專利名稱：基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及計算機科學、分子生物學、醫(yī)學及微流控芯片技術(shù)。特別提供了一種基
于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥是一種基因性疾病，在基因水平進行診斷和治療是最基本和最準確的方法。 細胞癌變是一個以多種原癌基因的激活和抑癌基因的失活為基礎(chǔ)的過程，因此，在進行基 因診斷時，往往需要對多種基因的表達水平進行綜合的判斷。目前，癌癥的診斷往往是在 體外進行，通過對血液和組織檢驗結(jié)果等進行判斷，還遠遠沒有達到單細胞水平。并且， 體外診斷和體內(nèi)治療是兩個相對獨立的環(huán)節(jié)，抗癌藥物對正常細胞往往也造成較大的損 傷。如何將抗癌藥物特異性的釋放到腫瘤細胞，提高治療的靶向性，是生物醫(yī)學工作者們 致力解決的難題。迄今為止，有多種方法和技術(shù)被應用于藥物的靶向釋放中，如利用病毒 (文獻Cancer Gene Ther即y， 2008， 15， 667-675)、納米顆粒(文獻Gene Ther即y， 2000， 7， 1896-1905)以及微流控芯片(文獻Lab On A Chip, 2006， 6， 1384-1386)等攜帶藥物，但由 于這些體系缺少了 "診斷"這一環(huán)節(jié)，因此還不能做到最為準確的靶向"治療"。
2004年，Sh即iro小組報道了 一種可控制基因表達的生物分子計算機(文獻 Nature, 2004， 429， 423-429)，在試管內(nèi)模擬了微小的DNA計算機進入細胞后，通過多次的 雜交、酶連、酶切反應，對前列腺癌和肺癌多種相關(guān)基因的表達情況依次進行計算，并在診 斷成立時，釋放一條較短的單鏈核酸分子作為藥物進行治療。該計算機首次將診斷和治療 兩個相對獨立的環(huán)節(jié)聯(lián)系起來，并將診斷和治療定位在單細胞水平，提高了藥物釋放的靶 向性，為解決癌癥的靶向治療提供了新的研究方向。但這種DNA計算機如要進一步進行體 內(nèi)試驗尚存在以下幾點不足1、該計算機所有的生化反應是在試管中進行的，DNA計算機 要進入體內(nèi)行使功能，必然需要一種有效的載體攜帶著DNA分子和酶將其傳遞到相應的靶 點，防止DNA分子在計算前就被降解掉，顯然試管不能成為這種有效的載體；2、對多種癌癥 相關(guān)基因表達情況采用依次進行(串聯(lián))的計算方式，并且每計算一種基因需要引入多種 高濃度的外源性分子，有可能會影響到細胞的正常生理功能；3、該計算機的計算原理要求 計算機必須要進入細胞內(nèi)才能行使功能，增強了操作難度；4、最為重要的一點，該計算機采 用限制性內(nèi)切酶(Fokl酶)進行酶切反應，限制性內(nèi)切酶僅存于低等生物內(nèi)(如細菌、病毒 等)，可在特定位點可將雙鏈DNA分子切斷，因此有可能對高等生物的基因組產(chǎn)生影響。綜 上所述，若要將DNA計算機應用于基因診斷和治療中，必須要有更為合理的計算方法和更 為理想的平臺。另外，上述體系中所釋放的為預先已經(jīng)存在的藥物，一種更為靈活的方法為 根據(jù)需要合成治療藥物然后釋放(文獻Nature Biotechnology, 2003， 21， 1184-1191)。
人們期望獲得一種基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設計一種基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法。
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我們使用DNA計算機(優(yōu)選以微流控芯片為載體)，對癌癥相關(guān)的多種基因表達情 況同時進行計算，并于診斷成立時，自動合成完整的自殺基因作為有效的抗癌藥物釋放，而 在診斷不成立時，釋放的僅為無效的片段化的藥物。 我們以乳腺癌為例，在一塊幾平方厘米的微流控芯片上，在體外驗證了該DNA計 算機原理的可行性。模擬了更為微型化的微流控芯片DNA計算機進入體內(nèi)后，無需進入細 胞，可以通過微量的細胞質(zhì)，即可進行基因診斷并治療的過程。計算中采用的分子種類和數(shù) 量均較少，使用的酶為高等生物體內(nèi)存在的DNA連接酶。隨著納米材料和微加工技術(shù)的發(fā) 展，有望開展進一步的體內(nèi)試驗。 DNA計算機是基于DNA分子生化反應的新型生物計算機。具體地說，就是代表一定 信息的DNA分子作為"輸入"，經(jīng)過雜交、變性、酶連、酶解等可控的生化反應進行"計算"，反 應后生成的新的或符合某種要求的DNA分子作為"輸出"。計算過程中往往需要酶的參與， 如限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、外切核酸酶等。 