專利名稱：：牛蒡子提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種牛蒡子提取物；此外，本發(fā)明還涉及該牛蒡子提取物的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：目前，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第三大嚴重威脅人類健康的疾病，被WHO列為世界三大頑癥之一。若沒有及時診斷、正規(guī)治療可引起多種慢性并發(fā)癥。據(jù)統(tǒng)計，一半以上的糖尿病患者并發(fā)神經(jīng)病變；約有30%的糖尿病患者并發(fā)增生性視網(wǎng)膜病，其中每年有1.2%可能發(fā)展到失明；30%-40%的I型糖尿病患者和15%-20%的II型糖尿病患者并發(fā)糖尿病腎病(DN)，可由最初出現(xiàn)蛋白尿發(fā)展到高血壓、腎病綜合征等，嚴重者最終導致腎衰和死亡。鑒于糖尿病并發(fā)癥的巨大危害，尋找相應(yīng)的治療藥物具有重大的經(jīng)濟價值和社會意義。多元醇旁路的激活是糖尿病各種慢性并發(fā)癥的發(fā)病機理之一，其中，醛糖還原酶(aldosereductase,AR)起了關(guān)鍵的作用。醛糖還原酶是聚醇代謝通路中的關(guān)鍵限速酶，可以將葡萄糖和半乳糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的還原產(chǎn)物山梨醇和半乳糖醇。當血糖濃度維持在正常的生理水平時，AR并不被激活。在糖尿病發(fā)生時，AR則被激活，促使體內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇，由于山梨醇不易通過細胞膜，所以在胞內(nèi)造成了山梨醇的聚積。目前，大量前沿研究已經(jīng)證實，長期的糖尿病并發(fā)癥如眼部組織疾病、神經(jīng)病變、腎臟病變等，都與體內(nèi)山梨醇的蓄積有關(guān)。牛蒡子為《中國藥典》2000年版一部收載的中藥，原屬于辛涼解表類中藥，具有疏散風熱、宣肺透疹、解毒利咽的功能，用于風熱感冒、咳嗽痰多、麻疹、風疹、咽喉腫痛等癥，用量6-12g/日。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要就解決的技術(shù)問題之一是對牛蒡子原藥材進行加工提取，提出一種牛蒡子提取物，并對其活性部位進行了準確的定位；另外，本發(fā)明還要提出該牛蒡子提取物的制備方法和用途。該牛蒡子提取物具有顯著的醛糖還原酶抑制作用，可用于治療糖尿病并發(fā)癥。本發(fā)明提出的牛蒡子提取物，木脂素類化合物的重量含量為64-90%(紫外分光光度法測定)。優(yōu)選地，該提取物中，牛蒡苷元的重量含量為3-6%(高效液相色譜法測定)，牛蒡苷的重量含量為32-45%(高效液相色譜法測定)，牛蒡苷和牛蒡苷元兩者的總重量含量為35%-51%，其余木脂素類化合物(羅漢松脂素、L即pao1A、L即pao1C、L即pao1F、La卯a(chǎn)o1H和ArctignanE)的重量含量為13%-55%(紫外分光光度法測定)。本發(fā)明提出的牛蒡子提取物的制備方法，包括如下步驟稱取牛蒡子原藥材，粉碎成粗粉，加8倍重量濃度為95%(重量濃度，以下稱3wt%)的乙醇，回流提取2次，每次3h，過濾，合并濾液后，減壓濃縮至無醇味；將所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，下層流浸膏加入濃度為20%(wt%)的乙醇，攪拌，使其充分混懸，再加水稀釋成濃度為20%(wt%)的混懸液，上D101型大孔吸附樹脂柱；用TLC檢查流出液，直至產(chǎn)生與對照樣品色譜相應(yīng)的斑點時停止上樣；先用水洗至水洗液Monish反應(yīng)呈陰性，再依次用重量濃度為30%、50%、75%和95%的乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，每個濃度梯度吸脫4BV，合并重量濃度為50%、75%和95%的乙醇洗脫液，減壓濃縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的條件下真空干燥至恒重，即得。隨后的試驗將證明按上述方法制備的牛蒡子提取物中可檢出牛蒡苷(arctiin)，牛蒡苷兀(arctigenin)，羅漢松月旨素(matairesinol)，LappaolA，LappaolC，LappaolF，L即paolH和ArctignanE8種木脂素類化合物。本發(fā)明所述的牛蒡子提取物，經(jīng)藥理試驗證明，具有顯著的醛糖還原酶抑制作用，可以用于制備防治糖尿病并發(fā)癥的藥物，如糖尿病性白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變和/或糖尿病周圍神經(jīng)病變。