專利名稱：一種重組細(xì)胞分裂素rPFGF的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組細(xì)胞分裂素rPFGF的制備方法
背景技術(shù)：
血小板衍生生長因子(PDGF， Platelet-derived growth factor)是1974年從血小 板中發(fā)現(xiàn)，在損傷早期從血小板a顆粒釋放出來，啟動(dòng)并加速組織創(chuàng)傷修復(fù)。PDGF是陽離 子糖蛋白，相對(duì)分子量約為28 kD-35 kD，等電點(diǎn)為9.8，由A、 B兩條肽鏈通過二硫鍵構(gòu) 成同源或異源的二聚體PDGF-AA、 PDGF-AB、 PDGF-BB。其中BB型式更能促進(jìn)纖維母細(xì)胞 的生長，促進(jìn)與傷口修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞化學(xué)觸覺補(bǔ)強(qiáng)及細(xì)胞增殖，加強(qiáng)肉芽組織的形成，促 進(jìn)傷口愈合并縮短愈合時(shí)間。
目前研究發(fā)現(xiàn)PDGF在損傷修復(fù)過程中起重要作用，具愈傷活性，主要是增加粒狀組 織形成的活性，美國FDA已批準(zhǔn)釀酒酵母(Sacc力aro肝ces cerew'w'ae)表達(dá)的人重組血 小板衍生生長因子(PDGF-BB)的羧甲基纖維素鈉膠(NaCMC)用于遠(yuǎn)端神經(jīng)性糖尿病潰瘍 的治療，及軟組織損傷的治療。
PDGF具有多種生物學(xué)功能，是多種細(xì)胞的強(qiáng)力絲裂原和趨化物。PDGF可促進(jìn)皮膚上 皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝，保護(hù)皮膚及預(yù)防皮膚由于各種原因?qū)е碌膿p傷。PDGF還可以有效地促進(jìn) 皮下膠原細(xì)胞的功能，加速皮膚膠原細(xì)胞的生長，加速細(xì)胞分泌膠原，從而達(dá)到抗皺及延 緩衰老的作用。
成纖維細(xì)胞生長因子(FGF， fibroblast growth factor)指的是一類與調(diào)控細(xì)胞增 殖分化相關(guān)的細(xì)胞因子家族，目前發(fā)現(xiàn)的成員至少有23個(gè)。含有較多酸性氨基酸堿基等 電點(diǎn)為酸性(5.6)，命名為酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acid fibroblast growth factor, aFGF);等電點(diǎn)為堿性(9.6)，稱為堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) 。 aFGF和bFGF在基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等方面有高度同源性，并有極為 相似的生物學(xué)功能，如促血管形成、誘導(dǎo)胚胎發(fā)育、促進(jìn)神經(jīng)生長等功能，但研究表明bFGF 的生物學(xué)活性大約是aFGF的10倍。
現(xiàn)已證明bFGF是一種在體內(nèi)和體外均具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，對(duì)各種來源 于中胚層和神經(jīng)外胚層的細(xì)胞均有明顯的趨化作用，在血管形成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修 復(fù)、促進(jìn)組織再生和神經(jīng)組織生長發(fā)育等過程中起著十分重要的作用。
3畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。該表達(dá)系統(tǒng)不存在如大 腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以去除的問題，也不存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的病毒 和支原體污染等問題；并能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行類似高等真核生物的信號(hào)肽剪切、二硫鍵形 成、糖基化等過程的翻譯后蛋白加工。至今己有多種外源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)。
本發(fā)明將血小板衍生生長因子PDGF-BB，堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF的cDNA進(jìn)行 串聯(lián)拼接，在畢赤酵母菌中高效表達(dá)，獲得表達(dá)量約200mg/L、生物活性穩(wěn)定的重組細(xì)胞 分裂素rPFGF。將該重組細(xì)胞分裂素rPFGF添加于護(hù)膚品中，有促進(jìn)皮膚細(xì)胞新陳代謝， 滋養(yǎng)皮膚的功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能在畢赤酵母菌中高效表達(dá)重組細(xì)胞分裂素rPFGF的方法。 本發(fā)明所提供的表達(dá)重組細(xì)胞分裂素rPFGF的方法，是將上述rPFGF基因插入真核細(xì) 胞表達(dá)載體，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化受體菌，獲得重組蛋白的宿主菌，經(jīng)過隨機(jī)挑選和加壓篩 選，獲得生產(chǎn)菌株G-PFGF2，使重組細(xì)胞分裂素rPFGF在畢赤酵母工程菌乃'cWa paWwls G-PFGF2上清中獲得高表達(dá)。
本發(fā)明所述真核細(xì)胞表達(dá)載體可為pPIC9K等商業(yè)酵母分泌型表達(dá)載體。
所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為pMEX9K。
所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母P/c/n'apaWon's GS115。
