專利名稱：一種中和cyr61的單克隆抗體(雜交瘤)及其應(yīng)用的制作方法
一種中和CYR61的單克隆抗體(雜交瘤)及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種能夠中和CYR61的單克隆抗體及其應(yīng)用和能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
背景技術(shù)：
類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是最常見的風濕性疾病之一。RA是一種最常見的自身免疫病。全球RA患病率平均為0.5-1%。在我國，RA患病率為0.45X，而且每年的新增患病總?cè)思s為400萬左右。RA的發(fā)病多為青壯年，由于沒有特異性治療藥物控制疾病發(fā)展，大部分患者在發(fā)病的6-10年左右即由于致殘而失去勞動能力，未經(jīng)治療的患者，其2年和3年的致殘率可達50%和70%。因此，RA嚴重影響人民生命健康，同時也給我國正在發(fā)展健全的醫(yī)保事業(yè)帶來沉重負擔，在一定程度上阻礙我國和諧社會的建設(shè)進程。 RA的治療沒有特異性手段。目前的藥物治療及滑膜切除、關(guān)節(jié)置換等手術(shù)療法只能緩解炎癥和疼痛，而對軟骨和骨的侵襲性破壞無效。因此深入研究RA的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點具有重要的理論和實際意義。雖然目前的抗TNF-a受體人源化抗體在抑制炎癥病變的形成上有較好臨床效果，但是該制劑對于中、晚期關(guān)節(jié)和滑膜已經(jīng)有明顯病變的患者效果不顯著，而且只在部分患者中有效。因此，研究發(fā)現(xiàn)直接剌激滑膜和軟骨病變的生物靶點、設(shè)計和發(fā)展針對這些生物靶點的干預(yù)手段極為重要。目前常用的干預(yù)手段有人源化單抗或者干擾SiRNA。但是，由于干擾SiRNA的長期轉(zhuǎn)染技術(shù)至今不完善，目前仍不能用于體內(nèi)。而人源化抗體的制備技術(shù)目前已經(jīng)基本完善、國際上已經(jīng)有多種人源化抗體上市并用于疾病治療，均已獲得良好效果，因此，選擇有效生物靶點采用人源化抗體進行中和是特異性治療的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種單克隆抗體。 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種單克隆抗體的用途。 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種由小鼠抗人CYR61單克隆抗體雜交瘤CGMCC NO. 2766或CGMCC NO. 2767分泌的單克隆抗體。 所述分泌IgM的小鼠抗人CYR61單克隆抗體雜交瘤已保藏，保藏單位的名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位的地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所。保藏日期2008年11月25日。保藏編號CGMCC NO. 2766。所述分泌IgG的小鼠抗人CYR61單克隆抗體雜交瘤已保藏，保藏單位的名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位的地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所。保藏日期2008年11月25日。保藏編號CGMCC N0. 2767。 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是單克隆抗體在制備治療風濕性疾病疾病藥物中的應(yīng)用。所述的風濕性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
依據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明的具體實施方法是 1、在基因芯片篩查的基礎(chǔ)上，運用實時定量PCR方法分析了CYR61在RA患者不同組織中的表達格局。發(fā)現(xiàn)CYR61主要表達在RA患者的滑膜組織中，其相對含量是RA患者外周血單個核細胞的8. 7倍、是RA關(guān)節(jié)液單個核細胞的13. 3倍、正常人的外周血單個核細胞的125倍。同時用免疫組化的方法比較了 RA、 0A、正常人的滑膜組織中CYR61的表達情況，發(fā)現(xiàn)CYR61在RA滑膜組織中表達明顯高于OA患者和正常對照。進一步采用體外培養(yǎng)RA滑膜組織來源的FLS進行研究用實時定量PCR發(fā)現(xiàn)CYR61在培養(yǎng)的FLS中表達高于滑膜組織；采用Western Blot方法比較了培養(yǎng)的RA、 0A、正常人的FLS中CYR61蛋白的表達格局，明確了 CYR61在RA患者的成纖維樣滑膜細胞中的表達顯著高于OA和正常對照，提示CYR61在RA滑膜組織病變中可能發(fā)揮著重要的作用。 2、采用原代細胞培養(yǎng)的方式研究RA FLS在局部炎癥環(huán)境中的增殖與CYR61高表達的關(guān)系。用RA患者的SF剌激培養(yǎng)的FLS，發(fā)現(xiàn)RA患者的SF可以顯著剌激FLS的增殖，同時可以剌激FLS中CYR61的表達。而后探討SF中何種細胞因子能上調(diào)CYR61的表達，采用純化的細胞因子分別剌激RA FLS，發(fā)現(xiàn)IFN-Y和TNF-a可以明顯上調(diào)CYR61的表達。為了進一步研究CYR61的功能，我們制備并篩選了能夠與天然CYR61蛋白相結(jié)合的單克隆抗體；并采用ELISA的方法檢測RA滑膜液中CYR61的含量，發(fā)現(xiàn)RA滑膜液中存在高濃度的CYR61。為了明確CYR61蛋白對FLS增殖的作用，采用CYR61單克隆抗體阻斷的方法研究CYR61對于FLS增殖的影響。結(jié)果顯示，在中和了 SF中CYR61蛋白后，SF剌激FLS增殖的能力明顯下降，表明CYR61蛋白在SF剌激FLS增殖過程中發(fā)揮了重要作用。
