專利名稱：：一種混合共聚物載體系統(tǒng)組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新型的非病毒基因給藥載體-基于普朗尼克(Pluronic)修飾的陽離子樹狀高分子(Dendrimer)混合共聚物載體系統(tǒng)組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：基因治療技術(shù)已經(jīng)成為目前國內(nèi)外生物醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵是需要一種安全、高效的基因給藥載體系統(tǒng)。目前，基因給藥載體主要分為病毒載體和非病毒載體。其中，病毒載體具有非常高的轉(zhuǎn)染效率，而且是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的一種基因給藥載體，但是病毒載體本身具有很強(qiáng)的免疫原性，具有潛在的與宿主細(xì)胞整合的危險(xiǎn)性，而且缺乏耙向性，這些缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了該類產(chǎn)品的臨床應(yīng)用，如1999年美國重組腺病毒"JesseGelsinger"事件和2000年法國發(fā)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)白血病惡性事件等；因而，近年來非病毒基因給藥載體的研究備受關(guān)注。目前現(xiàn)有技術(shù)公開的非病毒基因給藥載體主要有陽離子脂質(zhì)體(DalbyB，CatesS，etal.Methods,2004，33:95-103)，陽離子聚合物(Boussif0etal.ProcNatAcadSciUSA，1995,92:7297-7301)和納米粒(HuFQ，etal.InterJPharm.，2006，315:158-166.)等。其中，陽離子脂質(zhì)體是目前應(yīng)用最多最為廣泛的一種非病毒基因給藥載體，其主要由陽離子的磷脂和中性磷脂DOPE二者組成，具有較高的體外轉(zhuǎn)染效率，但是有血漿存在時(shí)，轉(zhuǎn)染效率急劇降低，不能用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，而且該載體毒性較強(qiáng)；陽離子聚合物是目前研究較多的另外一種非病毒基因給藥載體，如聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)，樹樁大分子(PAMAM)以及聚賴氨酸(PLL)和其他的聚陽離子蛋白質(zhì)如魚精蛋白等，該類基因給藥載體也具有較高的體外轉(zhuǎn)染效率，并且能夠促進(jìn)質(zhì)粒向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，可用于體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染，但同樣存在毒性較強(qiáng)，而且很容易聚集的缺點(diǎn)；納米粒能夠克服組織的障礙，具有良好的細(xì)胞攝取效果，能夠?qū)①|(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞漿內(nèi)，但轉(zhuǎn)染效率較低。在上述載體材料中，樹狀高分子(Dendrimers)是人工合成的，高度分支的的聚合物，具有單分散性和完全均一的分子結(jié)構(gòu)。陽離子樹狀高分子由中心核、內(nèi)層重復(fù)單元和表面端基三部分組成，與一般的線性大分子相比，其特點(diǎn)是1)結(jié)構(gòu)規(guī)則，高度對稱，分子大小和形狀結(jié)構(gòu)可在分子水平精確控制；2)代數(shù)較低時(shí)為平面結(jié)構(gòu)構(gòu)型，隨代數(shù)增加，分支亦增多，由松散狀態(tài)過渡為球形三維結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)部具有大量的空穴，分子表面的官能團(tuán)密度則比較致密；3)有較好的反應(yīng)活性和包容能力。分子內(nèi)部的空穴結(jié)構(gòu)可容納小分子藥物，表面的官能基團(tuán)則便于進(jìn)一步修飾(GraysonSM，F(xiàn)r6chetJM.ChemRev.2001Dec;101(12):3819-68.)。目前工業(yè)化生產(chǎn)的與非病毒基因治療載體相關(guān)的兩個(gè)樹狀高分子是聚酉先胺_胺(polyamidoaminedendrimer，PAMAM)禾口聚丙烯亞胺(poly(propyleneimine)denazZdrimers，PPI)，其中前者已有用于體外轉(zhuǎn)染的商品化試劑出售(SuperFect，QiaGen公司)。