所述工程菌為巴斯德畢赤酵母尸/cWaG-PFGF2。
本發(fā)明使重組細(xì)胞分裂素rPFGF在畢赤酵母工程菌尸/c/n'apaWw" G-PFGF2上清中獲 得高表達(dá)。通過離心、過濾等方法除去菌體和大顆粒雜質(zhì)；再通過超濾的方法除去小分子 的色素和鹽，經(jīng)過離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析三步層析純化后，得到純度為 95%以上的rPFGF，比活性為5 X 105IU/mg蛋白。
本發(fā)明制備的重組細(xì)胞分裂素rPFGF將在護(hù)膚品應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。


圖1不同誘導(dǎo)時(shí)間目的蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖。1.誘導(dǎo)24hr時(shí)目的蛋白的表達(dá)；2.誘 導(dǎo)36 hr時(shí)目的蛋白的表達(dá)；3.誘導(dǎo)48 hr時(shí)目的蛋白的表達(dá)；4.誘導(dǎo)60 hr時(shí)目的蛋 白的表達(dá)；M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
圖2 SP S印harose XL柱純化SDS-PAGE圖。1. SP S印harose XL柱上樣前；2. SP S印harose XL柱柱后；3. 20 ramol/L PB洗脫峰；4. 20 mmol/L PB 1 mol/L NaCl洗脫峰；M.低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例中的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實(shí)施例l、重組細(xì)胞分裂素rPFGF cDNA的克隆
1、 總RNA的提取
按Trizol試劑盒(Gibcol公司產(chǎn)品)說明書從人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞中提 取總RNA，作為PDGF-BcDNA的擴(kuò)增模板，RNA1;從人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞中提取總 RNA，作為bFGF cDNA的擴(kuò)增模板，RNA2。
2、 逆轉(zhuǎn)錄PCR
以提取的RNA1為模板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增PDGF的B鏈部分基因。以提取的RNA2為模 板進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增bFGF基因，采用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。同時(shí)引入柔性蛋白1 inker GGGGS
引物序列如下PDGF-up: 5， CCG C7U AAA AGA ACC ATT GCT
GAG CCG GCC A 3，(帶下劃線的堿基為^zo I酶切位點(diǎn)序列)。PDGF-down: 5， TTA GGT CAC AGG CCG GGT GGT GGT GGT AGT (帶下劃線部分為柔性聯(lián)接GGGGS )。 bFGF-up: 5， ATA GAA TTC ATG GCA GCC GGG AGC ATC 3， 。 bFGF-down: 5' G T7U GTC CTC GAG TCA GCT CTT AGC AGA CAT 3 ，(帶下劃線部分為￡coi I酶切位點(diǎn)序列)。
用引物對(duì)PDGF-up與PDGF-down擴(kuò)增PDGF，并將產(chǎn)物純化，用引物對(duì)bFGF-up與 bFGF-down擴(kuò)增bFGF ，并將產(chǎn)物純化。
3、 rPFGF的克隆
將擴(kuò)增的PDGF與bFGF的DNA混在一起作為模板，用引物對(duì)PDGF-up與bFGF-down 擴(kuò)增重組細(xì)胞分裂素序列rPFGF的cDNA，純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽 性菌落，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序無誤的，提取攜帶rPFGF的質(zhì)粒pT-rPFGF，備用。
實(shí)施例2、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
用Wo I及五coi I酶切質(zhì)粒pT-rPFGF，與經(jīng)同樣酶切處理的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆pPIC9pf， &c I及Hpe I酶切pPIC9pf，回收含有 rPFGF的基因片段，與經(jīng)同樣酶切處理的分泌型酵母表達(dá)載體pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a,篩選陽性克隆提取質(zhì)粒，測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒pMEX-rPFGF中的rPFGF序 列正確。
實(shí)施例3、 rPFGF基因在酵母中的高效表達(dá)
提取重組質(zhì)粒pMEX-rPFGF DNA，然后經(jīng)Sac I酶切使之線性化，分離純化后用電轉(zhuǎn)
