專利名稱：具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型溫敏納米藥物載體的制備方法，尤其是一種 具有磁性和葉酸雙重耙向的溫敏納米藥物載體的制備方法，以及通過 該制備方法獲得的溫敏納米藥物載體及其用途。
背景技術(shù)：
根據(jù)大量的研究表明，葉酸受體是一種在多種癌細(xì)胞中廣泛過量 存在并且能和葉酸分子發(fā)生特殊相互作用的物質(zhì)。利用葉酸與葉酸受 體特有的相互作用，人們通常將葉酸作為特殊的靶向分子來修飾各種 納米尺寸的抗癌藥物載體，起到對癌細(xì)胞的靶向識別作用，從而提高 藥物的傳遞效率，同時(shí)可以降低藥物的副作用。
在各種載體中，具有空腔結(jié)構(gòu)的載體因其特有的性質(zhì)，例如較大
的內(nèi)部空間尺寸和殼層可調(diào)節(jié)的滲透性，在裝載DNA，蛋白質(zhì)以及各 種藥物分子的領(lǐng)域中得到了廣泛的研究和應(yīng)用。在實(shí)際應(yīng)用中，控制 調(diào)節(jié)載體對于外來分子的滲透能力一直是人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，因?yàn)?載體對外來分子的滲透能力關(guān)系到外來分子的裝載以及釋放，是非常 重要的。為了進(jìn)一步改善載體的滲透性， 一種比較可行的方法就是設(shè) 計(jì)制備一種能對外界的刺激，例如溫度，pH值和磁場，做出特殊響應(yīng) 的載體。從而通過外界刺激的調(diào)節(jié)來控制載體對于外來分子的滲透能 力。
基于四氧化三鐵納米粒子的磁性，其功能微球材料在細(xì)胞分離， 固定化酶，磁靶向載藥，磁共振成像等生物領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。并且四氧化三鐵納米粒子被證明就有很好的生物相容性。聚N-異丙 基丙烯酰胺(PNIPAM)是一種具有溫度響應(yīng)性的聚合物，它在32°C 左右有一個(gè)最低臨界溶解溫度(LCST)。當(dāng)溫度小于32'C的時(shí)候， PNIPAM表現(xiàn)出親水性；當(dāng)溫度大于32"C的時(shí)候，它表現(xiàn)出憎水性。 并且PNIPAM的LCST在較大范圍內(nèi)是可調(diào)節(jié)的，加入親水性共聚單體 會升高LCST，反之加入憎水性共聚單體會降低LCST。 PNIPAM的這種 特殊的溫敏性質(zhì)使它在藥物傳遞以及藥物的可控釋放領(lǐng)域都得到了 廣泛的研究報(bào)道。
基于以上信息，設(shè)計(jì)制備一種兼具磁靶向和葉酸靶向，同時(shí)具有 溫敏特性的具有空腔結(jié)構(gòu)的納米藥物載體將會是對藥物傳遞領(lǐng)域的 一次很好探索。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種具有磁性和葉酸雙重 耙向的溫敏納米藥物載體的制備方法。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供一種上述制備方法獲 得的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體。
本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題在于提供一種上述溫敏納米藥 物載體的用途。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是 一種具有磁性和
葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的制備方法，包括下述步驟 第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；
第二步在四氧化三鐵納米粒子表面通過細(xì)乳液聚合方法包覆聚N-
異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，制成具空腔結(jié)構(gòu)的復(fù)合種子微 球；第三步在復(fù)合種子微球表面通過沉淀聚合方法包覆N-異丙基丙烯 酰胺(NIPAM)和甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)的共聚物， 制得納米復(fù)合微球；
