專利名稱：一種防治豬囊尾蚴病的dna疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防治豬囊尾蚴病的DNA疫苗及 其制備方法。
背景技術(shù)：
囊尾蚴病簡稱囊蟲病，是由豬帶絳蟲的幼蟲一豬囊尾蚴感染豬或人而引 起的一種人畜共患病。本病廣泛流行于世界各地，以發(fā)展中國家如巴西、印 度等較為多見，嚴重威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)，中國是囊蟲病的流行國家 之一。
目前囊尾蚴病的治療方案多為常規(guī)藥物治療，療效不太理想，副作用較 大，且只能用于感染后治療而不能用于預(yù)防。疫苗是預(yù)防囊蟲病的重要手段，
目前國內(nèi)有關(guān)囊蟲病疫苗的研究主要有兩個方面 一種是豬囊尾蚴細胞疫苗 的研制，細胞苗具有良好的免疫力，但細胞株穩(wěn)定性較差；另一種是DNA 疫苗。
DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價維持時間長和交叉 保護效果好等優(yōu)點。DNA疫苗有以下特點(1)能誘發(fā)體液及細胞全方位免 疫應(yīng)答，既有預(yù)防作用又有治療作用，且免疫應(yīng)答持久。(2)能將免疫佐劑 CpG序列整合入核酸疫苗內(nèi)，提高機體的免疫應(yīng)答水平而無需另加佐劑。(3) 生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉、易于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，穩(wěn)定性好且貯運方便。 (4) DNA疫苗用量少，比其他疫苗更經(jīng)濟。DNA疫苗的作用機理為將克隆 的保護性抗原基因重組入真核表達質(zhì)粒載體，注射于肌肉組織，使其在肌細 胞中表達抗原，經(jīng)過抗原提呈過程，可激活體內(nèi)的體免疫系統(tǒng)和細胞免疫系 統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異的抗體，消除游離在血液中的病原物， 并預(yù)防病原物的入侵；而激活的細胞免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生細胞毒淋巴細胞 (CTL)，攻擊已被感染的細胞，消除隱藏的病原。
防治豬囊尾蚴病的DNA疫苗，國內(nèi)已有報道。鄧小昭等研制的豬囊尾 呦DNA疫苗pVAX-S- △ c-3n對免疫仔豬的相對保護率為83%。才學(xué)鵬等研制的AgBDNA疫苗減蟲率達80。/。；本申請人遺傳教研室的王慶敏等、吳丹 等研制的DNA疫苗的減蟲率分別為80%和73%。
豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白Anx B2基因是一種豬囊尾蚴抗原基因，是從囊尾呦 中發(fā)現(xiàn)的，其基因序列如SEQ ID NO: 1所示(Wang K,Guo Y，Li K，et al. Acta Trop. 2006 Oct;99(2-3): 165-72.)，其編碼的蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示)具有較強的敏感性和特異性，可作為防治囊尾呦病的候選抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的預(yù)防和治療治豬囊尾呦病的DNA疫苗， 及其制備方法。
本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療治豬囊尾呦病的DNA疫苗，是由真核表 達載體pcDNA3.1和豬囊尾呦抗原基因組成，其中的豬囊尾呦抗原基因是豬 囊尾蚴膜聯(lián)蛋白B2 (Anx B2)基因。Anx B2基因序列如SEQ ID NO: 1所 示。AnxB2基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
本發(fā)明還提供了上述預(yù)防和治療治豬囊尾蚴病的DNA疫苗的制備方 法，其中的豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白B2 (AnxB2)基因是從六鉤呦中克隆出來。 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下-
