛋白結(jié)合疫苗可以改善多糖疫苗在2歲以下幼兒中的免疫原性，為這些高危易感人群提供保護(hù)。第一個(gè)成功的多糖結(jié)合疫苗是b型流感桿菌結(jié)合疫苗，隨后又研制成功腦膜炎球菌結(jié)合疫苗和肺炎球菌結(jié)合疫苗?？梢灾苯佑眉兓亩嗵墙?jīng)過修飾或未經(jīng)修飾與經(jīng)過修飾或未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)通過化學(xué)鍵偶聯(lián)，也可以在偶聯(lián)前將純化的多糖經(jīng)過適當(dāng)降解處理。不論是制備多糖疫苗還是多糖結(jié)合疫苗，首要的步驟就是從細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多糖。通常高分子量、具有免疫原性的細(xì)菌多糖可用于制備多糖疫苗?，F(xiàn)有技術(shù)中公開了從細(xì)菌中提取多糖的方法，例如Gotshlich在US3636192中描述了一般的多糖提取方法。通常，用培養(yǎng)罐培養(yǎng)細(xì)菌，從全培養(yǎng)物或經(jīng)過離心除去菌體的上清液中提制多糖。先用陽離子去污劑沉淀多糖，離心收集沉淀物；用氯化鈣解離后，加入乙醇沉淀核酸等雜質(zhì)；離心收集上清液，再用乙醇沉淀出粗多糖。用醋酸鈉溶解所得粗多糖，再用苯酚進(jìn)行抽提，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。經(jīng)過離心分離水相和有機(jī)相，用乙醇將多糖從水相中沉淀出來，經(jīng)過無水乙醇、丙酮洗滌并干燥，最終制得精制多糖。在提取過程中也可以采用超速離心去除內(nèi)毒素。精制多糖可以用于制備多糖疫苗或結(jié)合疫苗。其中，現(xiàn)有技術(shù)中去除蛋白質(zhì)除了常用的苯酚抽提外，也可以用氯仿/正丁醇混合液抽提。由于苯酚和氯仿都是有毒有害的化學(xué)危險(xiǎn)品，有致癌的危險(xiǎn)性，對(duì)工作條件、人員保護(hù)、污水處理等有較高要求。因此，在提制多糖過程中，盡量避免使用上述有毒害化學(xué)試劑是非常有益的。有人嘗試用層析法純化多糖(黃鎮(zhèn)等，CN200610048875.4;PatoTP等，JChromatB，2006，832:262-267.)。但這種方法操作復(fù)雜、處理量小、成本高，不易用于規(guī)模生產(chǎn)。Hamidi等描述了用脫氧膽酸鈉鹽去除蛋白質(zhì)的方法(US20070065460)，該方法可用于b型流感桿菌多糖的提制。然而，該方法所用試劑脫氧膽酸鈉鹽低毒，具有表面活性作用，對(duì)粘膜具有不可逆的損傷作用。Costantino描述了用乙醇將陽離子去污劑沉淀的多糖重新溶解和多步驟過濾/超濾的方法(CN02812444.8，EP1741442)，用于提制A、Y、W135群腦膜炎球菌多糖。但該方法后續(xù)步驟較為復(fù)雜，需經(jīng)多步過濾、篩分過濾或超濾，且提取物質(zhì)的得率低。目前，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)出一種適用于從帶莢膜細(xì)菌中簡(jiǎn)便、高效、低成本地分離純化莢膜多糖，并避免使用有毒有害化學(xué)試劑的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是提供一種細(xì)菌莢膜多糖的處理方法，該方法可簡(jiǎn)便、可控、安全、有效地獲得高純度莢膜多糖。與其它方法相比，本發(fā)明的方法不使用有毒試劑苯酚或氯仿，提高多糖的回收率，簡(jiǎn)化操作流程。本發(fā)明的另一目的是提供一種用上述處理方法所獲得的莢膜多糖及其用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種細(xì)菌莢膜多糖的處理方法，所述方法包括(a)在含細(xì)菌莢膜多糖的沉淀物中加入終濃度為20-30體積％的低級(jí)醇，從而溶解所述莢膜多糖，形成混合液；(b)對(duì)步驟(a)的所述混合液進(jìn)行固液分離，然后收集上清液；(c)在步驟(b)所得上清液中加入終濃度為60_90體積％的低級(jí)醇，從而形成含細(xì)胞莢膜多糖的粗沉淀物，然后收集所述粗沉淀物；(d)在粗沉淀物中加入終濃度為30-70體積％的低級(jí)醇，從而使所述粗沉淀物中的多糖處于溶解狀態(tài)，然后對(duì)形成的混合液進(jìn)行固液分離，收集上清液；(e)在步驟(d)所得上清液中加入終濃度為60-90體積％的低級(jí)醇溶液，從而形成莢膜多糖沉淀物；(f)收集步驟(e)中所得的莢膜多糖沉淀物，即為純化的細(xì)菌莢膜多糖，其中，步驟(c)和步驟(e)中的低級(jí)醇終濃度高于步驟(d)中的低級(jí)醇終濃度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞莢膜多糖沉淀物是通過對(duì)生物樣品進(jìn)行處理而獲得的沉淀物。在另一優(yōu)選例中，所述的生物樣品是帶莢膜菌的培養(yǎng)物、帶莢膜菌的培養(yǎng)液、培養(yǎng)物或培養(yǎng)液的離心上清液、含有細(xì)菌裂解碎片的混懸液、或它們的混合物或濃縮物，所述生物樣品優(yōu)選為帶莢膜菌培養(yǎng)液的離心上清液或濃縮物。在一個(gè)優(yōu)選例中，用化學(xué)、物理、酶或它們的組合處理生物樣品以獲得含有莢膜多糖的沉淀物。在另一優(yōu)選例中，采用陽離子去污劑、低級(jí)醇處理生物樣品以獲得含有莢膜多糖的沉淀物。所述陽離子去污劑優(yōu)選十六烷基三甲銨鹽或十四烷基三甲銨鹽，更優(yōu)選十六烷基三甲基溴化銨。在另一優(yōu)選例中，采用機(jī)械破碎或超聲波破碎處理生物樣品以獲得含有莢膜多糖的沉淀物。在另一個(gè)優(yōu)選例中，采用核酸酶和/或蛋白酶處理生物樣品以獲得含有莢膜多糖的沉淀物。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述沉淀物中含有細(xì)菌莢膜多糖、蛋白質(zhì)、核苷酸和/或它們的片段。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)菌選自下組腦膜炎奈瑟菌、無乳鏈球菌、嗜血流感桿菌、肺炎鏈球菌、或傷寒沙門菌。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述生物樣品獲自腦膜炎奈瑟菌血清群A(以下簡(jiǎn)稱A群流腦)、腦膜炎奈瑟菌血清群C(以下簡(jiǎn)稱C群流腦)、腦膜炎奈瑟菌血清群Y、腦膜炎奈瑟菌血清群W135、b型流感桿菌、或傷寒沙門菌。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述低級(jí)醇選自乙醇、甲醇、l-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2_丁醇、2_甲基-1-丙醇、2_甲基-2-丙醇或丙二醇。