5化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115。轉(zhuǎn)化后的GS115經(jīng)MD平板篩選得到HIS+重組克隆，將MD 平板上生長的克隆接種YPD--G418平板，置于30'C溫箱培養(yǎng)。將MD平板與不同G418 濃度YPD平板篩選出的重組克隆分別接種于5ml BMGY中，30°C300r/min培養(yǎng)至0D6W)為 2.0 6.0;室溫4 OOOr/min離心4min。收集的菌體用BMMY懸浮并稀釋至OD600為1.0后， 30°C 300r/min誘導(dǎo)。每12h補(bǔ)加甲醇至0.5%。誘導(dǎo)24h、 36h、 48h、 60h后收集培養(yǎng)上清， SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)(圖1)，并測(cè)定其生物活性。選取培養(yǎng)上清中表達(dá)量高的菌株 尸/c/n'fl/Eton's G-PFGF2作為生產(chǎn)菌株。將G6同時(shí)點(diǎn)種于MD、 MM平板，3(TC培養(yǎng)2 3d，確定菌株的Mut表型為Mut+。
實(shí)施例4、 rPFGF蛋白的純化
層析純化方法主要包括離子交換層析、疏水相互作用層析、親和層析以及凝膠過濾層 析等方法。本發(fā)明中，rPFGF分泌表達(dá)在發(fā)酵上清液中，通過離心、過濾等方法除去菌體 和大顆粒雜質(zhì)；再通過超濾的方法除去小分子的色素和鹽，并且濃縮體積，將發(fā)酵液調(diào)整 為合適的緩沖液，利于下步的層析純化。
層析純化的第一步采用陽離子交換介質(zhì)SP Sepharose XL， SP Sepharose XL介質(zhì)具有 高載量，快流速和易處理等特點(diǎn)，能快速有效地將rPFGF從超濾液中捕獲。上樣結(jié)束后， 用含lmol/L的PBS洗脫；第二步，洗脫液加(NH4)2S04至lmol/L，上樣于平衡好的Phenyl Sepharose FF疏水層析柱，20mmol/LPB洗脫目的蛋白；第三步，目的蛋白峰上樣于pH7.2， 20mmol/LPB， 0.15 mmol/LNaCl平衡的Superdex75凝膠過濾柱，收集洗脫峰。
經(jīng)過三步層析純化后，凝膠層析獲得純度高于95%的重組細(xì)胞分裂素rPFGF。
實(shí)施例5、畢赤酵母表達(dá)的rPFGF生物活性檢測(cè)
采用NIH3T3細(xì)胞株/MTT法測(cè)定純化后的rPFGF生物活性，其中NIH3T3細(xì)胞株購自中 國藥品生物制品檢定所，效價(jià)校正參考品為PDGF-BB國際標(biāo)準(zhǔn)品，IS94/728,購自英國 NIBSC。具體方法如下消化和收集NIH3T3細(xì)胞，配成細(xì)胞懸液，接種于96孔板，37'C、 5。/。C02條件下培養(yǎng)18-24h。吸取各孔上清，分別加入梯度稀釋的樣品液和DMSO裂解液， 室溫放置30min后比色，測(cè)定波長510nm處的OD值，按下式計(jì)算rPFGF生物活性:樣品 生物活性-國際標(biāo)準(zhǔn)品生物活性X(樣品稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù))X (樣品關(guān)效稀釋 倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)品半效稀釋倍數(shù))。結(jié)果表明畢赤酵母表達(dá)的rPFGF比活性為5X 105IU/mg。
權(quán)利要求
1、一種重組細(xì)胞分裂素rPFGF的制備方法。其特征在于將血小板衍生生長因子PDGF-BB與堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF基因的cDNA進(jìn)行串聯(lián)拼合，形成重組細(xì)胞分裂素rPFGF基因，以畢赤酵母作表達(dá)系統(tǒng)，將重組細(xì)胞分裂素rPFGF基因插入酵母表達(dá)載體，構(gòu)建成新的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過隨機(jī)挑選和加壓篩選，獲得生產(chǎn)菌株G-PFGF2，使重組細(xì)胞分裂素rPFGF在畢赤酵母工程菌Pichia pastoris G-PFGF2上清中獲得表達(dá)。
2、 含有權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體、宿主菌、工程菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體為pMEX9K。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述重組細(xì)胞分裂素rPFGF基因插入到pMEX9K的Sec I及//pe I酶切位點(diǎn)間。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母尸z'c/n'a / as"to〃i GS115 。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述工程菌為巴斯德畢赤酵母P/c/2/a戸加n、 G隱PFGF2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組細(xì)胞分裂素rPFGF的制備方法。本發(fā)明采用畢赤酵母表達(dá)體系，將血小板衍生生長因子PDGF與堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF拼合基因與表達(dá)載體pMEX9K連接，構(gòu)建成新的表達(dá)質(zhì)粒pMEX-rPFGF，經(jīng)線性化后電轉(zhuǎn)化宿主菌巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris GS 115，經(jīng)過隨機(jī)挑選和加壓篩選，獲得生產(chǎn)菌株G-PFGF2，使重組細(xì)胞分裂素rPFGF在畢赤酵母工程菌Pichiapastoris G-PFGF2上清中獲得表達(dá)。經(jīng)離心、超濾、離子交換層析、疏水層析、凝膠層析獲得純度高于95％的重組細(xì)胞分裂素rPFGF。將該重組細(xì)胞分裂素rPFGF添加于護(hù)膚品中，有促進(jìn)皮膚細(xì)胞新陳代謝，滋養(yǎng)皮膚的功效。
文檔編號(hào)A61K8/30GK101684473SQ200810211379
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者鵬 呂, 紅 周, 曹曉梅 申請(qǐng)人:北京愛柯森倫生物工程科技有限公司