3、用siRNA干擾的方法研究CYR61調(diào)控滑膜細胞增殖的機制。用篩選得到的CYR61特異性siRNA沉默F(xiàn)LS中CYR61基因的表達，發(fā)現(xiàn)干擾后FLS的增殖能力下降同時凋亡增加，證實CYR61可通過抑制其凋亡而發(fā)揮促進增殖的作用。為了探討凋亡家族分子是否參與CYR61抑制FLS凋亡，采用實時定量PCR的方法檢測了 CYR61干擾后Bcl_2家族基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)隨著CYR61基因的抑制，凋亡抑制基因Bcl-2mRNA表達水平明顯下調(diào)；而其它Bcl-2家族基因則沒有明顯變化，這一結(jié)果提示CYR61可通過上調(diào)抑凋亡基因Bcl-2而抑制FLS的凋亡，從而促進了 FLS的增殖。 4、用基因工程方法人工表達人CYR61蛋白并免疫小鼠，常規(guī)方法融合并用CYR61蛋白篩選獲得14株特異性單克隆抗體。采用無血清細胞培養(yǎng)上清進行免疫組化方法鑒定能與組織細胞中天然CYR61蛋白結(jié)合的活性抗體。由于已有報道293T細胞中高表達CYR61 ，因此本發(fā)明選用293T細胞作為陽性對照。結(jié)果表明免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)其中有兩株能夠與293T細胞和滑膜細胞的CYR61結(jié)合。
本發(fā)明優(yōu)點在于 1、該單抗能夠用于研究CYR61在類風關(guān)的發(fā)病機理，能夠準確定位CYR61的表達和檢測患者血清及病變部位(如關(guān)節(jié))的CYR61水平。 2、能夠作為制備檢測試劑盒以區(qū)別骨關(guān)節(jié)炎和類風關(guān)的臨床診斷之用。 3、能夠?qū)ふ夷軌蛑泻皖愶L關(guān)患者滑膜表面及滑液中的CYR61的結(jié)合表位，為下一
步制備能夠中和CYR61的人源化抗體提供篩選依據(jù)。

圖1 :RA患者組織及細胞中CYR61基因的相對含量表達格局(P < 0. 0001***P =0.0054**)。 圖2 :滑膜組織切片HE染色和免疫組化結(jié)果，A :正常滑膜組織HE染色(20 X) ， B :OA滑膜組織HE染色(20X) ， C :RA滑膜組織HE染色(20X) ， D :正常滑膜組織CYR61組織化學染色(40X) ， E :0A滑膜組織CYR61組織化學染色(40X) ， F :RA滑膜組織CYR61組織化學染色(40X)。 圖3A :FLS的體外培養(yǎng)和鑒定，第三代FLS (400 X)。 圖3B :FLS的體外培養(yǎng)和鑒定，F(xiàn)LS的鑒定(< 2% CDlIb， < 2% CD14+， < 1%CD3+，and < 5% CD19+，流式細胞儀檢測).CYR61在RA滑膜組織和體外培養(yǎng)的滑膜纖維母細胞中的表達。 圖4A :體外培養(yǎng)的RA FLS中高表達CYR61, RA FLS中CYR61的表達明顯高于RA滑膜組織。 圖4B :體外培養(yǎng)的RA FLS中高表達CYR61， CYR61mRNA在RA FLS中的表達明顯高于OA和正常人FLS。 圖4C:體外培養(yǎng)的RA FLS中高表達CYR61， Western-blot :RA， OA和正常人FLS中CYR61蛋白的表達。 圖5A :不同濃度滑膜液對FLS增殖的影響。 圖5B :不同濃度滑液對FLS CYR61mRNA表達的影響。 圖5C :不同濃度滑液對FLS CYR61蛋白水平表達的影響。 圖6A :IFN- y禾P TNF- a均可上調(diào)RA FLS中CYR61的表達，不同細胞因子剌激RA FLS后檢測CYR61的表達，細胞因子濃度分別為IL-IOO. lng/ml， IL-120. 5ng/ml，IFN_ y 0. 05ng/ml， TNF_ a 0. 05ng/ml。 圖6B :IFN-y禾P TNF-a均可上調(diào)RA FLS中CYR61的表達，阻斷抗體anti-IFN- y (10 ii g/ml)和anti-TNF- a對IFN- y ， TNF- a和SF剌激作用的影響。
圖7 :ELISA檢測RA和OA滑膜液以及RA外周血中CYR61蛋白的含量RA SF中CYR61蛋白的含量明顯高于對照OA SF、 RA患者外周血。 圖8 :RA SF中的CYR61蛋白可以剌激FLS的增殖。特異性CYR61單克隆抗體與
sf分別以i : 25、i : 50、i : ioo、i : 200的比例混合后加入fls中(見x軸下標注)，
無關(guān)抗體加入在M+SF組中(黑色柱表示)；FLS的增殖用3H參入的方法檢測。 圖9A :篩選針對CYR61基因的特異性siRNA，光學顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染熒光標記小RNA