其中的聚酰胺_胺(polyamidoaminedendrimer，PAMAM)在G3代以上時(shí)，分子結(jié)構(gòu)為球狀，能更好地容納表面大量的活性基團(tuán)。J.P.Behr的研究顯示G6代的PAMAM對貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞均具有最佳的轉(zhuǎn)染效率，而較低代數(shù)的PAMAM在N/P比較高時(shí)(6:1)亦有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是這時(shí)的轉(zhuǎn)染效率會受到血清的影響；結(jié)果還顯示PAMAM對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不受溶酶體裂解劑的影響，認(rèn)為PAMAM本身具有從溶酶體逃脫的能力，即PAMAM本身具有很強(qiáng)的質(zhì)子海綿效應(yīng)，有利于復(fù)合物從溶酶體的逃離出來(J.Haensler，F(xiàn).C.SzokaJr.，Bioconjug.Chem.4(1993)372-379.)。其中的聚丙烯亞胺(poly(propyleneimine)dendrimers，PPI):BerndH.Zinselmeyer對1-5代PPI在A431細(xì)胞系上的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)顯示低代數(shù)的PPI(G2和G3)具有較高的轉(zhuǎn)染效率，效率和陽離子脂質(zhì)載體DOTAP的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，高代數(shù)的PPI(G4和G5)因具有較大的細(xì)胞毒作用而不能單獨(dú)用于轉(zhuǎn)染(PharmaceuticalResearch,Vol.19，No.7，July2002:960-967)。PPI分子表面的氨基通過碘甲烷季銨鹽化以后，不僅降低了細(xì)胞毒性，而且提高了體內(nèi)外的轉(zhuǎn)染效率；有研究體內(nèi)試驗(yàn)顯示，PPI作為基因載體，治療基因表達(dá)的主要器官是肝臟，而不是陽離子脂質(zhì)載體作為載體時(shí)所表達(dá)的月市臟(AndreasG.Schatzleina,BerndH.ZinselmeyeJournalofControlledRelease101(2005)247—258)。Pluronic是得到FDA批準(zhǔn)的用作藥物制劑輔料的一種高分子。它是聚氧乙烯(PE0)-聚氧丙烯(PPO)-聚氧乙烯(PE0)構(gòu)成的一個(gè)三嵌段共聚物。當(dāng)濃度在CMC以下時(shí)，Pluronic在水中以單分子存在，當(dāng)濃度高于CMC時(shí)，自發(fā)聚集形成膠束結(jié)構(gòu)，憎水嵌段PP0組成膠束的內(nèi)核，親水嵌段PE0位于表面組成親水性外殼。這種獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使Pluronic得到了廣泛的應(yīng)用和研究。Pluronic中的PP0疏水嵌段和細(xì)胞膜相互作用，降低細(xì)胞膜的微粘度，有利于外源物質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)(THEJOURNAL0FPHARMAC0L0GYANDEXPER頂ENTALTHERAPEUTICS,2003，304(2):845-854)。研究顯示，Pluronic和裸DNA—起注射到骨骼肌、心肌和腫瘤等組織中，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因在這些組織中的表達(dá)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間；Nguyen以Pluronic-PEI(2K)壓縮質(zhì)粒DNA，并于體系中加入游離的P123，結(jié)果形成100-160nm的粒子，這些粒子在血清存在的條件下并不聚集，相對于單獨(dú)的PEI而言，體內(nèi)外的基因遞送效果均提高。而且，以親水性的PluronicF127代替載體系統(tǒng)中的P123，轉(zhuǎn)染效率并沒有降低。該聚合物載體系統(tǒng)實(shí)際上是電中性的，而且體內(nèi)外的毒性均很小(GeneTher即y(2000)7，126-138)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型的非病毒基因給藥載體_混合共聚物載體系統(tǒng)，具體涉及一種非病毒基因給藥載體-基于普朗尼克(Pluronic)修飾的陽離子樹狀高分子(Dendrimer)混合共聚物載體系統(tǒng)組合物及其制備方法。