圖1為本發(fā)明牛蒡子提取物的UPLC/MS色譜圖。圖2-9為牛蒡子所含8種木脂素類化合物的UPLC/MS色譜圖。圖10為牛蒡苷對照品的HPLC圖譜。圖11為牛蒡子提取物的牛蒡苷含量測定HPLC圖譜。圖12為牛蒡苷元對照品的HPLC圖譜。圖13為牛蒡子提取物的牛蒡苷元含量測定HPLC圖譜。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。實施例1(制備牛蒡子提取物)取牛蒡子原藥材50kg(牛蒡子原藥材購自徐州醫(yī)藥股份有限公司藥材分公司，產(chǎn)地江蘇徐州)，粉碎成粗粉，加400L濃度為95%(wt%)乙醇，回流提取2次，每次3h，過濾，合并濾液后，減壓濃縮至濃縮浸膏無醇味。所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，將其下層流浸膏加20%(wt%)乙醇攪拌，使其充分混懸，再加水稀釋成濃度為20%(wt%)的混懸液，上D皿型大孔吸附樹脂柱。用TLC檢查流出液，至產(chǎn)生與對照樣品色譜相應(yīng)的斑點時停止上樣。先水洗至水洗液Monish反應(yīng)呈陰性，再依次用30%、50%、75%和95%(wt%)的乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，每個濃度梯度洗脫4BV，合并50%、75%和95%的乙醇洗脫液，減壓濃縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的條件下真空干燥至恒重，即得牛蒡子提取物7.5kg。實施例2(牛蒡子提取物的成分鑒別)將實施例1制得的牛蒡子提取物，采用UPLC/MS分析方法，根據(jù)分子量，定性鑒別其所含的化合物，具體操作如下1.儀器Waters公司AcquityUltraPerformance型液相色譜，Waters公司MicromassZQ型質(zhì)譜檢測器，Masslynx色譜工作站，試劑均為色譜純(美國Fisher公司)。2.實驗方法2.l試驗樣品的制備稱取牛蒡子提取物樣品適量，用流動相配制成2mg/ml溶液，備用。2.2.UPLC色譜條件色譜柱AcquityUPLCBEHC-18(1.7iim，2.ImmX50mrn，5iim);流速0.21ml/min;流動相為水-甲醇(6:4);柱溫40°C;檢測波長280nm，進樣量0.5yl。2.3MS條件電噴霧電離源(ESI)，正、負離子檢測，電離電壓2.6kV(+)、2.9kV(-);離子源溫度120°C;錐孔電壓30V;脫溶劑氣溫度300。C(+)、250°C(-);脫溶劑氣(N2)流速:500L/h(+)、600L/h(-)。二極管矩陣檢測器(PDA)與質(zhì)譜串聯(lián)，兩者之間的滯后時間約為O.lmin。3.實驗結(jié)果為了確定牛蒡子提取物中各組分，采用二極管矩陣(PDA)和正、負離子檢測，結(jié)果顯示牛蒡子提取物中存在8種組分(如圖1所示)，各組分的UV最大吸收波長均為280nm，除了牛蒡苷和羅漢松脂素外，各組分的正、負離子檢測方式均能檢出特征離子峰，即M+Na、M-H。根據(jù)其質(zhì)譜特征，確定各組分依次為牛蒡苷、牛蒡苷元、羅漢松脂素、L即pao1A、LappaolC、Lappao1F、Lappao1H、ArctignanE(如圖2-9所不)。實施例3將實施例1制得的牛蒡子提取物，采用紫外分光光度法，以牛蒡苷元為外標，于280nm波長處測定其總木脂素類的含量，相應(yīng)得出該提取物中其他成分的百分含量。具體操作如下1.材料牛蒡苷元對照品購自Sigma公司。2.方法2.l對照品溶液的制備精密稱取牛蒡苷元對照品適量，加甲醇制成每ml含30iig的溶液，即得。2.2供試品溶液的制備稱取實施例1制得的牛蒡子提取物約10mg，精密稱定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液lml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。3.含量測定分別取對照品和供試品溶液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄VA)，在280nm波長處測定吸光度，計算，即得。經(jīng)過對多批樣品的含量測定，實施例1制得的牛蒡子提取物中總木脂素類化合物及牛蒡苷的含量為64%_90%，則其它成分的含量為10%-36%。5實施例4將實施例1制得的牛蒡子提取物，采用高效液相色譜法，以牛蒡苷、牛蒡苷元為外標，通過積分面積比，測定其牛蒡苷元和牛蒡苷的含量。將實施例3中所測得的總木脂素類及牛蒡苷的含量減去本實施例中測得的牛蒡苷元和牛蒡苷的總含量，即得該提取物中其余總木脂素類的含量。具體操作如下1.試齊[J牛蒡苷元對照品(Sigma公司)，牛蒡苷對照品(自制，經(jīng)UV、IR、MS、NMR完成結(jié)構(gòu)鑒定，HPLC含量測定，純度為98.5%)。