到細胞內(nèi)的情況，以觀察脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。 圖9B :篩選針對CYR61基因的特異性siRNA，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染熒光標記小RNA到細胞內(nèi)的情況，以觀察脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。 圖9C :篩選針對CYR61基因的特異性siRNA，使用CYR61基因的特異性小RNA干擾人293T細胞株24小時，用realtimePCR檢測CYR61基因的情況，其中以第三條(H_3)效率最高。 圖9D :轉(zhuǎn)染SiCYR61干擾Cyr61表達，進一步用Western Blot方法進行表達蛋白定量分析也表明經(jīng)Cyr61干擾后，蛋白表達量明顯降低。
圖10 :特異性siRNA干擾人CYR61基因的時相分析。使用CYR61基因的特異性小
RNA干擾RA FLS24小時，用realtimePCR檢測CYR61基因的情況。 圖11A :CYR61干擾后RA FLS增殖減少。 圖11B :CYR61干擾后RA FLS凋亡增加。 圖12A :siRNA干擾后FLS后Bcl_2家族mRNA的表達。 圖12B :siRNA干擾后FLS后Bcl_2蛋白的表達。 圖13A :所制備2株中和抗體鑒定，3號單抗與293T細胞株中CYR61蛋白結(jié)合。 圖13B :所制備2株中和抗體鑒定，3號單抗與FLS中CYR61蛋白結(jié)合。 圖13C :所制備2株中和抗體鑒定，10號單抗染色FLS中CYR61蛋白。 圖13D :所制備2株中和抗體鑒定，抗體型別檢測表明所制備的中和抗體為IgG2
型。圖13E :用羅氏公司IsoStrip試劑檢測抗體型別，表明071G12株單抗為IgGl型。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的CYR61蛋白在制藥中的應(yīng)用的具體實施方式
做詳細說明。 實施例1 :CYR61在類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中的表達格局
—、材料與方法
1實驗材料
1. 1臨床樣本 研究中所有樣本均來自于臨床骨科行膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA病人和OA患者，所有病例的診斷符合國際診斷標準。正常對照2例來自與創(chuàng)傷患者?；颊呋そM織用于細胞的體外培養(yǎng)，部分組織4%多聚甲醛固定后留作免疫組化，血清和滑膜液(SF)高速離心后獲得上清，-S(TC儲存。本研究中所用臨床樣本，均對患者進行知情告知。
2實驗方法
2. 1細胞制備 2. 1. 1外周血單個核細胞的制備 肝素抗凝全血采用淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個核
細胞，PBS洗滌2次，細胞備用。 2. 1. 2滑膜液單個核細胞的制備 肝素抗凝滑膜液采用淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個核細胞，PBS洗滌2次，細胞備用。
2. 2FLS的制備及原代培養(yǎng) 無菌獲取滑膜組織，PBS清洗后用無菌手術(shù)剪刀剪切成約lmm*lmm*lmm的碎塊；用2-3倍體積0. 5mg/ml的膠原酶I或膠原酶11，37t:，消化2小時；經(jīng)200目紗網(wǎng)過濾后，離心去上清后，將細胞重懸于DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)皿中，37t:，5X C02培養(yǎng)。之后待FLS生長成片>80%時，消化傳代。并取傳至第3代FLS進行表面標記染色(鼠抗人CDpCDm、CD19，CDllb)鑒定。
2. 3實時定量PCR采用ABI公司提供的軟件prism2. 0設(shè)計CYR61和GADPH(作為內(nèi)參)引物，序列如下 表1.定量PCR檢測基因及引物序列
GeneSequence 5， 》3'
GAPDHACCCACTCCTCCACCTTTGA (forward)
CTGTTGCTGTAGCCAAATTCGT (reverse)
CYR61TCCAGCCCAACTGTAAACATCA (forward)
GGACACAGAGGAATGCAGCC (reverse) 按照QIAGEN試劑盒提供的說明抽提RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄。按照ABI操作說明書進行實時定量PCR。 2. 4滑膜樣本組織病理性和免疫組織化學檢查 將獲得的滑膜樣本按照常規(guī)病理切片要求制備標本，經(jīng)脫水、固定、包埋、切片、染色。進行HE染色和CYR61特異性組織化學染色。
2. 5滑膜組織免疫組化圖像分析 將圖像輸入圖像分析儀，經(jīng)去除原圖中各種噪聲和畸變后進行圖像二值化處理后
將所獲得的測量參數(shù)轉(zhuǎn)換到Excel進行分析，獲得蛋白表達的相對量。 2. 6Westernblot檢測FLS細胞CYR61蛋白表達按照常規(guī)方法進行CYR61蛋白的