本發(fā)明采用Pluronic修飾的陽離子樹狀高分子、游離Pluronic和質(zhì)粒DNA共同制備混合共聚物載體系統(tǒng)，作為一種新型非病毒基因給藥載體，具有較高的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。具體地，本發(fā)明以Pluronic修飾陽離子樹狀高分子，通過凝聚法制備混合共聚物載體系統(tǒng)，以綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-N2)和蟲熒光素酶質(zhì)粒(pLuc-promotor)作為報(bào)告基因，測試了大量不同的高分子的體外轉(zhuǎn)染效率，尤其考察該載體系統(tǒng)對SPC-A1、CH0、293T等細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，Pluronic修飾PPI樹狀高分子毒性較小，能夠非常高效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞，尤其對SPC-A1、CH0、293T等細(xì)胞具有比較高的轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明合成了一系列的Pluronic修飾的PPI陽離子樹狀高分子，分別PluronicL61、P123和F123與PPI反應(yīng)，得到不同修飾度的Pluronic-PPI高分子。所述混合共聚物載體系統(tǒng)中的Pluronic主要有P123、P85、P84、P103、P104、L61、L62、L64、L81、和L92或其中任意兩種或兩種以上的混合物。優(yōu)選P123、P84、L64或其中任意兩種或兩種以上的混合物。所述混合共聚物載體系統(tǒng)中的陽離子樹狀高分子Dendrimer主要有PPI(聚丙烯亞胺)、PAMAM(聚酰胺-胺)和PLL(聚賴氨酸)。本發(fā)明混合共聚物載體系統(tǒng)組合物可通過凝聚法制備。本發(fā)明綜合了陽離子樹狀高分子和Pluronic的優(yōu)點(diǎn)，以Pluronic修飾陽離子樹狀高分子作為非病毒基因給藥載體，發(fā)揮兩種高分子各自的優(yōu)點(diǎn)和相互協(xié)同作用。其中的Pluronic可以增大細(xì)胞膜的流動(dòng)性，利于載體系統(tǒng)進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)可以降低載體系統(tǒng)和血漿蛋白的相互作用，保護(hù)pDNA不受核酸酶降解，延長載體系統(tǒng)在血液循環(huán)系統(tǒng)中的時(shí)間，發(fā)揮納米載體系統(tǒng)治療腫瘤的EPR(通透性增強(qiáng)和滯留)效應(yīng)；樹狀高分子壓縮、包裹質(zhì)粒DNA，進(jìn)入溶酶體后，其強(qiáng)烈的質(zhì)子海綿效應(yīng)利于其逃離出來免受降解。圖1是逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR混合共聚物載體系統(tǒng)原理圖。圖2是混合共聚物載體系統(tǒng)示意圖。圖3是P123-2.5g-PPI在N/P比5和10時(shí)，添加不等量P123對酶切保護(hù)的影響。圖4是P123-2.5g-PPI在N/P比10、添加不等量P123對血清解離的抵抗作用。圖5是P123-2.5g-PPI/P123在N/P比10、添加不等量P123對抗肝素鈉的解離作用。圖6是不同N/P比P123-2.5g-PPI/DNA在血清存在與否條件下轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。圖7是P123-2.5g-PPI在N/P20和30時(shí)血清存在與否條件下的熒光圖譜。圖8是N/P比20時(shí)MCS在血清存在與否條件下轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。圖9是P123-2.5g-PPI在N/P10和20、血清存在與否條件下轉(zhuǎn)染SPC-A1的蟲熒光素酶活性。圖10是FBS對P123-2.5g-PPI/3P123/DNAN/P20的轉(zhuǎn)染效率的影響。圖11是P123-2.5g-PPI/3P123/DNAN/P20在不等量FBS條件下轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞的熒光圖譜。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1合成P123-PPI稱2.0克Pluronic于50ml圓底燒瓶中，于50。C烘箱真空干燥過夜，加入20ml無水乙腈，完全溶解后，于4(TC油浴、磁力攪拌的條件下，緩慢滴加溶解于10ml無水乙腈中的等摩爾的CDI，約在30min之內(nèi)滴加完畢，然后于4(TC油浴、磁力攪拌的條件反應(yīng)10hr。