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述低級(jí)醇選自乙醇、甲醇、或1-丙醇，最優(yōu)選乙醇。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述低級(jí)醇為100%醇或溶液形式，優(yōu)選為水溶液、鈣鹽溶液、或鈉鹽溶液，更優(yōu)選所述低級(jí)醇溶液中低級(jí)醇與溶劑的體積比為70-99:30-1，優(yōu)選75-95:25-5。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述低級(jí)醇含有鈣鹽、鈉鹽、鉀鹽或鎂鹽，所述鹽濃度為0.01-2.5M，鹽與低級(jí)醇的比例可為10:4-10:22(v:v)。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述鹽為鈣鹽或鈉鹽，優(yōu)選CaCl2或NaCl，所述鹽濃度優(yōu)選0.1-1.5M。在另一個(gè)優(yōu)選例中，在步驟(d)中可先加入鹽再加入低級(jí)醇、先加入低級(jí)醇再加入鹽、或可同時(shí)加入鹽和醇，從而達(dá)到所需的醇濃度和鹽濃度。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(c)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(a)中低級(jí)醇的終濃度高30_70%，步驟(e)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(d)中低級(jí)醇的終濃度高5-60%。在一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(c)中所述低級(jí)醇的終濃度為60_90%，優(yōu)選65-80%。在另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(d)中所述低級(jí)醇的終濃度為35-65%。在另一優(yōu)選例中，對(duì)于C群流腦菌種采用40-50%的醇濃度，對(duì)于A群流腦菌種可采用50-65%的醇濃度。在另一個(gè)優(yōu)選例中，步驟(e)中所述低級(jí)醇的終濃度為60_90%，優(yōu)選70_80%。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(a)中低級(jí)醇的終濃度高35-65%，優(yōu)選高40-65%，更優(yōu)選高45-60%。在另一優(yōu)選例中，步驟(e)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(d)中低級(jí)醇的終濃度高10-55%，優(yōu)選高20-50%，更優(yōu)選高25-45%。在另一優(yōu)選例中，步驟(c)和步驟(e)中的低級(jí)醇終濃度不同。優(yōu)選步驟(c)中低級(jí)醇的終濃度高于步驟(e)中的低級(jí)醇濃度。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，在步驟(b)和(c)之間或步驟(d)和步驟(e)之間還包括對(duì)上清液進(jìn)行過濾和/或濃縮。優(yōu)選所述過濾選自深度過濾、活性碳過濾、微孔膜過濾或超濾。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對(duì)步驟(e)所得沉淀物進(jìn)行選自下組的一種或多種的處理洗滌、離心、干燥、冷凍干燥或真空干燥。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括以步驟(f)中純化的細(xì)菌莢膜多糖為粗沉淀物，重復(fù)步驟(d)、(e)和(f)一次或多次，從而獲得進(jìn)一步純化的細(xì)菌莢膜多糖。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟(g):將純化的細(xì)菌莢膜多糖與免疫學(xué)上或藥學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑組合，從而形成多糖疫苗、多糖結(jié)合疫苗或藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，采用所述方法獲得的純化的莢膜多糖的產(chǎn)率為30_99%，優(yōu)選50-95%，更優(yōu)選60-92%，最優(yōu)選75-85%。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種純化的細(xì)菌莢膜多糖，所述的細(xì)菌莢膜多糖中的核酸含量《5mg/g，并且，所述細(xì)菌莢膜多糖是用本發(fā)明所述方法制得的。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌莢膜多糖中核酸含量《3mg/g，優(yōu)選《2.5mg/g，更優(yōu)選《lmg/g。在一個(gè)優(yōu)選例中，核酸含量《10mg/g;蛋白含量《10mg/g;用瓊脂糖4B凝膠柱層析法測(cè)定分子量的分布，KD值《0.4。在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)菌莢膜多糖中的蛋白含量《8mg/g，優(yōu)選《5mg/g。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述純化的細(xì)菌莢膜多糖是寡糖。在另一優(yōu)選例中，所述純化的細(xì)菌莢膜多糖是乙酰化的多糖。在本發(fā)明第三方面中，提供了一種組合物，所述組合物包含(i)如前所述的本發(fā)明純化的細(xì)菌莢膜多糖、其免疫原性片段、或它們與載體的結(jié)合物；(ii)免疫學(xué)上或藥學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述組合物為多糖疫苗、多糖結(jié)合疫苗或藥物組合物。在另一優(yōu)選例中，所述載體選自蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、聚合物，優(yōu)選所述載體為蛋白載體，所述蛋白載體優(yōu)選細(xì)菌毒素、類毒素、基因脫毒細(xì)菌毒素、細(xì)菌毒素片段或細(xì)菌菌體蛋白，更優(yōu)選破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、或白喉類毒素突變體。在另一優(yōu)選例中，所述佐劑選自鋁鹽、皂角甙佐劑、完全弗氏佐劑、細(xì)胞活素或鈣鹽，優(yōu)選鋁鹽、*丐鹽，更優(yōu)選氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸牽丐。