第四步將納米復(fù)合微球表面帶上氨基；
第五步將帶氨基的納米復(fù)合微球與葉酸結(jié)合，得到溫敏納米藥物載 體。
本發(fā)明首先用經(jīng)油酸等改性的四氧化三鐵納米粒子作為磁性材 料，通過改進(jìn)的細(xì)乳液聚合方法得到內(nèi)部具有空腔結(jié)構(gòu)的，以四氧化 三鐵納米粒子為核，以PNIPAM為殼層的復(fù)合種子微球；再通過沉淀 聚合方法在種子微球外包覆NIPAM和GMA的共聚物，進(jìn)一步以NIPAM 和GMA的共聚物為殼，得到表面帶有環(huán)氧基團(tuán)的復(fù)合微球；然后，微 球表面的環(huán)氧基團(tuán)可以在常溫下用過量的氨基試劑開環(huán)，得到表面帶 有氨基的納米復(fù)合微球；最后，用葉酸和復(fù)合微球表面的氨基反應(yīng)， 葉酸分子上的羧基和氨基反應(yīng)生成酰胺鍵，從而將葉酸分子接到微球 表面，最終得到具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體。
所述的四氧化三鐵納米粒子為超順磁性的四氧化三鐵納米粒子， 通過化學(xué)共沉淀法制得。
在上述方案的基礎(chǔ)上，第一步中，采用超順磁性的四氧化三鐵納 米粒子，親油改性為將四氧化三鐵納米粒子表面通過親油劑改性得到 磁流體，所述的親油劑為油酸、油胺或三正辛基氧磷(T0P0)等。
在上述方案的基礎(chǔ)上，第二步中，所述的復(fù)合種子微球中四氧化 三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)單體的質(zhì)量比為1: 5 15，獲得的復(fù)合種子微球的粒徑在80 120mn。
其中，四氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯酰胺單體的質(zhì)量比 可以具體為l: 5， 6, 8， 10， 12， 13或15;粒徑分布可以在80， 90,100， 110， 120nm。
復(fù)合種子微球的細(xì)乳液聚合制備方法具體可以為
將第一步四氧化三鐵納米粒子改性中獲得的磁流體洗滌后，加入 溶劑乙酸丁酯和偶氮二異丁腈(AIBN)，分散均勻后，和十二垸基苯 磺酸鈉(SDBS)溶液混合，超聲形成穩(wěn)定乳液；
再將N-異丙基丙烯酰胺單體(NIP顏)和N， N，-亞甲基雙丙烯酰 胺(MBA)溶解，與所述穩(wěn)定溶液混合，進(jìn)行四氧化三鐵納米粒子與 NIPAM單體的聚合；
反應(yīng)過程條件為先通氮?dú)?0 50分鐘，再在反應(yīng)溫度70 80 'C下反應(yīng)3 6小時(shí)。
具體的，通氮?dú)獾臅r(shí)間可以為20， 30， 40或50分鐘；反應(yīng)溫度 可以為70， 72， 75， 78或8(TC，反應(yīng)時(shí)間可以為3， 4， 5或6小時(shí)。
在上述方案的基礎(chǔ)上，第三步中，所述的納米復(fù)合微球的粒徑在 180 220nm。具體的粒徑分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。
通過沉淀聚合方法在種子微球外包覆N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM) 和甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)的共聚物獲得納米復(fù)合微球的具體 可以為
在第二步中獲得的復(fù)合種子微球分散液中加入N-異丙基丙烯酰 胺單體(NIPAM),甲基丙烯酸脫水甘油酯(GMA)， N，N，-亞甲基雙丙 烯酰胺(MBA)交聯(lián)劑，先通氮?dú)?0 50分鐘，加入過硫酸鉀引發(fā)劑， 再在反應(yīng)溫度70 8(TC下反應(yīng)3 6小時(shí)。
通氮?dú)獾臅r(shí)間具體可以為20， 30， 40或50分鐘；反應(yīng)溫度可以 為70， 72， 75， 78或8(TC，反應(yīng)時(shí)間可以為3， 4， 5或6小時(shí)。
在上述方案的基礎(chǔ)上，第四步中，使納米復(fù)合微球表面帶上氨基
的方法為納米復(fù)合微球與氨基試劑反應(yīng)，所述的氨基試劑為己二胺、乙二胺、丁二胺或巰基乙胺等。加入氨基試劑后常溫下攪拌過夜，產(chǎn) 物用磁分離，并用水洗滌多次后待用。