反應(yīng)結(jié)束后，往反應(yīng)體系中加入等體積的純水，然后進(jìn)行透析(透析介質(zhì)20%乙醇溶液，截留分子量3500)以去除小分子的咪唑。透析結(jié)束后，開始和PPI的接枝反應(yīng)，室溫下反應(yīng)48hr。不同型號的Pluronic，因水溶性不同，故接枝反應(yīng)體系也不同。結(jié)果表明，接枝反應(yīng)的投料比不同時(shí)，得到不同修飾度的PPI高分子，如一個(gè)PPI分子上平均接1個(gè)或2個(gè)P123分子。實(shí)施例2凝聚法制備混合共聚物載體系統(tǒng)制備步驟如下(1)于5個(gè)0.5mlEP管中，各加入135yl質(zhì)粒DNA(100yg/ml)，再分別加入純水160、156、148、124和87ii1和50mg/mlP123溶液0、4.1、12.2、36.5和73iil，并混勻。(2)于5個(gè)0.5mlEP管中，分別各加入P123-2.5g-PPI81ii1(2.5mg/ml)和純水40iil，并混勻。(3)將(2)—次性加入(1)中，立即混合均勻，于室溫下孵育15min，然后測定粒徑和l電位。得到的混合共聚物載體系統(tǒng)的粒徑和l電位表征結(jié)果如下表所示表1、混合共聚物載體系統(tǒng)的粒徑和zeta電位<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例3混合共聚物載體體外抵抗DNaseI酶解、血清解離和肝素鈉解離作用該系列以體外實(shí)驗(yàn)分別考察了混合共聚物載體系統(tǒng)抵抗DNaseI酶解、血清解離和肝素鈉解離作用，以此預(yù)測其應(yīng)用于體內(nèi)的可能性。結(jié)果顯示N/P比5時(shí)，游離P123的加入能夠增加P123-2.5g-PPI的酶切保護(hù)作用，但和P123量的多少無明顯關(guān)系；N/P比10，游離P123的加入不改變P123-2.5g-PPI的酶切保護(hù)作用。表明復(fù)合物的電泳行為不受血清的影響，即所述的載體材料能夠保護(hù)質(zhì)粒DNA不受血清的解離作用。另一方面，血清可以和裸DNA相互結(jié)合，導(dǎo)致DNA電泳行為的顯著改變。本發(fā)明所述的混合共聚物載體系統(tǒng)抗DNaseI酶解、血清和肝素鈉解離作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，當(dāng)靜注用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)，該系統(tǒng)能夠在一定程度上克服血清的影響，具有較高的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。實(shí)施例4混合共聚物載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白報(bào)告基因和蟲熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染材料和儀器NIKONEclipseTS100倒置光學(xué)顯微鏡；NIKONTE-2000倒置熒光顯微鏡；microplateL咖i謹(jǐn)eterTR717型發(fā)光測定儀(AppliedBiosystems);熒光光譜儀(LS55，PerkinElmer公司)；TECANSafire2酶標(biāo)儀；細(xì)胞培養(yǎng)耗材(BDFalcon公司)；胎牛血清(Hyclone);胰酶-EDTA(Gibco公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；蟲熒光素酶測定試劑盒(BioTherm公司)；BCA蛋白定量試劑盒(上海尚誼化工有限公司)實(shí)驗(yàn)方法a.制備各種PPI/DNA、Plu-PPI/DNA復(fù)合物以P123-2.5g-PPI/DNA的N/P比20，添加0、1、3、9、18倍游離P123的MCS的制備步驟為例，說明如下(1)于5個(gè)0.5mlEP管中，各加入20質(zhì)粒DNA(100iig/ml)，再分別加入純水39.3、38.1、35.7、28.5和17.7ii1和50mg/mlP123溶液0、1.2、3.6、10.8和21.6iil，并混勻。(2)于另外5個(gè)0.5mlEP管中，分別各加入P123-2.5g_PPI24ii1(2.5mg/ml)和純水50iil，并混勻。(3)將(2)—次性加入(1)中，立即渦旋20s，于室溫下孵育15min，然后24孔板每孔加入501復(fù)合物溶液(含質(zhì)粒0.75g)。其他復(fù)合物的制備方法以此類推，盡量保證轉(zhuǎn)染時(shí)每孔加入的復(fù)合物溶液體積為50iU，且含質(zhì)粒的量為0.75iig。b.