在另一優(yōu)選例中，所述組合物還包含一種或多種選自下組的活性物質(zhì)抗原或治療劑。所述抗原優(yōu)選選自下組來自腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、傷寒沙門菌、甲肝病毒、乙肝病毒、百日咳博德特氏菌、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、幽門彎曲桿菌、脊髓灰質(zhì)炎和/或流感嗜血菌的抗原。在本發(fā)明的第四方面中，提供了如前述所述的本發(fā)明純化的細(xì)菌莢膜多糖在制備用于預(yù)防或治療帶莢膜致病菌引起的疾病或增強(qiáng)對(duì)帶莢膜致病菌的免疫應(yīng)答的多糖疫苗、多糖結(jié)合疫苗或藥物組合物中的用途。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述。圖1:按照本發(fā)明實(shí)施例1制備C群流腦多糖過程中各時(shí)期的產(chǎn)量(菌號(hào)CMCC29025)。其中，縱坐標(biāo)單位產(chǎn)量(mg/L)是指每L培養(yǎng)液中收獲多糖的mg數(shù)，取樣1-4分別是指培養(yǎng)過程中于5h、6h、7h和7.5h時(shí)取樣。圖2:按照本發(fā)明實(shí)施例2制備C群流腦多糖過程中各時(shí)期的產(chǎn)量(菌號(hào)CMCC29205)。其中，縱坐標(biāo)單位產(chǎn)量(mg/L)是指每L培養(yǎng)液中收獲多糖的mg數(shù)，取樣1_4分別是指培養(yǎng)過程中于6h、7h、8h和9h時(shí)取樣。圖3:按照本發(fā)明實(shí)施例4制備A群流腦多糖過程中各時(shí)期的產(chǎn)量(菌號(hào)CMCC29201)。其中，縱坐標(biāo)單位產(chǎn)量(mg/L)是指每L培養(yǎng)液中收獲多糖的mg數(shù)，取樣1_4分別是指培養(yǎng)過程中于5h、5.5h、6h和6.5h時(shí)取樣。圖4:C群流腦多糖的核磁共振圖譜。圖5:C群流腦結(jié)合疫苗CPS-TT(l)、CPS_TT(2)以及C群流腦多糖(CPS)免疫小鼠2針和3針后血清中的抗C群流腦多糖抗體的幾何平均抗體滴度(GMT)。其中CPS-TT(l)和CPS-TT(2)分別為降解2、3小時(shí)的C群流腦多糖與破傷風(fēng)類毒素的結(jié)合物。圖6:A群流腦結(jié)合疫苗APS-TT以及A群流腦多糖(APS)免疫小鼠2針和3針后血清中的抗A群流腦多糖抗體的幾何平均抗體滴度(GMT)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過長期而深入的研究發(fā)現(xiàn)采用對(duì)哺乳動(dòng)物基本無毒性的低級(jí)醇即可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌莢膜多糖的高效分離和純化處理，而無需使用苯酚或氯仿等有毒試劑，從而成功地獲得了無毒的高純度細(xì)菌莢膜多糖。具體而言，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)用低濃度的低級(jí)醇可溶解含有莢膜多糖的沉淀物，而用高濃度的低級(jí)醇則可使得莢膜多糖從溶液中沉淀出，交替使用低濃度低級(jí)醇和高濃度低級(jí)醇對(duì)含有莢膜多糖的生物樣品進(jìn)行多次溶解和沉淀，可實(shí)現(xiàn)從蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)中分離、純化莢膜多糖的目的。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。發(fā)明人采用生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長后期加入甲醛進(jìn)行殺菌。然后，采用陽離子去污劑，尤其是十六烷基三甲銨鹽(例如十六烷基三甲基溴化銨)沉淀可溶性多糖，并離心收集沉淀物。將所得沉淀物用鹽溶液重新溶解，再加入低級(jí)醇(優(yōu)選乙醇或其水溶液)，保持多糖溶解狀態(tài)，而使雜質(zhì)再次沉淀，所述低級(jí)醇的最終濃度為20%和30%之間。再對(duì)重新溶解的沉淀物離心收集上清液，加入低級(jí)醇(優(yōu)選乙醇或其水溶液)，重新沉淀多糖，所述低級(jí)醇的最終濃度為60%和90%之間。然后離心收集沉淀的粗多糖?？蓪?duì)粗多糖進(jìn)行進(jìn)一步的后處理，例如洗滌、干燥、冷凍干燥等，以利于保存待進(jìn)一步精制。在所述粗多糖中加入低級(jí)醇(優(yōu)選乙醇或其水溶液)重新溶解所述沉淀物，使得最終醇濃度為30%和65%之間。對(duì)重新溶解的粗多糖離心收集上清液，加入低級(jí)醇(優(yōu)選乙醇或其水溶液)再次重新沉淀多糖，最終的醇濃度為60%和90%之間。在上述的所述醇或其溶液可含鹽，優(yōu)選f丐鹽、鈉鹽、鉀鹽或鎂鹽，更優(yōu)選f丐鹽或鈉鹽(如CaCl2或NaCl)，所述鹽濃度為0.01-2.5M，更優(yōu)選0.1-1.5M?？芍苯邮杖【贫嗵腔蛑貜?fù)該精制過程一次或多次由此獲得純度更高的精制多糖?？蓪?duì)精制多糖進(jìn)行進(jìn)一步的后處理，例如洗滌、干燥、冷凍干燥等，以獲得多糖產(chǎn)品。精制多糖或多糖產(chǎn)品可以用于配制疫苗、制備多糖-蛋白結(jié)合疫苗，也可以經(jīng)過適當(dāng)降解或者/和修飾后用于制備多糖_蛋白結(jié)合疫苗。含莢膜多糖的沉淀物在本發(fā)明方法以含細(xì)菌莢膜多糖的沉淀物為初始原料，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化和處理。本發(fā)明的莢膜多糖可以是任何帶莢膜細(xì)菌的莢膜多糖，所述細(xì)菌包括但不限于腦膜炎奈瑟菌，例如腦膜炎奈瑟菌血清群A、腦膜炎奈瑟菌血清群C、腦膜炎奈瑟菌血清群Y或腦膜炎奈瑟菌血清群W135;嗜血流感桿菌，例如b型流感桿菌；無乳鏈球菌，例如B群鏈球菌；肺炎鏈球菌，例如肺炎鏈球菌1型、肺炎鏈球菌2型、肺炎鏈球菌3型、肺炎鏈球菌4型、肺炎鏈球菌5型、肺炎鏈球菌6B型、肺炎鏈球菌7F型、肺炎鏈球菌8型、肺炎鏈球菌9N型、肺炎鏈球菌9V型、肺炎鏈球菌10A型、肺炎鏈球菌11A型、肺炎鏈球菌12F型、肺炎鏈球菌14型、肺炎鏈球菌15B型、肺炎鏈球菌17F型、肺炎鏈球菌18C型、肺炎鏈球菌19A型、肺炎鏈球菌19F型、肺炎鏈球菌20型、肺炎鏈球菌22F型、肺炎鏈球菌23F型或肺炎鏈球菌33F型；傷寒沙門菌。