電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體雜交與顯色(采用ECL壓片法)。 二、結(jié)果 1. RA病人滑膜組織CYR61mRNA表達增高 本實驗室前期運用基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)CYR61基因在RA滑膜組織中表達增高，為明確RA病人FLS中CYR61的表達情況，我們應(yīng)用實時定量PCR分析了 10例RA患者外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來源的單個核細胞，以及10例患者完整滑膜組織中CYR61mRNA的表達水平，圖1中可見CYR61和內(nèi)部參照GAPDH均得到了特異性S型擴增曲線，各復(fù)孔曲線一致，結(jié)果可靠。分析實時定量PCR結(jié)果，在RA患者的滑膜組織CYR61基因的相對含量比患者的外周血、關(guān)節(jié)液和滑膜組織來源的單個核細胞以及正常人的外周血單個核細胞分別高8. 7倍、125倍及13. 3倍(p < 0. 05)，證實了基因芯片的結(jié)果。
2. RA病人滑膜組織中的CYR61表達增高 為了進一步驗證上述用分子生物學手段檢測的結(jié)果，我們進一步通過HE染色和
免疫組化觀察了 CYR61在滑膜組織不同細胞中的分布及蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與0A
及正?；そM織(圖2A、 B箭頭指示血管周圍無炎癥細胞浸潤)相比，可見RA患者滑膜襯
里層和襯里下層巨噬細胞樣滑膜細胞浸潤，血管增生，大量淋巴細胞，漿細胞和單核細胞浸
潤，淋巴濾泡形成伴纖維素樣壞死，F(xiàn)LS增生(圖2C箭頭指示炎性細胞浸潤)。 在HE染色的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)對RA患者手術(shù)切除的滑膜組織進行
連續(xù)切片、ABC染色發(fā)現(xiàn)，類風濕關(guān)節(jié)炎的滑膜襯里層細胞及襯里下層血管內(nèi)皮細胞、以及FLS中均有CYR61蛋白表達(圖2F箭頭指示棕褐色顆粒為CYR61蛋白)，主要分布于細胞 漿，在滑膜絨毛的近關(guān)節(jié)腔端尤其多見。而OA患者和正常人的滑膜組織則極少見CYR61蛋 白表達(圖2D、 E箭頭指示棕褐色顆粒CYR61蛋白)。
3. RA患者滑膜成纖維細胞體外生長和鑒定 為了驗證免疫組化的結(jié)果，我們建立了 FLS的體外培養(yǎng)體系。將RA、 OA和正常人 手術(shù)得到的滑膜組織進行消化，37t:培養(yǎng)，待長成片狀后進行傳代，顯微鏡下觀察，3-5代的 RA FLS生長迅速，細胞形態(tài)趨向于長梭形，排列整齊，取向一致(圖3A)。用特異性淋巴細 胞分化抗原如CD3， CD14， CD19， CD11C等標記后用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)上述分子表達為陰 性(< 2% CDlIb，< 2% CD14+，< 1% CD3+，and < 5% CD19+)，表明所培養(yǎng)的細胞為較為 均一的FLS，極少有淋巴細胞污染(圖3B)。
4. RA病人滑膜成纖維細胞CYR61表達增高 為明確RA病人FLS CYR61的表達情況，我們應(yīng)用實時定量PCR分析了滑膜組織和 體外培養(yǎng)的FLS中CYR61mRNA的表達格局。如圖4A所示，在RA患者的FLS中CYR61基因 的相對含量明顯高于滑膜組織(P < 0. 01)，說明CYR61主要在RA滑膜組織的成纖維樣滑膜 細胞中表達增高；同時我們還比較了 RA、 OA和正常人培養(yǎng)至第3代的FLS中CYR61mRNA的 表達水平。如圖4B所示，在RA患者的FLS中CYR61基因的相對表達量比OA患者和正常人 的FLS分別高3. 5倍、20倍(p < 0. 05)，從mRNA水平上證實了 CYR61在RA病人FLS表達 增高。 進一步用Western-blot的方法對RA、 OA和正常人的FLS進行CYR61蛋白表達水 平檢測。我們收集了體外培養(yǎng)的RA、 OA、正常人的FLS，加入蛋白裂解液。12%SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜、5X脫脂奶粉封閉過夜、一抗CYR61多克隆抗體(1 : 200稀釋)雜交過夜、HRP 標記二抗(l : 2000稀釋)孵育2h，增強化學發(fā)光混合液中自顯影。結(jié)果可見，RAFLS中 CYR61表達水平明顯高于OA和正常人FLS，從而驗證免疫組化的結(jié)果，更加證明CYR61主要 表達在滑膜的成纖維樣細胞中。這樣系統(tǒng)的建立為進一步分析CYR61在FLS生長和在RA 的滑膜炎癥中的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。 實施例2 :類風濕關(guān)節(jié)炎滑液中CYR61促進FLS的增殖
—、材料與方法 1. 1滑膜液剌激實驗將3-5份滑膜液混勻后加入呈對數(shù)生長期的FLS繼續(xù)培養(yǎng) 24h后檢測CYR61的mRNA及蛋白表達水平，或者FLS增殖(詳見下)。
1. 2細胞增殖和抗體阻斷實驗取對數(shù)生長期的FLS，經(jīng)0. 25%的胰蛋白酶消化后 調(diào)整細胞濃度1 X 104cellS/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的SF(SF與培養(yǎng)
液的比例分別為i : 32、i : i6、i : 8、i : 4、i : 2)或細胞因子(il-io， ili2， ifny，