在上述方案的基礎(chǔ)上，第五步中，先將葉酸、l-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HC1)、 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 在溶劑中混合，如二甲基亞砜(DMS0)中混合進(jìn)行活化反應(yīng)，再與帶 氨基的納米復(fù)合微球上的反應(yīng)。
將葉酸與EDC. HC1和NHS混合攪拌活化0. 5 2小時(shí)， 一般情況 下，葉酸與EDC. HC1、 NHS的混合摩爾比為1: 1.5 2. 5: 1. 5 2. 5， 具體可以為l: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5: 1.5， 1.8， 2， 2.2或2. 5， 優(yōu)選l: 2: 2。事先對葉酸進(jìn)行活化更有利于之后葉酸分子上的羧基
與納米復(fù)合微球上的氨基反應(yīng)生成酰胺鍵，從而將葉酸分子接到微球表面。
針對上述的制備方法獲得的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納 米藥物載體，所述的溫敏納米藥物載體具有空腔結(jié)構(gòu)，以四氧化三鐵
為核，以聚N-異丙基丙烯酰胺、聚N-異丙基丙烯酰胺與甲基丙烯酸 脫水甘油酯的共聚物為殼，表面修飾有葉酸靶向分子，粒徑在180 220nm。具體的粒徑分布可以在180， 190， 200， 210， 220nm。這種 納米藥物載體具有較快的磁響應(yīng)速度，在一定溫度下會發(fā)生體積相轉(zhuǎn) 變，并且在水中可以穩(wěn)定分散。
在上述方案的基礎(chǔ)上，溫敏納米藥物載體的磁飽和強(qiáng)度范圍為 5emu/g 40emu/g;相轉(zhuǎn)變溫度為32 42°C 。
具體的，溫敏納米藥物載體的磁飽和強(qiáng)度范圍可以為5， 10， 15， 20， 25， 30， 35或40emu/g;相轉(zhuǎn)變溫度可以為32， 35， 38， 40或 42°C。
針對上述的溫敏納米藥物載體的用途，用于裝載抗癌藥物阿霉素。溫敏納米藥物載體可以在水溶液中通過氫鍵作用或者物理吸附作 用，裝載阿霉素藥物分子，其包封率以及載藥率可以方便地用pH值
加以控制。阿霉素的釋放過程可以通過調(diào)節(jié)環(huán)境的溫度和pH值加以 控制，在高溫和低pH值條件下展現(xiàn)出較快的釋放速度。通過將載有 藥物的上述納米藥物載體和帶有葉酸受體的癌細(xì)胞一起培養(yǎng)進(jìn)行細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)，納米藥物載體體現(xiàn)出了很好的靶向特性。
在上述方案的基礎(chǔ)上，所述抗癌藥物阿霉素的載藥率的重量百分 比為3 60%。具體的，載藥率可以為3， 5， 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40, 45， 50， 55或60%。
本發(fā)明的優(yōu)異效果是-
本發(fā)明制備工藝清晰全面，得到的納米藥物載體具有磁靶向性， 葉酸耙向性，溫度敏感性以及空腔結(jié)構(gòu)等多種功能。載體的磁靶向性 使得載體能在磁場的控制下在特定的部位聚集；葉酸靶向性使得載體 對癌細(xì)胞具有特異的目標(biāo)識別功能；載體的溫度敏感性可以用來實(shí)現(xiàn) 所裝載的藥物的可控釋放，能通過溫度刺激對于藥物分子的釋放加以 控制；而載體的空腔結(jié)構(gòu)則使載體能夠裝載更多的藥物分子從而提高 藥物傳遞的效率和降低副作用；本發(fā)明在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的 應(yīng)用效果，是一種較為理想的藥物載體。
以上設(shè)計(jì)思路基本覆蓋了藥物傳遞領(lǐng)域所關(guān)心的一些基本問題， 因此產(chǎn)品具有較好的全面性。
具體實(shí)施方法
一下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但這些實(shí)施實(shí)例不限 制本文的保護(hù)范圍。
一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的制備方法，包括下述步驟