獲取本發(fā)明含細(xì)菌莢膜多糖的沉淀物所用的生物樣品可以采取多種形式，包括但不限于培養(yǎng)帶莢膜細(xì)菌的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液，其中含有細(xì)菌分泌到培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中的部分莢膜多糖；含有帶莢膜細(xì)菌的培養(yǎng)物或培養(yǎng)液；含有細(xì)菌裂解或分解碎片的混懸液；上述生物樣品經(jīng)混合、過濾、離心、濃縮等加工而獲得的含莢膜多糖沉淀物。在本發(fā)明中可采用多種方式來處理生物樣品以獲得含莢膜多糖的沉淀物，例如物理、化學(xué)、酶學(xué)方法或它們的組合。物理處理方法包括但不限于超聲波裂解、機(jī)械破碎、研磨等。化學(xué)處理細(xì)菌的方法包括但不限于加入陽離子去污劑、高濃度鹽溶液、有機(jī)溶劑等?？捎糜谔幚砑?xì)菌的酶包括但不限于核酸梅、蛋白酶等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)對(duì)具體使用的方法和試劑進(jìn)行選擇。優(yōu)選加入陽離子去污劑來處理細(xì)菌以獲得沉淀物，例如十六烷基三甲銨鹽、十四烷基三甲銨鹽，更優(yōu)選加入十六烷基三甲基溴化銨。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，采用了濃度為O.05-0.5%(w/v)、優(yōu)選0.07-0.2%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨來獲取沉淀。采用上述方法獲得的沉淀物中含有莢膜多糖和大量雜質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸或脂類等。低級(jí)醇在本發(fā)明中采用低級(jí)醇來溶解和沉淀莢膜多糖。本發(fā)明所用術(shù)語"低級(jí)醇"是指含有l(wèi)-6個(gè)碳原子的脂肪醇，該術(shù)語中不包括苯酚。在本發(fā)明方法中可采用的低級(jí)醇包括但不限于乙醇、甲醇、l-丙醇、2-丙醇、l-丁醇、2-丁醇、2_甲基-1-丙醇、2_甲基-2-丙醇或丙二醇。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用了乙醇為溶劑。本發(fā)明各步驟中所采用的醇可以是同一種低級(jí)醇，也可以是不同的低級(jí)醇，但優(yōu)選使用同一種低級(jí)醇，更優(yōu)選全部使用乙醇。可以純的形式或混溶物的形式運(yùn)用所述低級(jí)醇，例如可采用100體積％的純低級(jí)醇或其與水的混溶物，如低級(jí)醇與水的70:30-98:2(v:v)混溶物，具體例子為75:25、80:20、90:10、95:5的混溶物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，采用了100%乙醇或乙醇與水的70:30-98:2(v:v)混溶物，優(yōu)選75:25、80:20、90:10、95:5的乙醇水溶液。在本發(fā)明中，術(shù)語"低濃度低級(jí)醇"是指加入提純體系后最終醇濃度低于65%，且可用于溶解含莢膜多糖沉淀物的低級(jí)醇。在本發(fā)明中，術(shù)語"高濃度低級(jí)醇"是指加入提純體系后最終醇濃度高于65%，且可用于使莢膜多糖的溶液析出沉淀的低級(jí)醇。通常，在同一個(gè)溶解、沉淀循環(huán)中，溶解用的低濃度低級(jí)醇比沉淀用的高濃度低級(jí)醇的最終濃度要低20-60%，優(yōu)選低25-50%。在本發(fā)明中，"(低級(jí))醇濃度"或"最終醇濃度"是指醇在提純體系中所占的體積百分比。純化過程如上所述，通過物理、機(jī)械、化學(xué)或酶法所獲得的沉淀物中含有莢膜多糖和多種雜質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸或脂類等，需對(duì)其進(jìn)行溶解以進(jìn)一步去除其中雜質(zhì)以純化所需莢膜多糖。本發(fā)明用低濃度低級(jí)醇溶解從生物樣品獲得的原料沉淀物，收集含有莢膜多糖的上清液，再用高濃度低級(jí)醇使得溶解形式的莢膜多糖沉淀，然后重復(fù)用低濃度低級(jí)醇溶解莢膜多糖、用高濃度低級(jí)醇沉淀的溶解的莢膜多糖的步驟，最終達(dá)到去除雜質(zhì)、獲得純化的莢膜多糖的目的。具體而言，本發(fā)明的方法依次包括以下主要步驟步驟(a):在含細(xì)菌莢膜多糖的沉淀物中加入鹽溶液和終濃度為20-30%(v/v)的低級(jí)醇，從而溶解所述莢膜多糖，形成混合液。所用低級(jí)醇優(yōu)選乙醇，更優(yōu)選乙醇水溶液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)菌的血清型/群，在上述濃度范圍內(nèi)確定最適合的最終醇濃度，例如對(duì)于C群流腦菌種可采用22-28%的醇濃度。步驟(b):對(duì)步驟(a)的所述混合液進(jìn)行固液分離，然后收集上清液。步驟(c):在步驟(b)所得上清液中加入高濃度低級(jí)醇以產(chǎn)生沉淀，使得低級(jí)醇濃度高于步驟(a)中低級(jí)醇的濃度至少30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，然后收集沉淀物。所用低級(jí)醇優(yōu)選乙醇，更優(yōu)選乙醇水溶液。該步驟中低級(jí)醇的濃度優(yōu)選為60_90%，更優(yōu)選65-80%。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)菌的血清型/群，在上述濃度范圍內(nèi)確定最適合的最終醇濃度，例如對(duì)于C群流腦菌種可采用65-75%的醇濃度。步驟(d):在粗沉淀物中加入終濃度為30-70%，更優(yōu)選35-65%的低級(jí)醇，從而溶解所述粗沉淀物，然后對(duì)形成的混合液進(jìn)行固液分離，收集上清液。所用低級(jí)醇優(yōu)選乙醇，更優(yōu)選乙醇水溶液。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)菌的血清型/群，在上述濃度范圍內(nèi)確定最適合的最終醇濃度，例如對(duì)于C群流腦菌種可采用40-50%的醇濃度，對(duì)于A群流腦菌種可采用50-65%的醇濃度。此外，所述低級(jí)醇中可含鹽，例如^鹽、鈉鹽、鉀鹽、或鎂鹽(優(yōu)選^鹽或鈉鹽)，所述鹽濃度通常為0.005-5M，優(yōu)選0.01-2.5M，更優(yōu)選0.5M。鹽與低級(jí)醇的比例可為io:4-10:22(v:v)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)菌的血清型/群，在上述范圍內(nèi)確定最適合的鹽濃度。步驟(e):在步驟(d)所得上清液中加入終濃度為60_90%的低級(jí)醇溶液，從而形成莢膜多糖沉淀物。所用低級(jí)醇優(yōu)選乙醇，更優(yōu)選乙醇水溶液。該步驟中低級(jí)醇的濃度優(yōu)選為60-90%，更優(yōu)選70-80%。