TNFa和IL-17)，或純CYR61蛋白與FLS共同培養(yǎng)。在培養(yǎng)結(jié)束前16個小時加入lyCi的 3H(每孔)，收集細胞，13液閃儀檢測增殖?？贵w阻斷實驗即在上述SF、或者CYR61蛋白及 細胞因子作用FLS之前，先用相應(yīng)中和抗體進行孵育2小時(同時用無關(guān)單抗作為對照)， 然后再加入FLS的培養(yǎng)中，其余操作同前。 1. 3ELISA檢測滑膜液和外周血中CYR61蛋白收集RA、 OA的SF(各30份)和正 常人外周血(30份，作為對照)，-8(rC保存。檢測時在ELISA板中加入100 ill上述待檢 樣品后置37t:，120分鐘包被。經(jīng)充分洗滌后加入制備的抗CYR61抗體(用購買的標準抗CYR61多抗作為校正和陽性對照)，孵育后洗滌再加二抗和底物，中止反應(yīng)后在ELISA讀板 機492nm處讀取吸光度，根據(jù)檢測樣品和標準品吸光度值計算檢測樣品中各種細胞因子的 2. 8CYR61單克隆抗體制備用基因以重組表達的CYR61蛋白按照常規(guī)方法與等體 積的福氏完全佐劑混勻乳化后，皮下多點注射免疫小鼠。將免疫完成的小鼠脾臟細胞取出 與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行融合。然后進行有限稀釋和篩選出能夠特異性和CYR61基因 工程蛋白結(jié)合的細胞克隆，獲取上清用ELISA方法檢測其特異性和效價。其中3號單抗為 2006年6月22日制得，另一株為2007年12月7日制得。
2. 9CYR61單克隆抗體腹水制備和純化 取CYR61雜交瘤細胞注射至6 8周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔一側(cè)，8 10d左 右后，待小鼠腹腔明顯脹大時，無菌下抽取腹水分裝于一 8(TC保存。
二、結(jié)果 1. RA的滑膜液(SF)剌激FLS增殖與CYR61表達 為了觀察局部炎癥環(huán)境對于FLS的生物學效應(yīng)和CYR61表達的影響，我們將RA患 者的滑膜液(SF)加入培養(yǎng)的細胞中，利用tf-TdR摻入法，在DNA合成水平上，觀察不同濃 度滑液對于RA-FLS增殖的影響。如圖5A所示，滑膜液呈劑量依賴性促進RA FLS的DNA合 成，與對照組相比，各劑量組滑膜液均明顯促進RA FLS的DNA合成(P < 0. 01)。我們在體 外培養(yǎng)中，用RA病人的滑液剌激RA病人的FLS。用不同濃度的RA-SF剌激FLS，隨著濃度 增高，其剌激CYR61表達的作用也增強。RA的SF的剌激作用呈劑量依賴性。RA-SF稀釋到 1 : 32，剌激作用基本消失。本試驗分別在mRNA水平和蛋白水平進行了 real-time PCR檢 測(圖5B)和western blot(圖5C)分析。
2. RASF中IFN- y和TNF- a可上調(diào)CYR61表達 由于SF中含有高濃度的細胞因子，為了明確這些細胞因子是否與CYR61上調(diào)有 關(guān)，本研究中用純化的細胞因子分別剌激RA FLS，觀察其CYR61的表達情況。為了模擬 其在體內(nèi)的作用，細胞因子的濃度選擇為在SF中能夠檢測到的濃度。結(jié)果表明IFN-y 和TNF-a能夠上調(diào)CYR61的表達。為了明確該兩種細胞因子的作用，進而采用阻斷抗體 anti-IFN-y (10ii g/ml)和anti-TNF-a (200ng/ml)分別與SF混勻，在剌激8小時后收 集培養(yǎng)的細胞，使用real timePCR的方法檢測其CYR61的表達水平。結(jié)果顯示細胞因子 IFN-y和TNF-a均有上調(diào)CYR61表達的作用，混合的細胞因子作用最強，與SF相似(圖 6A)。而用IFN-y和TNF-a抗體阻斷后，SF的剌激作用也明顯下降，聯(lián)合阻斷的作用更明 顯(圖6B)。 3. RA患者SF中含有高濃度CYR61 : 由于CYR61是一種分泌性蛋白，具有明顯的促有絲分裂活性，可誘導(dǎo)成纖維細胞 增殖。而我們的實驗也證實RA病人滑膜細胞中高表達CYR61蛋白，為此我們采用本室制備 的具有結(jié)合天然CYR61蛋白的3號單克隆抗體(3號單克隆抗體制備方法見上述2. 8CYR61 單克隆抗體制備)，檢測RA SF(n = 30)中CYR61蛋白的含量，并與0A SF和RA患者外周血清 相對比。結(jié)果顯示RA SF中CYR61蛋白明顯高于對照OA SF，RA患者外周血(P < 0. 0001， 圖7)。 4. RA SF中的CYR61蛋白可以剌激FLS的增殖
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為了研究SF中的CYR61蛋白是否具有剌激滑膜細胞增殖的作用，我們上述3號單 抗中和SF中的CYR61蛋白，觀察對滑膜細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的FLS，接種至96
孔培養(yǎng)板中，將抗人cyr61單抗與sf混合，按照i : 25、i : sou : ioo、i : 200比例加
入SF中，同時設(shè)無關(guān)單抗(1 : 25)為對照。經(jīng)與滑膜細胞培養(yǎng)24小時后Thymidine摻入 檢測FLS的增殖作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYR61單克隆抗體能夠中和RA-SF剌激滑膜細胞增殖的作 用，并且呈劑量依賴性。當RA-SF稀釋到1 : 200，阻斷作用基本消失(圖8)。表明CYR61 蛋白具有剌激滑膜細胞增殖作用。 實施例3 :CYR61促進類風濕關(guān)節(jié)炎FLS增殖的機理研究