1.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白B2 (AnxB2)可在囊尾蚴的早期階段—六鉤蚴 階段表達，并從豬帶絳蟲蟲卵(內(nèi)含成熟六鉤呦)中成功克隆出AnxB2基因。
在帶科絳蟲病的免疫防治中，六鉤蚴階段表達的抗原對中間宿主具有較 強的保護作用，由于六鉤蚴是侵入宿主的最初階段，以其為靶位構(gòu)建疫苗可 能會取得更好的保護效果。Harrison等用羊帶絳蟲(Taenia ovis)六鉤呦抗原免 疫綿羊，減蟲率為100% (Harrison GBL , et al. Identification of host protective antigens of taenia ovis oncospheres . Int J parasitol， 1993, 23:41 )，此為六鉤呦來 源的抗原在羊緣蟲疫苗研究上取得的突破性進展，澳大利亞已成功地制備了 羊帶絳蟲六鉤蚴疫苗，并運用重組基因技術(shù)大量生產(chǎn)。Lightowlers等發(fā)現(xiàn)牛 帶絳蟲六鉤蚴的TSA- 9和TSA- 18抗原獲得最高保護率為94 %。 Plancarte 等利用豬帶絳蟲六鉤蚴抗原對豬進行免疫，結(jié)果獲得了 83%的免疫保護。 Verastegui等研究表明，粗制豬囊蟲六鉤呦抗原(OAs)可以誘導(dǎo)100%的保護 而中絳期抗原僅能產(chǎn)生部分保護。駱學(xué)農(nóng)等用45W-4BX和TSOL18兩種豬帶絳蟲六鉤呦抗原的重組蛋白免疫家豬，減蟲率均在88%以上。羊45W和 牛TSA18重組疫苗的問世，也證明了六鉤蚴階段基因在預(yù)防絳蟲感染中具 有重要作用。
本發(fā)明從六鉤蚴中克隆出Anx B2基因，且Anx B2蛋白具有較好的敏 感性和特異性，因此預(yù)計利用Anx B2基因構(gòu)建的DNA疫苗對囊尾呦宿主 將具有很好的保護作用。
2.構(gòu)建一種預(yù)防和治療治豬囊尾呦病的DNA疫苗
本發(fā)明將Anx B2全長序列(如SEQ ID NO: 1所示)插入到真核表達 載體pcDNA3.1中，構(gòu)建出DNA疫苗pcDNA3.1 - Anx B2 。其中pcDNA3.1 為真核表達載體(購自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見該公司產(chǎn)品目錄)； 構(gòu)建過程以及制備過程中質(zhì)粒擴增所用的宿主菌為DH5oc (購自GIBCO公 司)。
本發(fā)明的DNA疫苗的制備方法，具體步驟如下
A、 豬帶絳蟲六鉤蚴的活化和總RNA的提取及RT-PCR、 PCR擴增 將采自豬帶絳蟲病人的新鮮緣蟲節(jié)片用生理鹽水沖洗，使蟲卵釋放出
來，離心漂洗，加入次氯酸鈉至大多數(shù)蟲卵破殼后，加入O. 2mol/L硫代 硫酸鈉終止反應(yīng)，3000r/min離心除去蟲卵碎片，用生理鹽水懸浮沉淀，加 入含胰酶和豬膽汁的孵化激活液，37。C孵化40分鐘，離心棄上清液，沉淀即 為活化的豬帶絳蟲六鉤蚴；將豬帶絳蟲六鉤呦沉淀置于微型勻漿器中，加入 裂解液，用TIANGEN總RNA提取試劑盒，提取總RNA置于一80。C保存。
以O(shè)ligo dT為引物用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄(具體步驟見 說明書)，以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以
弓l物l: 5'畫CGGGATCCATGGCAAAAAATACTCGCTCACC-3，禾口
引物2: 5'陽CCGCTCGAG TTAGGATTCATTCAGTAGTGCG隱3'
進行PCR擴增，回收1200bp左右的PCR產(chǎn)物；
B、 克隆片段的測序
將上述PCR回收產(chǎn)物插入pGEM-T載體經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH-5a 大腸桿菌，利用藍白斑篩選批出白色陽性克隆，在37"C擴增以堿裂解法提取 質(zhì)粒DNA進行測序，序列正確，如SEQIDNO: l所示，成功克隆出AnxB2 基因；