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)細(xì)菌的血清型/群，在上述濃度范圍內(nèi)確定最適合的最終醇濃度，例如對(duì)于C群流腦可采用70-78%的醇濃度，對(duì)于A群流腦可采用75-85%的醇濃度。步驟(f):收集步驟(e)中所得的莢膜多糖沉淀物，即為純化的細(xì)菌莢膜多糖。通過步驟(d)-(f)可從步驟(c)所得的粗制莢膜多糖中制得精制的莢膜多糖。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(d)用低級(jí)醇溶解粗沉淀物還可分步進(jìn)行，例如可先加鹽溶解，再加乙醇至終濃度30-65%;或者先加乙醇至終濃度30-65%，再加鹽，從而使多糖處于溶解狀態(tài)而不溶解蛋白等雜質(zhì)。通過步驟(a)主要可去除核酸類雜質(zhì)以及一部分的蛋白質(zhì)和色素等，而通過步驟(d)則可使得所需多糖溶解于醇溶液中，從而與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)分離，還可以進(jìn)一步去除核酸類雜質(zhì)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，步驟(e)的莢膜多糖符合WHO標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)《中華人民共和國藥典》(2005年版，三部，國家藥典委，化學(xué)工業(yè)出版社，2005。以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)附錄IIA和附錄VIB第二法所規(guī)定的測(cè)定方法測(cè)定所得產(chǎn)物中核酸含量《10mg/g，優(yōu)選《5mg/g，更優(yōu)選《3mg/g，最優(yōu)選《lmg/g;蛋白含量《10mg/g，優(yōu)選《8mg/g，更優(yōu)選《5mg/g，最優(yōu)選《lmg/g。應(yīng)理解，可將步驟(f)中所得的純化的細(xì)菌莢膜多糖作為原料，重復(fù)步驟(d)-(f)一次或多次(例如1-5次，優(yōu)選1-3次)，以獲得品質(zhì)更高的莢膜多糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可在本發(fā)明的各步驟中采用本領(lǐng)域常用的方法來收集含有莢膜多糖的沉淀或上清液，這些方法包括但不限于離心、過濾(包括活性碳過濾、超濾、微孔濾膜過濾等)、濃縮、干燥、洗滌、冷凍干燥等。通過本發(fā)明方法制得的莢膜多糖可以是多聚糖、寡聚糖或單體糖，所述糖上可帶有修飾基團(tuán)，例如甲基或乙?；取？蓪?duì)最終獲得的純化莢膜多糖進(jìn)行冷凍干燥、活化等處理以使其適于儲(chǔ)藏或進(jìn)一步使用。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式包括如下步驟(1)采用生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于對(duì)數(shù)生長后期加入甲醛進(jìn)行殺菌；(2)采用陽離子去污劑，尤其是十六烷基三甲銨鹽(例如十六烷基三甲基溴化銨)沉淀可溶性多糖。沉淀之前可以是細(xì)菌培養(yǎng)物、培養(yǎng)物的離心收集上清液，也可以對(duì)收集的上清液進(jìn)行濃縮；(3)沉淀之后，離心收集沉淀物，重新溶解。優(yōu)選的是乙醇水溶液。最終乙醇濃度為20%和30%之間。最適宜的最終乙醇濃度依賴于細(xì)菌血清群/型；(4)對(duì)重新溶解的沉淀物離心收集上清液，重新沉淀多糖。優(yōu)選的是乙醇水溶液。最終乙醇濃度為60%和90%之間。最適宜的最終乙醇濃度依賴于細(xì)菌血清群/型；(5)離心收集沉淀的多糖為粗多糖，重新溶解。優(yōu)選的是乙醇水溶液。最終乙醇濃度為30%和65%之間。最適宜的最終乙醇濃度依賴于細(xì)菌血清群/型。粗多糖重新溶解之前，可以先用無水乙醇洗滌數(shù)次后再用丙酮洗滌數(shù)次，然后干燥；(6)對(duì)重新溶解的粗多糖離心收集上清液，再次重新沉淀多糖。優(yōu)選的是乙醇水溶液。最終乙醇濃度為60%和90%之間。最適宜的最終乙醇濃度依賴于細(xì)菌血清群/型。再次重新沉淀的多糖為精制多糖，可以先用無水乙醇洗滌數(shù)次后再用丙酮洗滌數(shù)次，然后干燥。上述步驟中所用醇或醇溶液中可含鹽，例如在步驟(3)和步驟(4)中，所述鹽可選自牽丐鹽、鈉鹽、鉀鹽或鎂鹽，優(yōu)選f丐鹽或鈉鹽，所述鹽濃度為0.01-2.5M，優(yōu)選0.1-1.5M。純化的莢膜多糖及其應(yīng)用通過本發(fā)明純化方法可獲得純度較高的莢膜多糖，該多糖可單獨(dú)使用、與其它物質(zhì)以混合物形式或組合物形式配伍使用、經(jīng)或不經(jīng)適當(dāng)修飾、活化或降解后形成諸如多糖_蛋白質(zhì)等結(jié)合物的形式使用。本發(fā)明提供了一種組合物，其含有(i)有效量的用本發(fā)明方法純化得到的莢膜多糖、其免疫原性片段或它們與載體的結(jié)合物，以及(ii)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑的組合物。本發(fā)明中，術(shù)語"含有"表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的食品組合物中。因此，術(shù)語"主要由...組成"和"由...組成"包含在術(shù)語"含有"中。本發(fā)明中，術(shù)語"有效量"是指使用時(shí)足以獲得需要的效果而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、剌激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的成分的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)具體情況確定所述有效量。在本發(fā)明中，術(shù)語"藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑"是指本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有或沒有過分的毒性的輔助成分。合適的賦形劑或佐劑是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，藥學(xué)上可接受的賦形劑記載于《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPub.Co.，N.J.1991)。本發(fā)明中可使用的賦形劑包括但不限于填充劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、賦形劑、或緩/控釋劑等。