第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性-
將一定量的氯化鐵和氯化亞鐵(摩爾比2: 1)溶解在水中，通 氮?dú)獍胄r(shí)，升溫到60°C，加入適量的氫氧化鈉溶液，制成四氧化 三鐵納米粒子；
然后緩慢的向反應(yīng)體系中滴加適量油酸，所得到的反應(yīng)體系穩(wěn)定 IO分鐘之后，加熱到9(TC反應(yīng)半個(gè)小時(shí)，反應(yīng)自然冷卻到常溫后，
用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH到4。然后用磁鐵吸引分離， 產(chǎn)物用水洗滌5次，接著再分別用無水乙醇和丙酮各洗滌三次，最終 得到的產(chǎn)物用環(huán)己垸分散保存，得到穩(wěn)定的磁流體。 第二步在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯酰胺，制 成具空腔結(jié)構(gòu)的復(fù)合種子微球-
四氧化三鐵納米粒子和NIPAM單體投料質(zhì)量比為1: 10。
將0.625g磁流體(固含量5.6%)經(jīng)丙酮和無水乙醇洗滌后，加 入0.5g溶劑乙酸丁酯和10mg AIBN，分散均勻后，和SDBS溶液 (75mg/30ml)混合，超聲形成穩(wěn)定乳液；
取0. 35g NIPAM， 0. 047g MBA溶解在30ml水中，和上述乳液混 合均勻，放入100ml四頸瓶，通氮30min后，在76。C下反應(yīng)4小時(shí) 停止，產(chǎn)物復(fù)合種子微球用水洗滌后再次分散保存。 第三步在Fe3OJPNIPAM復(fù)合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯酰胺 和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，制得納米復(fù)合微球
將25g復(fù)合種子微球分散液中加入0.064g NIPAM， 0.02 GMA， 0. Olg MBA，通氮30min后，加入4mg過硫酸鉀引發(fā)劑，在76。C下反 應(yīng)4個(gè)小時(shí)，產(chǎn)物用磁分離，用水洗滌后待用。 第四步使納米復(fù)合微球表面帶上氨基制備好的Fe3OJPNIPAM-co-PGMA納米復(fù)合微球分散液中，加入過 量的己二胺常溫下攪拌過夜，產(chǎn)物用磁分離，并用水洗滌多次后待用； 第五步將帶氨基的納米復(fù)合微球與葉酸結(jié)合，得到溫敏納米藥物載 體
摩爾比為1: 2: 2的葉酸，NHS， EDC溶于一定量的二甲基亞砜 (DMS0)中，攪拌活化l小時(shí)，然后將上述溶液加入到事先準(zhǔn)備好的 微球分散液中，加入三乙胺催化劑，避光反應(yīng)過夜，產(chǎn)物用磁分離， 用水洗滌后，并透析除去未反應(yīng)的分子。 應(yīng)用例
取實(shí)施例中制得的溫敏納米藥物載體5mg，加入5mg的阿霉素， 配成10ml的溶液，將溶液調(diào)節(jié)到一定pH5 10后，常溫下攪拌過夜， 產(chǎn)物用離心分離，冷凍干燥，制成裝載有抗癌阿霉素的溫敏納米藥物 載體，抗癌藥物阿霉素的載藥率的重量百分比為5 50%。
權(quán)利要求
1、一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的制備方法，其特征在于包括下述步驟第一步將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；第二步在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯酰胺，制成具空腔結(jié)構(gòu)的復(fù)合種子微球；第三步在復(fù)合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，制得納米復(fù)合微球；第四步使納米復(fù)合微球表面帶上氨基；第五步將帶氨基的納米復(fù)合微球與葉酸結(jié)合，得到溫敏納米藥物載體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的制備方法，其特征在于第一步中，采用超順磁性的四氧化三 鐵納米粒子，親油改性為將四氧化三鐵納米粒子表面通過親油劑改 性，所述的親油劑為油酸、油胺、三正辛基氧磷中的一種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的制備方法，其特征在于第二步中，所述的復(fù)合種子微球中四 氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯酰胺單體的質(zhì)量比為1: 5 15，粒徑在80 120nm。