—、材料與方法 1、臨床樣本、CYR61基因和蛋白表達檢測均同"實施例1 :CYR61在類風濕關(guān)節(jié)炎滑 膜組織中的表達格局"的材料與方法中所述。 2、 FLS培養(yǎng)及增殖剌激實驗，同"實施例2 :類風濕關(guān)節(jié)炎滑液中CYR61促進FLS 的增殖"的材料與方法中所述。
3、SiRNA干擾實驗 3. 1 :SiRNA序列與合成根據(jù)siRNA設(shè)計原理合成3條SiRNA，序列如下 Sl :5' -CCA GAA AUG UAU UGU UCA ATT-3- 5' -UUG AAC AAU ACA UUU CUG GCC-3- S2 :5' -UCA AGG UAU CAA UGU UUA ATT-3- 5' -UUG CUC GCA ACA AAU CUG CTC-3- S3 :5' -CAA CGA GGA CUG CAG CAA ATT-3- 5' -UUU GCU GCA GUC CUC GUU GAG—3- 3. 2siRNA轉(zhuǎn)染采用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(gen印orter)和含抗生素的無血清成分 DMEM溶液，轉(zhuǎn)染體系(以24孔板為例)為250 ill 。將5 X 1043_5代FLS種于24孔板中，于 37°C，5% C02培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；然后在12iU gen印orter與113iU的DMEM混勻物中加入 2 ill siRNA并輕輕混勻，室溫靜置25min。將上述混勻的轉(zhuǎn)染液體加到培養(yǎng)的細胞懸液中 (同時設(shè)無關(guān)SiRNA作為對照)，置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5_7小時后，加含等體積的 20% FBS和含抗生素的DMEM營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24-48小時后，取培養(yǎng)的細胞做實時定量PCR 和Western Blot，檢測干擾的效果。4. 0CYR61抑制FLS凋亡機理研究將上述經(jīng)干擾CYR61的細胞分為三組，即轉(zhuǎn)染 lOOnM NC siRNA組；轉(zhuǎn)染lOOnM S3siRNA組；正常細胞組。轉(zhuǎn)染siRNA后24h收集細胞，檢 測細胞增殖，凋亡細胞比例已經(jīng)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、 Bcl-xl、 Bax、 Bad、 Bim的表達格局。
二、結(jié)果 1. CYR61基因的特異性小RNA篩選試驗 我們分別設(shè)計了 3條針對人CYR61基因的雙鏈小RNA (siRNA)(見材料方法)，同 時用與哺乳動物無關(guān)的siRNA作為陰性對照(siRNA of Negativecontrol， siNC)。用脂質(zhì) 體(gen印orter)將siRNA轉(zhuǎn)染到細胞中，光學顯微鏡圖(見圖9A)和熒光顯微鏡和(見圖 9B)觀察轉(zhuǎn)染了熒光標記siRNA的細胞情況，顯示轉(zhuǎn)染率約為80-90%。用RealtimePCR檢 測干擾24小時后CYR61的表達水平，其中H-3是針對人CYR61的特異性siRNA，作用CYR61 后使CYR61表達的抑制率達70-80% (見圖9C) ， CYR61蛋白表達也明顯降低(圖9D)。
2. siRNA干擾人CYR61基因表達的時相分析 使用特異性siRNA干擾RA FLS中CYR61基因的表達，同時使用無關(guān)siRNA作為對 照，使用Realtime PCR檢測不同時間CYR61基因的表達變化情況對于RA FLS干擾試驗， 24小時的細胞中CYR61基因的表達是對照的20-30% ，48小時時抑制率略有下降，在40% 左右(p < 0. 05，圖10)。 3.特異性siRNA干擾滑膜細胞CYR61表達后，滑膜細胞增殖減低，凋亡增加
前面的試驗發(fā)現(xiàn)SF可以剌激FLS的增殖，并且呈劑量依賴性；而用CYR61中和抗 體可以明顯阻斷SF剌激FLS增殖的作用，說明CYR61與滑膜細胞的增殖密切相關(guān)。為了進 一步驗證兩者間的關(guān)系，我們采用siRNA的方法，特異性干擾RA FLS中CYR61基因的表達， 同時使用無關(guān)siRNA作為對照，使用^參入的方法檢測RA FLS的增殖能力發(fā)現(xiàn)抑制CYR61 基因后RA FLS的增殖能力下降(p〈0.0001，圖llA)。為了深入研究CYR61與RA FLS增殖的 關(guān)系，我們采用FACS的方法檢測了RA FLS siRNA干擾后凋亡細胞的比率(Annexin-V+PI): 發(fā)現(xiàn)siRNA干擾后RA FLS凋亡細胞的比率增加(p < 0. 0001，圖11B)。
4.特異性siRNA干擾滑膜細胞CYR61表達后，細胞凋亡增加的機理