本發(fā)明中可使用的免疫學(xué)上可接受的佐劑可參見例如CN02812444.8，它們包括但不限于鋁鹽、皂角甙佐劑、完全弗氏佐劑、細(xì)胞活素或鈣鹽，優(yōu)選鋁鹽、鈣鹽，更優(yōu)選氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣。本發(fā)明的組合物中，莢膜多糖、其免疫原性片段或它們與載體的結(jié)合物的含量通常為0.1-1.5(w/w)，優(yōu)選0.2-1.0(w/w)，更優(yōu)選0.3-0.7(w/w)。可將本發(fā)明的莢膜多糖或其片段與一種或多種活性物質(zhì)聯(lián)合使用，這些活性物質(zhì)包括但不限于來自腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌、傷寒沙門菌、甲肝病毒、乙肝病毒、百日咳博德特氏菌、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、幽門彎曲桿菌、脊髓灰質(zhì)炎和/或流感嗜血菌的抗原等?？蓪?duì)本發(fā)明的莢膜多糖進(jìn)行或不進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?、活化或降解，再使其與適當(dāng)?shù)妮d體連接，形成諸如多糖-蛋白質(zhì)等結(jié)合物。所述修飾、活化或降解以及連接可按照常規(guī)方法進(jìn)行，例如參照(ChuC，等.InfectImmun，1983，39:245-256或Costantino，等.Vaccine,1992，10:691-698)文獻(xiàn)所記載的方法進(jìn)行。適當(dāng)?shù)妮d體包括但不限于蛋白載體、脂質(zhì)載體、聚合物載體、或無活性的病毒顆粒等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，采用了蛋白載體，所述蛋白載體選自細(xì)菌毒素、類毒素、基因脫毒細(xì)菌毒素、細(xì)菌毒素片段或細(xì)菌菌體蛋白，更優(yōu)選破傷風(fēng)類毒素、白喉毒素或白喉類毒素突變體。本發(fā)明純化的莢膜多糖、或由其衍生的組合物、混合物或結(jié)合物可用于治療或預(yù)防與帶莢膜的致病菌相關(guān)的疾病，例如流行性腦膜炎、腦膜炎、敗血癥、肺炎、中耳炎、會(huì)厭炎、心肌炎或傷寒等。本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防與帶莢膜的致病菌相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括給予對(duì)象治療或免疫有效量的本發(fā)明的純化的莢膜多糖、或由其衍生的組合物、混合物或結(jié)合物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)在整個(gè)提制過程中不使用苯酚、氯仿等危險(xiǎn)程度高、有致癌性的溶劑，與苯酚或氯仿-正丁醇萃取法相比，減少了對(duì)自然環(huán)境的破壞，有效保護(hù)了工作人員的安全；(2)不使用層析方法，簡(jiǎn)便、易操作、且低成本；(3)提制的莢膜多糖純度高、內(nèi)毒素含量低，產(chǎn)量高，重復(fù)性好，操作過程簡(jiǎn)單，可以使質(zhì)量可控，提高產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，減少批間差異。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《臨床免疫學(xué)技術(shù)》(余賀等，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982)、《醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)》(盧錦漢等主編，人民衛(wèi)生出版社，1995)、《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Molecularcloning:Alaboratorymanual,第3版，Sambrook等，ColdSpringHarborLaboratory,2001)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1.C群流腦多糖的提制開啟凍干的C群流腦菌種(菌號(hào)CMCC29025，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)，接種到含10%羊血的普通瓊脂培養(yǎng)基，于35-37t:二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)16小時(shí)。將經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)菌接種到半綜合斜面培養(yǎng)基，于35-37t:二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)16小時(shí)。刮取菌苔，接種至裝有50ml改良半綜合培養(yǎng)基(按照《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用K陳天壽主編，中國農(nóng)業(yè)出版社，1995，第206-207頁>自行配制，培養(yǎng)基主要成分為鹽酸乳酪水解液、谷氨酸鈉、甘氨酸、酵母透析液、氯化銨、硫酸鎂、葡萄糖等)的三角瓶中，于35-37t:振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，按1%(v/v)比例接種5L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基為改良半綜合培養(yǎng)基，培養(yǎng)8小時(shí)。按1%(v/v)比例加入甲醛殺菌30分鐘。放出培養(yǎng)物，經(jīng)4000rpm離心1小時(shí)，合并上清液。按0.1%(w/v)加入十六烷基三甲基溴化銨，于2-8t:放置過夜，使多糖沉淀。經(jīng)4000rpm離心30分鐘，收集沉淀的多糖復(fù)合物。沉淀的復(fù)合物用1MCaC^溶解，加乙醇至乙醇終濃度為25%(v/v)，大部分核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶解。經(jīng)8000rpm離心60分鐘，收集澄清的上清液。再加入乙醇至70%(v/v)，沉淀多糖，其中可能含蛋白質(zhì)、色素、核酸等雜質(zhì)，得到C群流腦粗多糖，濕重6.9g。粗多糖加1MCaCl2和乙醇(乙醇終濃度為35%(v/v))攪拌溶解，經(jīng)8000rpm離心60分鐘，收集澄清的上清液。加入乙醇至80%(v/v)沉淀多糖。