C、 pCDNA3.1-AnxB2疫苗構(gòu)建及制備以含目的基因的質(zhì)粒pGEM-T-Anx B2為模板，以上述引物1和引物2 進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物膠回收后用SamH I和xhol雙酶切，與同樣SamH I和xhol雙酶切的pCDNA3.1載體經(jīng)T4連接酶相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a， 藍白斑篩選獲得陽性重組子，提取質(zhì)粒，萬flmHI、 xhol酶切和測序鑒定， 測序結(jié)果正確，即獲含有重組質(zhì)粒pCDNA3.1-AnxB2的工程菌DH5a;
上述含有重組質(zhì)粒pCDNA3. l-Anx B2的工程菌DH5a，通過細菌培養(yǎng)、 質(zhì)粒擴增、分離純化質(zhì)粒DNA，最終獲得透明澄清的DNA疫苗。
本發(fā)明構(gòu)建的DNA疫苗，經(jīng)體外實驗證明可在哺乳動物細胞中表達Anx B2抗原；體內(nèi)實驗證明本DNA疫苗免疫動物后，可以表達AnxB2抗原并 可有效誘導(dǎo)體內(nèi)的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，機體在很長時間內(nèi)維持較高水平的抗 體效價，而作為對照組的GST-Anx B2重組蛋白疫苗抗體效價比本DNA疫 苗高，但是抗體效價從8周起即開始下降。本DNA疫苗免疫仔豬后，減蟲率 為85%。
本發(fā)明能有效地誘發(fā)仔豬的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并對動物的囊尾蚴感染有較 好的免疫保護作用；且生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲存 和運輸。
本發(fā)明的預(yù)防接種方案較佳的是用本發(fā)明的DNA疫苗lml肌肉注射 即可，劑量為每頭仔豬500)ag。 20天后追加免疫一次，即可對仔豬產(chǎn)生免疫 保護反應(yīng)。


圖1是六鉤呦總RNA的提取、AnxB2基因PCR瓊脂糖凝膠電泳圖譜
其中1:總RNA ; 2:Anx B2 PCR產(chǎn)物 圖2是pcDNA3.1-Anx B2疫苗的瓊脂糖凝膠電泳圖譜 圖3是pcDNA3.1-Anx B2疫苗誘發(fā)小鼠血清抗體效價的時間曲線
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。 實施例l:從六鉤蚴中克隆AnxB2基因
1.豬帶絳蟲六鉤呦的活化和總RNA的提取及RT-PCR、 PCR擴增
將采自豬帶絳蟲病人的新鮮絳蟲節(jié)片(購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué))用生理鹽水沖洗數(shù)次，置于7mlEppendor滑中剪碎并擠壓使蟲卵釋放出來，3000 r/ min離心漂洗3次；加入等量次氯酸鈉作用幾分鐘(鏡檢大多數(shù)蟲卵破殼)后， 迅速加入等量的O. 2mol/L硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，3000r/min離心除去蟲 卵碎片；用生理鹽水重新懸浮沉淀，加入含胰酶和豬膽汁的孵化激活液，37°C 孵化40min(每10min劇烈振蕩l次)，離心棄上清液，沉淀即為活化的六鉤呦。 稱取30 mg六鉤蚴沉淀置于微型勻漿器中，加入lmlTRNzol裂解液迅速勻槳 后，其余步驟按TIANGEN總RNA提取試劑盒進行(購自TIANGEN公司，具 體步驟見試劑盒說明書)，所提取總RNA (見圖l中的l)置于一8(TC保存。 取抽提液4pl為模板，以O(shè)ligo dT為引物進行反轉(zhuǎn)錄(具體步驟見 Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)。以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以 弓l物l: 5'畫CGGGATCCATGGCAAAAAATACTCGCTCACC-3，禾口 引物2: 5'-CCGCTCGAG TTAGGATTCATTCAGTAGTGCG-3' 進行PCR擴增，回收1200bp左右的PCR產(chǎn)物(見圖1中的2)。 2.克隆片段的測序