按照DNA計算機的實現(xiàn)方式，DNA計算機經(jīng)歷了試管(文獻Science, 1994,266， 1021-1024)、表面(文獻Nature, 2000， 403， 175-179)和芯片(文獻Lab OnAChip， 2005， 5， 1033-1040)三個階段。將DNA分子固定在表面上的計算方式，可以克服試管中DNA分子易 丟失和操作難、檢測難的特點，但多個計算步驟仍須在人工干預下間斷進行。微流控芯片具 有比表面更為明顯的優(yōu)勢，不僅可將計算用的某種DNA分子以三維立體的方式固定在芯片 的局部，并且具有高度集成化、自動化、小型化、微型化的特點，DNA計算所需的多個生化反 應，均可在一塊微小的芯片上連續(xù)完成。因此芯片有可能取代試管和表面，成為DNA計算機 一種理想的平臺。 與傳統(tǒng)的電子計算機相比，DNA計算機具有并行性高、運算速度快、信息存儲量大 等優(yōu)點，被用于研究解決復雜的數(shù)學難題(文獻ProceedingsOf The National Academy Of Sciences Of The United Stated States OfAmerica，2004， 101，9960-9965)。此夕卜，由于其 具有生物相容性，科學家們力圖將其應用到生命科學領(lǐng)域中，用于癌癥的診斷和治療(文 獻ScientificAmerican， 2006， 294， 44-51)。 本發(fā)明的提供了一種基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特 征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法具體是使用作為運算 介質(zhì)的生物分子，通過生化反應，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達情況進行 計算；當計算結(jié)果符合要求時自動合成并靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；
在上述的計算過程中，所述作為運算介質(zhì)的生物分子具體是DNA分子和/或酶。
所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法使用微流控芯片作為 載體，所述微流控芯片具體分為三個功能單元輸入單元、計算單元和輸出單元；其中，計 算單元布置在輸入單元和輸出單元之間，這三個單元之間液體流路順序聯(lián)接，并在電場作 用下可以形成特定物質(zhì)的定向移動控制； 本發(fā)明所針對的所述抗癌藥物是具有自動合成能力且能夠在條件滿足時靶向釋 放的抗癌藥物。 所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，作為運算介質(zhì)的 DNA分子具體為與每種癌癥相關(guān)基因相對應的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個 缺口的不完整的自殺基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數(shù)量與藥物片段分子的序列和數(shù)量相對應。所述作為運算介質(zhì)的DNA分子中，與每種癌癥相關(guān)基因相對應的計算 分子和藥物片段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。
所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，當被檢測對象中對 應的癌癥相關(guān)基因表達超出正常范圍(升高或降低都會超出正常范圍)時，超出部分的癌 癥相關(guān)基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與計算分子的匹配關(guān)系中置換取代下來， 使原有的計算分子與癌癥相關(guān)基因雜交的結(jié)構(gòu)變?yōu)樾碌母鼮榉€(wěn)定的結(jié)構(gòu)；
當癌癥相關(guān)基因的表達不符合診斷標準時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部 沒有從其與計算分子的匹配關(guān)系中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺 基因分子結(jié)合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。 所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中所述作為運算介質(zhì) 的酶為T4DNA連接酶； 所述藥物片段分子與計算分子在結(jié)構(gòu)上互補，其二者能夠?qū)崿F(xiàn)雜交；具體而言，所
述藥物片段分子與不完整的自殺基因分子上的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接