前面的試驗發(fā)現(xiàn)siRNA干擾后RA FLS凋亡增加，說明CYR61與滑膜細胞的凋亡 密切相關(guān)。為了深入研究CYR61與凋亡相關(guān)基因表達的關(guān)系，我們采用siRNA干擾的方 法，在體外干擾FLS CYR61基因的表達，抑制率大于60% ，用實時定量PCR檢測凋亡線粒 體途徑相關(guān)基因bcl-2， bcl-xl， bax， bim， bad ;發(fā)現(xiàn)抑凋亡相關(guān)基因Bcl_2mRNA水平下調(diào) (p < 0. 001，圖12A)，促凋亡相關(guān)基因Bim略增加，而促凋亡基因Bad、 Bax和抑凋亡基因 Bcl-xl沒有明顯變化。提示CYR61促進滑膜細胞增殖可能與抑凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達 下調(diào)有關(guān)。為了驗證mRNA水平的結(jié)果，我們采用FACS的方法檢測Bcl_2的蛋白水平，發(fā)現(xiàn) 抑制CYR61表達的同時FLS中Bcl-2蛋白表達水平也明顯下降(p < 0. 01，圖12B)。從而 證實CYR61是通過抑制線粒體途徑的Bcl-2家族(主要通過下調(diào)Bcl-2蛋白)來發(fā)揮抑制 FLS細胞凋亡作用的。
實施例4:雜交瘤的制備 1.取6周齡雌性BALB/c小鼠，以重組表達的CYR61蛋白〔50pg/只)為抗原分別 與等體積的福氏完全佐劑混勻乳化后，皮下多點注射免疫小鼠。間隔3周重復(fù)免疫3次。 在免疫第三次后4周時取小鼠眼框血，用ELISA測效價達到1.6Xl(f時，沖擊免疫(50ng/ 只)，3天后融合。 2. SP2/0細胞培養(yǎng)融合前2周常規(guī)復(fù)蘇凍存的小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0細胞，置 于37t:，5XC0j哮箱中培養(yǎng)。第一周用8-AG培養(yǎng)基培養(yǎng)，第二周改用完全培養(yǎng)基。融合前 48-36小時改用含20% FBS的培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，融合當天收集重懸10ml RPMI 1640中，使 細胞數(shù)達2X107。 3.飼養(yǎng)層細胞的制備融合前1天取8周齡以上的BALB/c小鼠，拉頸處死，無菌 操作剪開腹部皮膚，暴露完整腹膜，用注射器向腹腔注入5ml RPMI 1640培養(yǎng)液，吸出腹腔 中的液體后再用RPMI 1640培養(yǎng)液重復(fù)一次。收集腹腔巨噬細胞，加入HAT培養(yǎng)基，調(diào)整細 胞濃度到2X 107ml，每孔0. lml加入96孔細胞培養(yǎng)板。 4免疫脾細胞的制備取激發(fā)免疫后3天的BALB/c小鼠，無菌操作取脾，研磨得 到脾臟細胞懸液，裂解紅細胞后得到脾臟細胞，加入RPMI 1640培養(yǎng)液計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至1X108。置于培養(yǎng)箱中備用。 5細胞融合免疫小鼠的脾臟細胞與SP2/0細胞比例10 : l，按常規(guī)方法進行融 合。用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后，改用HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，再換成含10% FCS的RPMI 1640于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，直至有克隆出現(xiàn)。 6.雜交瘤篩選當細胞集落長至l/3孔大小時(融合后約7-10天)，用間接ELISA 篩選分泌抗CYR61蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞集落。每塊板均需用融合小鼠的血清 (1 : 200)作為陽性對照，用完全培養(yǎng)液、SP20細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照。3日后再檢測 l次。 7.雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)取兩次檢測中全部為陽性的雜交瘤細胞，采用有限 稀釋法進行克隆化培養(yǎng)，以達到每個培養(yǎng)孔中只有一個起始雜交瘤細胞。同樣當細胞集落 長至1/3孔大小時再用間接ELISA法檢測有無特異性抗CYR61單抗分泌，2日后再檢測一 次。選擇兩次ELISA檢測均為陽性且倒置顯微鏡下觀察為單個克隆的孔進行第二次克隆 化。第二次克隆化的培養(yǎng)及檢測方法均與第一次克隆化相同。選擇mAb分泌陽性且于倒置 顯微鏡下觀察單個克隆的孔進行第三次及第四次克隆化培養(yǎng)。并收集上清用于檢測單抗產(chǎn) 生與效價。 實施例5 :單克隆抗體的分離和滴度測定 1、用lng CYR61蛋白包被ELISA檢測板上(100u1/孔)，將板放置于4"過夜，次 日取出用3% BSA封閉，室溫4小時，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
2、取經(jīng)倍比稀釋的100ul雜交瘤培養(yǎng)上清( 一抗)加于上述已經(jīng)包被有CYR61蛋 白的孔中(同時設(shè)標準抗體作為制備標準曲線)，室溫孵育4小時。用洗滌液將反應(yīng)板充分 洗滌4-6次，向濾紙上印干。 3、在上述每孔中加入酶標抗體工作液(二抗)100iU，將板放置于室溫2小時。用 洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。 4、每孔中加入底物工作液lOOiU，將板放置于室溫20分鐘，每孔加入1滴終止液 使反應(yīng)中止。在讀扳機上混勻后，于492nm處測吸光度，根據(jù)檢測樣品和標準品吸光度值來 計算檢測上清中抗CYR61單抗及其滴度。本發(fā)明中所制備單抗效價(上清中)為104一8。