將上述PCR回收產(chǎn)物插入pGEM-T載體(購自Promega公司)經(jīng)T4連 接酶(購自NEB公司)連接過夜后轉(zhuǎn)化DH-5a大腸桿菌(購自GIBCO公司)， 利用藍白斑篩選批出白色陽性克隆，在37。C擴增以堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 進行測序，序列正確，如SEQIDNO: l所示，成功克隆出Anx B2基因。(具 體實驗步驟參見第三版《分子克隆》，科學(xué)出版社，2002年出版相關(guān)內(nèi)容) 實施例2: pCDNA3.1-Anx B2疫苗構(gòu)建及制備
1. pCDNA3.1 -Anx B2 DNA疫苗的構(gòu)建
以含目的基因的質(zhì)粒pGEM-T-Anx B2為模板，以上述引物1和引物2 進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物膠回收后用5amH I和xhol雙酶切(購自NEB公 司)，與同樣BamHI和xhol雙酶切的pCDNA3.1載體(購自Invitrogen公 司)經(jīng)T4連接酶相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，藍白斑篩選獲得陽性重組子， 提取質(zhì)粒，SamHI、 xhol酶切和測序鑒定，測序結(jié)果正確，即獲含有重組 質(zhì)粒pCDNA3.1-AnxB2的工程菌DH5oc。(具體實驗步驟參見第三版《分子 克隆》，科學(xué)出版社，2002年出版相關(guān)內(nèi)容)
2、 制備DNA疫苗
本發(fā)明DNA疫苗用上述工程菌株DH5ot( pCDNA3.1-Anx B2)制備。培 養(yǎng)擴增及純化可通過常規(guī)的細菌培養(yǎng)、質(zhì)粒擴增和純化方法進行。(具體實驗步驟參見第三版《分子克隆》，科學(xué)出版社，2002年出版相關(guān)內(nèi)容)
從擴增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，可采用一些常規(guī)的方法。本 發(fā)明采用堿裂解法質(zhì)粒大抽A型超純試劑盒，制備高純度的質(zhì)粒DNA (具 體見BioDev試劑盒說明書)。經(jīng)PBS稀釋分裝，即獲得透明澄清的本發(fā)明 DNA疫苗純品(內(nèi)毒素〈10EU/ml)(見圖2)。 實施例3: pCDNA3.1-Anx B2疫苗的體外表達
將所構(gòu)建的DNA疫苗通過電穿孔法轉(zhuǎn)染COS7細胞(具體步驟參見第 三版《分子克隆》，科學(xué)出版社，2002年出版相關(guān)內(nèi)容)，72小時后收獲細 胞，以間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清及細胞破碎液中抗原AnxB2的表達水平， 顯色后，以P/N比值大于1.8為陽性，結(jié)果上清和細胞裂解液均為陽性，Anx B2抗原在COS7細胞中得到了表達。說明本DNA疫苗可在哺乳動物細胞中 表達。
實施例4: pCDNA3.1-Anx B2疫苗的體內(nèi)表達
獲得的DNA疫苗純品免疫6 8周齡BALB/c小鼠(100嗎/ 100ul /只， 右后肢股四頭肌肌肉注射)，2周后分別尾靜脈采血，分離血清，ELISA法 檢測血清中的抗原水平，顯色后，以P/N比值大于1.8為陽性。結(jié)果抗原表 達為陽性，表明本DNA疫苗免疫動物后，可以表達AnxB2抗原。 實施例5: pCDNA3.1-Anx B2疫苗誘發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答水平的檢測
將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠BALB/c小鼠，雌雄各半，6 8周 齡(平均體重20g)， 30只隨機分成3組，每組10只，第1組接種該DNA 疫苗(每只接種100ng， 100ul PBS溶解)，第2組接種GST-Anx B2重組蛋 白(用等體積弗氏不完全佐劑乳化蛋白，每只接種蛋白100嗎/l00u1，)，第 3組為PBS陰性對照。將質(zhì)粒IOO嗎經(jīng)右后肢股四頭肌肌肉注射給1組小鼠， 蛋白100嗎經(jīng)右后肢股四頭肌肌肉注射給2組小鼠，3組小鼠則接種等體積 PBS。 IO天后分別加強免疫一次。于初次注射當(dāng)日注射前和初次注射后第2、 4、 6、 8、 10、 12、 16周經(jīng)尾靜脈取血，分離血清后以間接ELISA法檢測血 清中抗囊尾蚴抗體的水平。