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米 藥物載體的制備方法，其特征在于第二步中，復(fù)合種子微球的制備 方法為將第一步四氧化三鐵納米粒子改性中獲得的磁流體洗滌后，加入 溶劑和偶氮二異丁腈，分散均勻后，和十二烷基苯磺酸鈉溶液混合， 超聲形成穩(wěn)定乳液；再將N-異丙基丙烯酰胺單體和N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺溶解， 與所述穩(wěn)定溶液混合，進(jìn)行四氧化三鐵納米粒子與N-異丙基丙烯酰 胺單體的聚合；反應(yīng)過程條件為先通氮?dú)?0 50分鐘，再在反應(yīng)溫度70 80 'C下反應(yīng)3 6小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的制備方法，其特征在于第三步中，所述的納米復(fù)合微球的粒 徑在180 220nm。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的制備方法，其特征在于第四步中，使得納米復(fù)合微球表面帶上氨基的方法為納米復(fù)合微球與氨基試劑反應(yīng)，所述的氨基試劑為己二胺、乙二胺、丁二胺、巰基乙胺中的一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體的制備方法，其特征在于第五步中，先將葉酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺在溶劑中混合進(jìn)行活化反應(yīng)，再與帶氨基的納米復(fù)合微球反應(yīng)。
8、 針對權(quán)利要求1 7之一所述的制備方法獲得的具有磁性和葉酸雙 重耙向的溫敏納米藥物載體，以四氧化三鐵為核，以N-異丙基丙烯 酰胺與甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物為殼的空腔結(jié)構(gòu)，表面修飾有 葉酸靶向分子，粒徑在180 220nm。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物 載體，其特征在于溫敏納米藥物載體的磁飽和強(qiáng)度范圍為5emu/g 40emu/g;相轉(zhuǎn)變溫度為32 42°C 。
10、 針對權(quán)利要求8或9所述的溫敏納米藥物載體的用途，用于裝載 抗癌藥物阿霉素，抗癌藥物阿霉素的載藥率的重量百分比為3 60%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有磁性和葉酸雙重靶向的溫敏納米藥物載體的制備方法，包括下述步驟將四氧化三鐵納米粒子表面親油改性；在四氧化三鐵納米粒子表面包覆聚N-異丙基丙烯酰胺，制成具空腔結(jié)構(gòu)的復(fù)合種子微球；在復(fù)合種子微球表面包覆N-異丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸脫水甘油酯的共聚物，制得納米復(fù)合微球；使納米復(fù)合微球表面帶上氨基；將帶氨基的納米復(fù)合微球與葉酸結(jié)合，得到溫敏納米藥物載體。產(chǎn)品相轉(zhuǎn)變溫度為32～42℃，用于裝載抗癌藥物阿霉素。優(yōu)點(diǎn)是制備工藝清晰全面，得到的納米藥物載體具有磁靶向性，葉酸靶向性，溫度敏感性以及空腔結(jié)構(gòu)等多種功能，并且在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用效果，是一種較為理想的藥物載體。
文檔編號A61K47/34GK101411877SQ20081020278
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者汪長春, 陳立波 申請人:復(fù)旦大學(xué)