離心收集沉淀的多糖，用無水乙醇洗滌2次，再用丙酮洗滌2次，每次洗滌后離心收集沉淀多糖，最后真空干燥，得到精制的多糖1.2g。對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間和收罐樣品進(jìn)行多糖含量測(cè)定，計(jì)算各步驟多糖的產(chǎn)量，見圖1。多糖產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加，在粗多糖提制步驟損失部分多糖，從粗多糖進(jìn)一步精制過程多糖損失少，但雜質(zhì)被有效去除。值得注意的是，圖中所示的多糖產(chǎn)量指的是從取樣測(cè)定值推算的理論產(chǎn)量。實(shí)際收獲物中因?yàn)楹须s質(zhì)、取樣、留樣、損失等原因，可能高于或低于理論值。實(shí)施例2.從5L罐培養(yǎng)物中提制C群流腦多糖開啟凍干的C群流腦菌種(菌號(hào)CMCC29205，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)，同實(shí)施例1進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)、殺菌和收獲培養(yǎng)上清液。在5L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)時(shí)間為10小時(shí)。按0.1%(w/v)加入十六烷基三甲基溴化銨，于2-8t:放置過夜，使多糖沉淀。經(jīng)4000rpm離心30分鐘，收集沉淀的多糖復(fù)合物。沉淀的復(fù)合物用1MCaC^溶解，加乙醇至20X(v/v)，大部分核酸、蛋白等雜質(zhì)不溶解。經(jīng)8000rpm離心60分鐘，收集澄清的上清液。再加入乙醇至70%(v/v)，沉淀多糖。離心收集沉淀的多糖，用無水乙醇洗滌2次，再用丙酮洗滌2次，每次洗滌后離心收集沉淀多糖，最后真空干燥，得到C群流腦粗多糖1.5g，其中可能含蛋白、色素、核酸等雜質(zhì)。粗多糖加1MCaCl2和乙醇(乙醇終濃度40%(v/v))攪拌溶解，經(jīng)8000rpm離心60分鐘，收集澄清的上清液。加入乙醇至75%(v/v)沉淀多糖。同實(shí)施例1離心收集、洗滌、干燥，得到精制的多糖1.0g。對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間和收罐樣品進(jìn)行多糖含量測(cè)定，計(jì)算各步驟多糖的產(chǎn)量，見圖2。與圖1相似，粗制步驟損失部分多糖，但精制步驟能有效去除雜質(zhì)，多糖損失少。對(duì)精制多糖進(jìn)行核磁共振(NMR)分析，顯示典型的C群流腦多糖的NMR譜圖(參見圖4)，與文獻(xiàn)一致(Jones等Biologicals，1991，19:41-47，)。實(shí)施例3.從100L罐培養(yǎng)物中提制C群流腦多糖同實(shí)施例1開啟C群流腦菌種(菌號(hào)CMCC29205，同前)，進(jìn)行細(xì)菌的傳代，按1X(v/v)比例接種100L發(fā)酵罐，培養(yǎng)10小時(shí)。按1%(v/v)比例加入甲醛殺菌l小時(shí)。冷卻培養(yǎng)物至15-2(TC，用連續(xù)流離心機(jī)(CEPA101)離心，收集澄清培養(yǎng)液。按O.1%(w/v)加入十六烷基三甲基溴化銨，于2-8t:放置過夜，使多糖沉淀。同實(shí)施例2處理，獲得經(jīng)4000rpm離心30分鐘，收集沉淀的多糖復(fù)合物，得到粗多糖41g。取5g粗多糖同實(shí)施例2處理，獲得精制多糖2.4g。實(shí)施例4.A群流腦多糖的提制同實(shí)施例1開啟A群流腦菌株(菌號(hào)CMCC29201，購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)，進(jìn)行7h細(xì)菌培養(yǎng)、殺菌、提制粗多糖，獲得粗多糖濕重7.8g。粗多糖用0.02MCaCl2和乙醇(乙醇終濃度為55%(v/v))攪拌溶解，經(jīng)8000rpm離心60分鐘，收集澄清的上清液。加入乙醇至75%(v/v)沉淀多糖。同實(shí)施例l離心收集、洗滌、干燥，得到精制的多糖665mg。對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間和收罐樣品進(jìn)行多糖含量測(cè)定，計(jì)算各步驟多糖的產(chǎn)量，見圖3。多糖產(chǎn)量隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加，在粗多糖提制步驟和進(jìn)一步精制過程多糖有所損失，但雜質(zhì)被有效去除。實(shí)施例5.C群流腦多糖的檢定依據(jù)《中國藥典》附錄方法，對(duì)從實(shí)施例2和3獲得的精制C群流腦多糖以及用苯酚法獲得的C群流腦多糖進(jìn)行檢定，包括核酸含量(附錄IIA)、蛋白含量(附錄VIB第二法)、唾液酸含量(附錄VIC)、0-乙酰基含量(附錄VIC)、多糖分子大小測(cè)定(附錄VIIIG)，和內(nèi)毒素(附錄XIIE)、異常毒性檢查(附錄XIIF)。用苯酚法獲得的多糖，系參照《中國藥典》第34頁"A群腦膜炎球菌多糖疫苗"2.2.5所述方法從100L罐培養(yǎng)物中提取。多糖分子大小系采用瓊脂糖4B凝膠層析法測(cè)定多糖分子量的分布，K。值越小表明分子量越大。結(jié)果如表l所示表1.C群流腦多糖的檢定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上述結(jié)果表明用本發(fā)明提制的C群流腦多糖質(zhì)量完全符合WHO規(guī)程的要求，可以用于疫苗配制，或者經(jīng)過進(jìn)一步加工制備多糖結(jié)合疫苗。用本方法提制的多糖產(chǎn)量(274mg/L培養(yǎng)液)高于苯酚法(144mg/L培養(yǎng)液)；核酸含量大大低于后者，提高了多糖的安全性；所獲得的多糖分子量大于苯酚法，而高分子量多糖具有更好的免疫原性。實(shí)施例6.A群流腦多糖的檢定依據(jù)《中國藥典》，對(duì)從實(shí)施例4獲得的精制A群流腦多糖進(jìn)行檢定，包括核酸含量、蛋白含量、磷含量、0-乙酰基含量、多糖分子大小測(cè)定。結(jié)果如表2所示表2.A群流腦多糖的檢定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上述結(jié)果表明用本發(fā)明提制的A群流腦多糖質(zhì)量完全符合WHO規(guī)程和《中國藥典》的要求，可以用于疫苗配制，或者經(jīng)過進(jìn)一步加工制備多糖結(jié)合疫苗。實(shí)施例7.C群流腦多糖結(jié)合疫苗的制備和免疫效果研究用實(shí)施例2所得的精制C群流腦多糖用pH5的醋酸鹽緩沖液溶解，分別作用2、3小時(shí)使多糖降解，然后對(duì)蒸餾水充分透析后凍干。