結(jié)果DNA疫苗組可以在很長時間內(nèi)維持較高水平的抗體效價，而作為 對照組的蛋白疫苗抗體效價比DNA疫苗高，但是抗體效價從8周起即開始 下降。(圖3)
實施例6: pCDNA3.1-Anx B2疫苗對仔豬囊尾蚴感染的免疫保護作用將獲得的DNA疫苗純品免疫仔豬(1月齡)，仔豬隨機分為2組，每組 10只，第1組肌肉注射DNA疫苗500^ig/ml/頭，20天后加強免疫一次；第 2組為正常對照組。在初次免疫后的第30天攻擊感染，每頭約三萬個蟲卵， 攻擊感染90天后進行解剖，檢査病理改變情況，計算囊尾呦總數(shù)，并進行 囊尾蚴的體外培養(yǎng)以檢測頭節(jié)翻出率，據(jù)此計算保護率。結(jié)果表明，未免疫 組仔豬與免疫組相比，在囊蟲蟲卵攻擊感染后精神不振，被毛蓬亂，不光澤。 pCDNA3.1-AnxB2疫苗對免疫仔豬的減蟲率為85%。
以上實驗結(jié)果可以證明，本發(fā)明的DNA疫苗能有效地誘發(fā)機體的免疫 應(yīng)答反應(yīng)，對仔豬預(yù)防囊尾蚴感染起到較好的免疫保護作用。SEQUENCE LISTING <110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
<120> —種防治豬囊尾呦病的DNA疫苗及其制備方法 <130>說明書,權(quán)利要求書
<160> 2
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211〉 1065
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcaaaaa atactcgctc accctctcag
cccacactga agcccaatcc caactttgat
tccatgcgtt gttggggcac cgatgaggaa
agtgaagagc gtctccagat tgt犯gcctg
cacgatctgg acggtgatct gaaaggtcac
gaccccatct atctgatggc aaaatcgctc
gagaatacca tcattga犯t cattgtaggc
tatttcgact gcaatggaaa acctttcaga 60
gtgaatgctg acgtggaggc gctctgcaaa 120
acaatcacca aaatcttggg aaagaggaca 180
tacaagc犯a agtacggtcg tgaacttgca 240
tttagagatt gcaccatcct actaaccgag 300
tactacgcaa tgaagggtgt tggcacgaat 360
tgcacaaatg aggaaattaa caagctt犯a 420caattctaca tatacgttct gcgtgacaag gggattaaag atccaaaacg caccctggag 480
actgacatcc gcacagagsc aacgggctac ttctgcaaaa tgctgttgca gcttctaaag 540
ggtgacattc ccgatccaac gccagagcag cttcgcacca ttcagcaaaa aggcggcgac 600
ctaatggtca atcagaaaga ggttacagct gccgtcaaac a犯ttgtgga ggcgctagca 660
aaaccgaaga attcaac犯a t.tctgtcctt ctgaacgcat tccagcacaa aaatgtttgg 720
ga犯tagcag ctatggataa agagtacaaa aaggcaagtg gaaagggcct tatttcagcc 780
atatcagagg ctgtagaggg agaattcggc acattgctca tggccatggt tcaacacgcc 840
gtagacagac cgaagttcta ttctgaggct ctctaccaat ccatggtggg tc犯ggaaca 900
cgcgacttcc tcctcatgcg agtcctcatt ctgcgctctg agattgattt gctggacatc 960
aaggagacgt tcgataagga ccacaagagt ttggccgaat ggataaaggg tgaaacctcg 1020