細(xì)胞培養(yǎng)SPC-A1、CH0、293T均以含10%FBS(V/V)DMEM(高糖)為培養(yǎng)液(不含雙抗)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中(37t:、5XC02、飽和濕度)連續(xù)培養(yǎng)，生長至80-90%融合度時(shí)傳代或鋪板。傳代時(shí)以胰酶(0.1%Trypsin+O.02%EDTA)消化，以1:3傳代。c.細(xì)胞的轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以2X105個(gè)/1.Oml/孔均勻接種到24孔板中，第二天當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80-90%時(shí)，開始轉(zhuǎn)染操作，吸棄舊的培養(yǎng)液，每孔加入0.45ml新鮮的培養(yǎng)液，然后將制備好的復(fù)合物加入(約50iU)，每孔中質(zhì)粒為0.75g，每種處方做兩個(gè)或者三個(gè)復(fù)孔。輕輕搖動(dòng)24孔板使復(fù)合物均勻存在于孔中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4hr后，吸棄含有復(fù)合物的培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌一遍，換上含10%FBS的完全細(xì)胞培養(yǎng)液。每天換以新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48hr，；同時(shí)操作陽離子脂質(zhì)體LipOfectamineTM2000作為陽性對照。d.流式細(xì)胞儀法和熒光分光光度計(jì)法評價(jià)綠色熒光蛋白報(bào)告基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率流式細(xì)胞儀法評價(jià)綠色熒光蛋白報(bào)告基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48hr后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌兩遍，每孔加入2滴PBS和1滴胰酶消化細(xì)胞。將細(xì)胞收集至1.5mlEP管中，1500rpm，5min離心，棄去上清如果可以馬上測流式，每管中加入適量的PBS，使細(xì)胞濃度大約在5X105個(gè)/ml，細(xì)胞重懸均勻后，即可上機(jī)測試，每次測試計(jì)數(shù)3萬個(gè)細(xì)胞；如果需要等一段時(shí)間才能測流式(超過1天)，棄上清后在每管中加入0.8ml2.5%的多聚甲醛，重懸均勻后室溫下固定30min，再次離心后，棄上清后以適量PBS重懸細(xì)胞，放置于4t:冰箱，待上機(jī)測試。熒光分光光度計(jì)法評價(jià)綠色熒光蛋白報(bào)告基因體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48hr后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌兩遍，每孔加入2滴PBS和1滴胰酶消化細(xì)胞。將細(xì)胞收集至1.5mlEP管中，1500rpm，5min離心，棄去上清，每管加入0.2mlPBS，重懸均勻后全部吸至白色不透明的96孔板中，設(shè)定激發(fā)波長490nm，發(fā)射波長509nm測定綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度。e.蟲熒光素酶活性法評價(jià)復(fù)合物體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48hr后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌兩遍，每孔加入100y1細(xì)胞裂解液，室溫條件下，搖床上搖蕩30min，使細(xì)胞充分裂解，離心(4t:、8000rpm、15min)，取上清10iU，在發(fā)光測定儀上以蟲熒光素酶試劑盒測定蟲熒光素酶的活性，參數(shù)設(shè)置為delaytime2s，measureinterval10s，同時(shí)以BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中蛋白質(zhì)的含量，計(jì)算每mg總蛋白的相對光度單位(relativeluminescenceunits,RLU)。結(jié)果顯示隨著N/P比的增加，P123-2.5g_PPI的轉(zhuǎn)染效率逐步提高，N/P20時(shí)達(dá)到平臺狀態(tài)。當(dāng)N/P比低于20時(shí)，血清的加入明顯降低轉(zhuǎn)染效率；當(dāng)N/P比高于20時(shí)，血清的加入對轉(zhuǎn)染效率影響不明顯。