參照文獻(xiàn)方法(Costantino等.Vaccine,1992,10:691-698)將C群流腦多糖與破傷風(fēng)類毒偶聯(lián)，得到C群流腦多糖結(jié)合疫苗(批號(hào)CPS-TT(l)、CPS-TT(2))。分別用結(jié)合疫苗和C群流腦多糖免疫四周齡NIH小鼠(購自上海生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，間隔2周免疫3針，注射劑量為2.5iig，于第2針和第3針免疫后1周采血，分離血清，用ELISA法測(cè)定血清中抗C群流腦多糖抗體滴度，計(jì)算幾何平均抗體滴度(GMT)。結(jié)果表明結(jié)合疫苗可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平抗C群流腦多糖的抗體，免疫2針和3針后抗體GMT>1:800，而單獨(dú)多糖(CPS)免疫小鼠3針后只能產(chǎn)生很低滴度的抗體(《1:25)，如圖5所示。用本發(fā)明制備C群流腦多糖經(jīng)過降解后制備的結(jié)合疫苗具有比單獨(dú)多糖高得多的免疫原性。實(shí)施例8.A群流腦多糖結(jié)合疫苗的制備和免疫效果研究采用文獻(xiàn)方法(朱為等，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2002，22:299-302)，用實(shí)施例5得到的精制A群流腦多糖與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合，制備A群流腦多糖結(jié)合疫苗(批號(hào)APS-TT)。同實(shí)施例7進(jìn)行小鼠免疫、采血、分離血清，用ELISA法測(cè)定血清中抗A群流腦多糖抗體滴度，計(jì)算幾何平均抗體滴度(GMT)。結(jié)果表明結(jié)合疫苗可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平抗A群流腦多糖抗體，免疫2針后抗體GMT為1:2260，免疫3針后抗體GMT為1:3507;單獨(dú)多糖免疫小鼠3針后，抗體GMT僅為l:46，如圖6所示。用本發(fā)明制備A群流腦多糖制備的結(jié)合疫苗具有比單獨(dú)多糖高得多的免疫原性。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求一種細(xì)菌莢膜多糖的處理方法，所述方法包括(a)在含細(xì)菌莢膜多糖的沉淀物中加入終濃度為20-30體積％的低級(jí)醇，從而溶解所述莢膜多糖，形成混合液；(b)對(duì)步驟(a)的所述混合液進(jìn)行固液分離，然后收集上清液；(c)在步驟(b)所得上清液中加入終濃度為60-90體積％的低級(jí)醇，從而形成含細(xì)胞莢膜多糖的粗沉淀物，然后收集所述粗沉淀物；(d)在粗沉淀物中加入終濃度為30-70體積％的低級(jí)醇，從而使所述粗沉淀物中的多糖處于溶解狀態(tài)，然后對(duì)形成的混合液進(jìn)行固液分離，收集上清液；(e)在步驟(d)所得上清液中加入終濃度為60-90體積％的低級(jí)醇溶液，從而形成莢膜多糖沉淀物；(f)收集步驟(e)中所得的莢膜多糖沉淀物，即為純化的細(xì)菌莢膜多糖，其中，步驟(c)和步驟(e)中的低級(jí)醇終濃度高于步驟(d)中的低級(jí)醇終濃度。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞莢膜多糖沉淀物是通過對(duì)生物樣品進(jìn)行處理而獲得的沉淀物。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)菌選自下組腦膜炎奈瑟菌、無乳鏈球菌、嗜血流感桿菌、肺炎鏈球菌、或傷寒沙門菌。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述低級(jí)醇選自乙醇、甲醇、1-丙醇、2-丙醇、1_丁醇、2-丁醇、2-甲基-1_丙醇、2-甲基-2-丙醇或丙二醇。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述低級(jí)醇含有鈣鹽、鈉鹽、鉀鹽或鎂鹽，所述鹽濃度為0.01-2.5M，鹽與低級(jí)醇的體積比為10:4-10:22。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(c)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(a)中低級(jí)醇的終濃度高30-70%，步驟(e)中低級(jí)醇的終濃度比步驟(d)中低級(jí)醇的終濃度高5-60%。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)和(c)之間或步驟(d)和步驟(e)之間還包括對(duì)上清液進(jìn)行過濾和/或濃縮。8.—種純化的細(xì)菌莢膜多糖，其特征在于，所述的細(xì)菌莢膜多糖中的核酸含量《5mg/g，并且，所述細(xì)菌莢膜多糖是用權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述方法制得的。9.一種組合物，所述組合物包含(i)權(quán)利要求8所述的純化的細(xì)菌莢膜多糖、其免疫原性片段、或它們與載體的結(jié)合物；(ii)免疫學(xué)上或藥學(xué)上可接受的賦形劑或佐劑。10.權(quán)利要求8所述的純化的細(xì)菌莢膜多糖在制備用于預(yù)防或治療帶莢膜致病菌引起的疾病或增強(qiáng)對(duì)帶莢膜致病菌的免疫應(yīng)答的多糖疫苗、多糖結(jié)合疫苗或藥物組合物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種細(xì)菌莢膜多糖純化的處理方法。所述方法包括(a)在細(xì)胞莢膜多糖沉淀物中加入低終濃度低級(jí)醇，溶解所述莢膜多糖形成混合液；(b)對(duì)所述混合液進(jìn)行固液分離并收集上清液；(c)在所得上清液中加入高終濃度低級(jí)醇，形成含細(xì)胞莢膜多糖的粗沉淀物并收集粗沉淀物；(d)在粗沉淀物中加入低終濃度低級(jí)醇，從而使所述粗沉淀物中的多糖處于溶解狀態(tài)；(e)在上清液中加入高終濃度低級(jí)醇溶液，從而形成莢膜多糖沉淀物；(f)收集所得的莢膜多糖沉淀物，即為純化的細(xì)菌莢膜多糖。所述方法簡(jiǎn)便、可控、高效地提高了莢膜多糖的回收率，且不使用有毒試劑苯酚或氯仿，提高了安全性。文檔編號(hào)A61K39/095GK101724085SQ20081020152公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2008年10月22日優(yōu)先權(quán)日2008年10月22日發(fā)明者朱為,江元翔,榮家康申請(qǐng)人:上海生物制品研究所