ggctactatg aacaactact gctcgcacta ctgaatgaat cctaa 1065
<210> 2 <211> 354 <212〉 PRT <213>人工序列 <400> 2
Met Ala Lys Asn Thr Arg Ser Pro Ser Gin Tyr Phe Asp Cys Asn Gly
1 5 10
15Lys Pro Phe Arg Pro Thr Leu Lys Pro Asn Pro Asn Phe Asp Val Asn 20 25 30
Ala Asp Val Glu Ala Leu Cys Lys Ser Met Arg Cys Trp Gly Thr Asp 35 40 45
Glu Glu Thr lie Thr Lys lie Leu Gly Lys Arg Thr Ser Glu Glu Arg 50 55 60
Leu Gin lie Val Ser Leu Tyr Lys Gin Lys Tyr Gly Arg Glu Leu Ala 65 70 75 80
His Asp Leu Asp Gly Asp Leu Lys Gly His Phe Arg Asp Cys Thr lie 85 90 95
Leu Leu Thr Glu Asp Pro lie Tyr Leu Met Ala Lys Ser Leu Tyr Tyr 100 105 110
Ala Met Lys Gly Val Gly Thr Asn Glu Asn Thr lie lie Glu lie lie 115 120 125
Val Gly Cys Thr Asn Glu Glu lie Asn Lys Leu !>ys Gin Phe Tyr lie 130 135 140
Tyr Val Leu Arg Asp Lys Gly lie Lys Asp Pro Lys Arg Thr Leu Glu 145 150 155 160Thr Asp lie Arg Thr Glu Thr Thr Gly Tyr Phe Cys Lys Met Leu Leu 165 170 175
Gin Leu Leu Lys Gly Asp lie Pro Asp Pro Thr Pro Glu Gin Leu Arg 180 185 190
Thr lie Gin Gin Lys Gly Gly Asp Leu Met Val Asn Gin Lys Glu Val 195 200 205
Thr Ala Ala Val Lys Gin lie Val Glu Ala Leu Ala Lys Pro Lys Asn 210 215 220
Ser Thr Asn Ser Val Leu Leu Asn Ala Phe Gin His Lys Asn Val Trp 225 230 235 240
Glu lie Ala Ala Met Asp Lys Glu Tyr Lys Lys Ala Ser Gly Lys Gly 245 250 255
Leu lie Ser Ala lie Ser Glu Ala Val Glu Gly Glu Phe Gly Thr Leu 260 265 270
Leu Met Ala Met Val Gin His Ala Val Asp Arg Pro Lys Phe Tyr Ser 275 280 285
Glu Ala Leu Tyr Gin Ser Met Val Gly Gin Gly Thr Arg Asp Phe Leu 290 295 300Leu Met Arg Val Leu lie Leu Arg Ser Glu lie Asp Leu Leu Asp lie 305 310 315 320
Lys Glu Thr Phe Asp Lys Asp His Lys Ser Leu Ala Glu Trp lie Lys 325 330 335
Gly Glu Thr Ser Gly Tyr Tyr Glu Gin Leu Leu Leu Ala Leu Leu Asn 340 345 350
Glu Ser
權(quán)利要求