無血清條件下轉(zhuǎn)染時(shí)，P123的加入均降低了轉(zhuǎn)染效率，而P123加入的量與降低程度無相關(guān)性；在血清存在條件下轉(zhuǎn)染時(shí)，P123的加入均顯著提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)P123的量在1倍和3倍質(zhì)量比時(shí)，提高程度最明顯，當(dāng)P123的量在9倍和18倍質(zhì)量比時(shí)，與對轉(zhuǎn)染效率的提高程度有所降低。轉(zhuǎn)染體系中血清的濃度對MCS的轉(zhuǎn)染效率影響很大，在胎牛血清含量少于25%(V/V)時(shí)，轉(zhuǎn)染效率均較高，當(dāng)胎牛血清含量為50X時(shí)，嚴(yán)重削弱MCS的轉(zhuǎn)染能力。Lipofectamine2000在50%胎牛血清存在下仍能夠明顯轉(zhuǎn)染SPC-A1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Pluronic修飾PPI樹狀高分子制備的混合共聚物載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒和蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的效率均高于陽性對照Lipofectamine2000，即混合共聚物載體系統(tǒng)具有較高的體外轉(zhuǎn)染效率。權(quán)利要求一種混合共聚物載體系統(tǒng)組合物，其特征是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物Pluronic修飾的陽離子樹狀高分子、游離聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物和質(zhì)粒DNA組成。2.按權(quán)利要求l所述的混合共聚物載體系統(tǒng)組合物，其特征是所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯_聚氧乙烯共聚物Pluronic選自P123、P85、P84、P103、P104、L61、L62、L64、L81、或L92或其中任意兩種或兩種以上的混合物；所述的陽離子樹狀高分子Dendrimer選自聚丙烯亞胺PPI、聚酰胺_胺PAMAM或聚賴氨酸PLL。3.按權(quán)利要求l所述的混合共聚物載體系統(tǒng)組合物，其特征是所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物，Pluronic，是P123、P84、L64或其中任意兩種或兩種以上的混合物。4.按權(quán)利要求2所述的混合共聚物載體系統(tǒng)組合物，其特征是所述的聚氧乙烯_聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物修飾的陽離子樹狀高分子分別為PluronicL61、P123和F123與PPI反應(yīng)，得到不同修飾度的Pluronic-PPI高分子。5.—種混合共聚物載體系統(tǒng)組合物的制備方法，其特征是采用凝聚法，將Pluronic修飾的陽離子樹狀高分子Pluronic-PPI和游離的Pluronic與含有治療基因的質(zhì)粒DNA于純水中混合后，渦旋，室溫下孵育15min，得到非病毒基因治療載體系統(tǒng)。6.按權(quán)利要求5的制備方法，其特征是制得的混合共聚物載體系統(tǒng)的粒徑和l電位表征如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>7.權(quán)利要求1所述的混合共聚物載體系統(tǒng)組合物在制備非病毒基因給藥載體中的用途。全文摘要本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，提供一種新型的非病毒基因給藥載體-混合共聚物載體系統(tǒng)，本發(fā)明采用Pluronic修飾的陽離子樹狀高分子、游離Pluronic和質(zhì)粒DNA共同制備混合共聚物載體系統(tǒng)，體外實(shí)驗(yàn)表明，所述的混合共聚物載體系統(tǒng)是一種非常高效的非病毒基因給藥載體，可以有效地壓縮和包裹質(zhì)粒DNA，抑制DNaseI對質(zhì)粒的降解作用，抵抗肝素鈉和血清對MCS/DNA的解離作用。作為一種新型非病毒基因給藥載體，具有較高的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。文檔編號A61K31/7088GK101766824SQ20081020536公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日發(fā)明者張志文,方曉玲,李雅娟,沙先誼,蔣曄,郝俊國申請人:復(fù)旦大學(xué)