試劑均為色譜純(美國TEDIA公司)。2.方法2.1色譜條件2.1.1牛蒡苷色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇_水(45:55)為流動相；檢測波長為280nm。理論塔板數(shù)按牛蒡苷峰計算應(yīng)不低于6000。2.1.2牛蒡苷元色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-乙腈-水(20:20:60)為流動相；檢測波長為280nm。理論塔板數(shù)按牛蒡苷元峰計算應(yīng)不低于5000。2.2對照品溶液的制備2.2.1牛蒡苷精密稱取牛蒡苷對照品適量，加甲醇制成每ml含40iig的溶液，即得。2.2.2牛蒡苷元精密稱取牛蒡苷元對照品適量，加甲醇制成每ml含5iig的溶液，即得。2.3供試品溶液的制備稱取實施例1制得的牛蒡子提取物20mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。3.含量測定分別取對照品和供試品溶液，照高效液相色譜法(中國藥典2005年版一部附錄VID)測定牛蒡苷對照品的HPLC圖譜如圖10所示，牛蒡苷元對照品的HPLC圖譜如圖12所示；該提取物中牛蒡苷含量測定的HPLC圖譜如圖ll所示，該提取物中牛蒡苷元含量測定的HPLC圖譜如圖13所示。經(jīng)過對多批樣品的含量測定，測得該提取物中牛蒡苷的含量在32%_45%，牛蒡苷元的含量在3%-6%，牛蒡苷和牛蒡苷元兩者的總含量在35%-51%。根據(jù)實施例3中所測得的總木脂素類及牛蒡苷的含量為64%_90%，減去本實施例中測得的牛蒡苷元和牛蒡苷的總含量35%_51%，即得該提取物中其余總木脂素類的含量為13%-55%。實施例5將實施例1制得的牛蒡子提取物用于進行體外醛糖還原酶抑制實驗，實驗證明，該提取物具有顯著的醛糖還原酶抑制作用。1.材料和方法1.1主要試劑NADPH、DL-苷油醛(sigma公司產(chǎn)品)，2-巰基乙醇(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司化學純)，Li2S04(國藥集團化學試劑有限公司)，酶標儀(BioTekInstruments,Inc，USA)，勻槳機(IKAT10basic)，牛蒡子提取物，磷酸鉀緩沖溶液(0.lM、ph6.2)(磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀國藥集團化學試劑有限公司)，依帕司他片劑(南京金陵制藥有限公司)。1.2鼠醛糖還原酶的提取凍存的大鼠晶狀體4t:解凍，取30只于10ml4°C的磷酸鉀緩沖溶液(0.lM、ph6.2)中勻漿，4°C、4400rpm離心30mins，取上清液，1.5ml/管分裝，-7(TC凍存。整個操作都在4°C以下進行。1.3醛糖還原酶提取物蛋白含量的測定以牛血清白蛋白為標準，用考馬斯亮蘭法，于595nm處測定吸光度(0D)值，由回歸方程計算出AR粗提取物中蛋白含量。1.4體外酶促反應(yīng)體系的建立及酶活性的檢測酶促反應(yīng)在96孔板上進行，整個體系體積為250ul，初定各物質(zhì)濃度為Li2S04400mmol/L，磷酸鉀緩沖溶液0.67mmol/L，2-巰基乙醇5mmol/L，NADPHO.3mmol/L，DL-苷油醛3mmol/L，粗酶提取液50ul。首先將沒有底物的板置于25。C中保溫10分鐘，最后加底物啟動反應(yīng)的進行。用酶標儀340nm下監(jiān)測10min以不含底物的樣品為空白對照，扣除空白對照體系中NADPH自然氧化所造成的吸光度變化。將25t:時吸光度每分鐘變化0.001單位的酶定義為一個酶活性單位。1.5酶促反應(yīng)體系的驗證選擇已上市的醛糖還原酶抑制劑——依帕司他對本反應(yīng)體系進行驗證。在依帕司他濃度一定的條件下，加入不同濃度的底物溶液測定酶活力，而后改變依帕司他的量，得出一系列不同底物濃度條件下的酶活力，繪制1/[S]1/v雙倒數(shù)曲線，確定其抑制類型與文獻對比。1.6醛糖還原酶抑制劑的體外篩選將Li^04、2-巰基乙醇溶于磷酸鉀緩沖溶液(0.1M、ph6.2)中配置成一定濃度的溶液稱之為試劑A，將牛蒡子提取物溶于試劑A并稀釋成6個含量梯度12.5、25、50、100、200、400iig/ml，加入酶促反映體系測定其抑制率。抑制率=(1-加藥后活性/未加藥活性)X100%2.試驗結(jié)果2.1AR粗粗酶蛋白含量的測定AR粗酶蛋白濃度為2.2mg/ml。2.2依帕斯他對酶促反應(yīng)體系的驗證通過依帕司他對AR抑制作用的1/[S]1/v雙倒數(shù)曲線，確定為依帕斯他對AR的抑制作用是反競爭性的，與文獻報道相符，證明此體系的可靠性(見表1)。2.3試驗結(jié)果表1.