1、一種預(yù)防和治療治豬囊尾蚴病的DNA疫苗，由真核表達載體pcDNA3.1和豬囊尾蚴抗原基因組成，其特征在于豬囊尾蚴抗原基因是豬囊尾蚴膜聯(lián)蛋白B2基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種預(yù)防和治療治豬囊尾蚴病的DNA疫苗 的制備方法，其特征在于所述的豬囊尾呦膜聯(lián)蛋白B2基因是從六鉤呦 中克隆出來。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種預(yù)防和治療治豬囊尾蚴病的DNA疫苗的 制備方法，其特征在于該方法的具體步驟如下A、 豬帶絳蟲六鉤呦的活化和總RNA的提取及RT-PCR、 PCR擴增 將采自豬帶絳蟲病人的新鮮絳蟲節(jié)片用生理鹽水沖洗，使蟲卵釋放出來，離心漂洗，加入次氯酸鈉至大多數(shù)蟲卵破殼后，加入O. 2mol/L 硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，3000r/min離心除去蟲卵碎片，用生理鹽水懸浮 沉淀，加入含胰酶和豬膽汁的孵化激活液，37T:孵化40分鐘，離心棄 上清液，沉淀即為活化的豬帶絳蟲六鉤呦；將豬帶絳蟲六鉤呦沉淀置 于微型勻漿器中，加入裂解液，用TIANGEN總RNA提取試劑盒，提取 總RNA置于一8(TC保存；以O(shè)ligo dT為引物用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄(具體 步驟見說明書)，以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以弓l物l: 5'-CGGGATCCATGGCAAAAAATACTCGCTCACC-3，禾口引物2: 5'國CCGCTCGAG TTAGGATTCATTCAGTAGTGCG-3'進行PCR擴增，回收1200bp左右的PCR產(chǎn)物；B、 克隆片段的測序?qū)⑸鲜鯬CR回收產(chǎn)物插入pGEM-T載體經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化 DH-5a大腸桿菌，利用藍白斑篩選批出白色陽性克隆，在37'C擴增以 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA進行測序，序列正確，如SEQIDNO: 1所示， 成功克隆出AnxB2基因；C、 pCDNA3.1-AnxB2疫苗構(gòu)建及制備以含目的基因的質(zhì)粒pGEM-T-AnxB2為模板，以上述引物1和引物2進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物膠回收后用SamH I和xhol雙酶切，與 同樣SamH I和xhol雙酶切的pCDNA3.1載體經(jīng)T4連接酶相連，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a，藍白斑篩選獲得陽性重組子，提取質(zhì)粒，BamHI、 xhol酶切和測序鑒定，測序結(jié)果正確，即獲含有重組質(zhì)粒 pCDNA3.1-AnxB2的工程菌DH5a;上述含有重組質(zhì)粒pCDNA3.1-AnxB2的工程菌DH5a，通過細菌 培養(yǎng)、質(zhì)粒擴增、分離純化質(zhì)粒DNA，最終獲得透明澄清的DNA疫 苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是防治豬囊尾蚴病的DNA疫苗及其制備方法。目前囊尾蚴病的治療方案多為常規(guī)藥物治療，療效不太理想，副作用較大，且只能用于感染后治療而不能用于預(yù)防。本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療治豬囊尾蚴病的DNA疫苗，是由真核表達載體pcDNA3.1和豬囊尾蚴抗原基因Anx B2基因構(gòu)成。本發(fā)明還提供了疫苗的制備方法，其中的豬囊尾蚴Anx B2基因是從六鉤蚴中克隆出來。本發(fā)明能有效地誘發(fā)仔豬的免疫應(yīng)答反應(yīng)，說明其對動物的囊尾蚴感染有一定免疫保護作用；本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲存和運輸。
文檔編號A61P33/00GK101524547SQ200810208179
公開日2009年9月9日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者孫樹漢, 毅 張, 娜 王, 王俊杰, 王凱慧, 娜 程, 陸一鳴, 魏玉保 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)