5、單克隆抗體的類型鑒定 將單克隆陽性雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行稀釋，采用小鼠單克隆抗體免疫球蛋白分 型檢測試劑盒進行快速測定。本次所制備的單抗分別為IgM型(輕鏈k型，3號)(圖13D) 和IgGl型(輕鏈k型，10號)(圖13E)。 6、單克隆抗體的特異性鑒定用免疫組化化學鑒定單克隆抗體，分別取雜交瘤細
胞的無血清培養(yǎng)上清和小鼠腹水稀釋后作為一抗，檢測RA滑膜細胞和293T細胞中CYR61
蛋白的表達。發(fā)現(xiàn)其中有兩株(3號和10號)具有能夠與天然CYR61結(jié)合的能力，免疫組
化的方法也驗證了同樣結(jié)果。 實施例6 :單克隆抗體的應(yīng)用效果實驗 1、取對數(shù)生長期的FLS，經(jīng)0. 25%的胰蛋白酶消化后，反復(fù)吹吸使成單細胞懸液。 調(diào)整細胞濃度1 X 104cellS/ml，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 y 1，接種細胞量為 2. OX 103cells/孔；將細胞置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱貼壁生長24小時。
2、從RA患者關(guān)節(jié)中無菌抽取的滑膜液，經(jīng)離心去除組織碎片之后，將3-5份滑膜
12液混勻；將不同稀釋度的CYR61單克隆抗體加入混勻SF中(CYR61單克隆抗體與SF的比例
分別為i : 25、i : sou : ioo、i : 200)37t:孵育2h后，加入滑膜細胞中再培養(yǎng)24小時；
然后每孔中加入1 y Ci的3H-TdR，再培養(yǎng)16小時。 3、用細胞收集儀收集上述細胞，加閃爍液檢測其3H-TdR。根據(jù)加入抗CYR61單抗 后FLS增殖受到抑制而判斷其中和能力。如圖8所示，所制備的抗CYR61單抗能夠阻斷FLS 增殖。 用基因工程方法人工表達人CYR61蛋白并免疫小鼠，常規(guī)方法融合并用CYR61蛋 白篩選獲得14株特異性單克隆抗體。采用無血清細胞培養(yǎng)上清進行免疫組化方法鑒定能 與組織細胞中天然CYR61蛋白結(jié)合的活性抗體。由于已有報道293T細胞中高表達CYR61， 因此本實驗選用293T細胞作為陽性對照。結(jié)果表明免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)其中有兩株(3號和 10號)能夠與293T細胞和滑膜細胞的CYR61結(jié)合(圖13A，圖13B圖13C)。進一步擴增上 述雜交瘤細胞株并按照常規(guī)方法制備小鼠腹水，采用羅氏公司IsoStrip試劑檢測抗體型 別，結(jié)果顯示所制備的單抗為IgM型(圖13D)IgGl型(圖13E)，效價檢測結(jié)果為104—8。為 了檢測上述抗體是否具有中和CYR61蛋白功能的作用，采用所制備抗體進行了 SF中CYR61 蛋白檢測實驗和抗體SF剌激滑膜細胞增殖實驗，結(jié)果表明所制備的抗體成功用于RA和 0A滑液中CYR61蛋白檢測，和SF剌激FLS的生長阻斷實驗。表明本實驗室已經(jīng)成功制備了 能夠中和CYR61作用的鼠源性抗體。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
1權(quán)利要求
一種由小鼠抗人CYR61單克隆抗體雜交瘤CGMCC NO.2766或CGMCCNO.2767分泌的單克隆抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備治療風濕性疾病疾病藥物中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的風濕性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能夠中和CYR61的單克隆抗體及其應(yīng)用和能產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種由小鼠抗人CYR61單克隆抗體雜交瘤CGMCC No.2766或CGMCC No.2767分泌的單克隆抗體。單克隆抗體在制備治療風濕性疾病疾病藥物中的應(yīng)用，所述的風濕性疾病是類風濕性關(guān)節(jié)炎。本發(fā)明優(yōu)點在于1、用自制單抗既能夠研究CYR61在類風關(guān)的發(fā)病機理，能夠準確定位CYR61的表達和檢測患者血清及病變部位(如關(guān)節(jié))的CYR61水平。2、能夠作為制備檢測試劑盒以區(qū)別骨關(guān)節(jié)炎和類風關(guān)的臨床診斷之用。3、又能夠?qū)ふ夷軌蛑泻皖愶L關(guān)患者滑膜表面及滑液中的CYR61的結(jié)合表位，為下一步制備能夠中和CYR61的人源化抗體提供篩選依據(jù)。
文檔編號A61P29/00GK101747435SQ20081020727
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者李寧麗, 沈佰華, 王利, 黃立東 申請人:上海市免疫學研究所