牛蒡子總木脂素的醛糖還原酶抑制率7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>an=3.試驗結(jié)果表明，本發(fā)明牛蒡子提取物具有顯著的醛糖還原酶抑制活性，當濃度為200iig/mL時，其對醛糖還原酶的抑制活性與已上市的醛糖還原酶抑制劑——依帕司他相似，且其抑制活性表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。眾所周知，多元醇旁路的激活是糖尿病各種慢性并發(fā)癥的發(fā)病機理之一，其中，醛糖還原酶(aldosereductase，AR)起了關(guān)鍵的作用。醛糖還原酶是聚醇代謝通路中的關(guān)鍵限速酶，可以將葡萄糖和半乳糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的還原產(chǎn)物山梨醇和半乳糖醇。當血糖濃度維持在正常的生理水平時，AR并不被激活。在糖尿病發(fā)生時，AR則被激活，促使體內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇，由于山梨醇不易通過細胞膜，所以在胞內(nèi)造成了山梨醇的聚積。目前，大量前沿研究已經(jīng)證實，長期的糖尿病并發(fā)癥如眼部組織疾病、神經(jīng)病變、腎臟病變等，都與體內(nèi)山梨醇的蓄積有關(guān)。故本發(fā)明牛蒡子提取物，可應(yīng)用于制備防治糖尿病并發(fā)癥，如糖尿病性白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變和糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥物。權(quán)利要求一種牛蒡子提取物，其特征在于，木脂素類化合物的含量為64-90％(wt％)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛蒡子提取物，其特征在于，牛蒡苷元的含量為3-6%(wt%)，牛蒡苷的含量為32-45%(wt%)，其余木脂素類化合物的含量為13-55%(wt%)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛蒡子提取物，其特征在于，其余木脂素類化合物為羅漢松月旨素、Lappao1A、Lappao1C、Lappao1F、Lappao1H禾卩ArctignanE。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的牛蒡子提取物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟稱取牛蒡子原藥材，粉碎成粗粉，加8倍重量濃度為95%(wt%)的乙醇，回流提取2次，每次3h，過濾，合并濾液后，減壓濃縮至無醇味；將所得流浸膏靜置至室溫，傾除其上層液態(tài)部分，下層流浸膏加入濃度為20%(wt%)的乙醇，攪拌，使其充分混懸，再加水稀釋成濃度為20%(wt%)的混懸液，上D101型大孔吸附樹脂柱；用TLC檢查流出液，直至產(chǎn)生與對照樣品色譜相應(yīng)的斑點時停止上樣；先用水洗至水洗液Monish反應(yīng)呈陰性，再依次用濃度為30%、50%、75%和95%(wt%)的乙醇洗脫，洗脫流速2BV/h，每個濃度梯度吸脫4BV，合并濃度為50%、75%和95%的乙醇洗脫液，減壓濃縮成流浸膏后，在-0.lMPa、6(TC的條件下真空干燥至恒重，即得。5.權(quán)利要求1或2或3所述的牛蒡子提取物在制備防治糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，糖尿病并發(fā)癥是糖尿病性白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變和/或糖尿病周圍神經(jīng)病變。全文摘要本發(fā)明涉及一種牛蒡子提取物及其制備方法和應(yīng)用，該提取物中總木脂素類化合物的重量含量占64％-90％。其中，牛蒡苷元的重量含量占3％-6％，牛蒡苷的重量含量占32％-45％，其余木脂素類化合物的重量含量占13％-55％。藥理試驗結(jié)果表明，本發(fā)明中的牛蒡子提取物具有較強的醛糖還原酶抑制作用，可以用于制備防治糖尿病并發(fā)癥——如糖尿病性白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變、角膜病變和糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥物。文檔編號A61K36/28GK101766668SQ20081020824公開日2010年7月7日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者馮怡,徐朝暉,賈偉申請人:上海中醫(yī)藥大學