酶的作用下能夠?qū)⒉煌暾淖詺⒒蛏系娜笨谔钛a，使其形成完整的自殺基因； 相對于藥物片段分子而言，癌癥相關(guān)基因與計算分子互補序列較長，癌癥相關(guān)基
因更易于與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。 當癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳乃幬锲畏肿訌钠渑c計算分子的匹配對應關(guān)系中取代 下來后，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應的目的區(qū)域(其后的輸 出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。
當癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳乃幬锲畏肿訌钠渑c計算分子的匹配對應關(guān)系中取代 下來后，從計算單元傳遞來的藥物片段分子被輸送到特定的目標區(qū)域和不完整的自殺基因 雜交并在T4DNA連接酶的作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補；所述的特定目標區(qū)域 中包含有不完整的自殺基因； 當癌癥相關(guān)基因的表達符合要求(即原癌基因表達升高高于正常限制值并且抑 癌基因表達降低低于正常限制值)時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部 填補，此時即有完整的自殺基因被合成并作為抗癌藥物釋放； 只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有 完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法依據(jù)載體微流控芯片 實施，所述微流控芯片的結(jié)構(gòu)如前所述并可參照附圖2理解。作為載體的微流控芯片，材料 可為石英、玻璃、P匿A、 PC聚合物等； 所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，計算分子固定在作 為載體的微流控芯片的計算單元上；藥物片段分子預先雜交在計算分子上；不完整的自殺 基因和T4DNA連接酶體系預先放置在輸出單元中。 當原癌基因分子或抑癌基因分子這兩類癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳乃幬锲畏肿訌?其與計算分子的匹配對應關(guān)系中取代下來時，被取代下來的藥物片段分子在電場的作用下 靶向釋放到對應的目的區(qū)域(其后的輸出單元)；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接 酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物(當然前提是所有的被取代下來的藥物片段分子 能填補不完整的自殺基因的所有缺口使其能形成真正具有抗癌作用的完整藥物)。
在微流控芯片的輸出單元，從計算單元傳遞來的藥物片段分子和不完整的自殺基 因雜交并在T4DNA連接酶的作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補； 當癌癥相關(guān)基因的表達符合要求(即原癌基因表達升高并且抑癌基因表達降低) 時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補，此時即有完整的自殺基因被 合成并作為抗癌藥物釋放； 只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有 完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
藥物片段分子與不完整的自殺基因上的缺口序列相同，可在T4DNA連接酶的作用 下將缺口填補。分子之間的關(guān)系詳見圖l。 所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，將計算分子固定在 作為載體的微流控芯片的計算單元的具體過程是 將末端修飾有丙烯酰胺基團或氨基基團的計算分子溶解于丙烯酰胺溶液中，終濃 度為5 20 ii m ;經(jīng)紫外曝光后，固定在丙烯酰胺水凝膠中。(固定在水凝膠中的計算分子 可保持活性，可進行雜交、變性等反應。丙烯酰胺水凝膠為一種透明的基質(zhì)，在沒有電場作 用下，可起到閥的作用；在低壓電場作用下，可允許DNA分子通過。) 所述作為載體的微流控芯片中，輸入單元含有多個(根據(jù)實際需要確定可用范 圍，通常的可用范圍是1 300)樣品池，樣品池的數(shù)目依據(jù)診斷的需要而定，不同的癌癥相 關(guān)基因通常分別由不同的樣品池輸入。 所述微流控芯片中的計算單元具體為分別與各個樣品池相連的同等數(shù)量的并行 通道；每個通道里含有與癌癥相關(guān)基因相對應的計算分子和藥物片段分子，分別對不同基 因的表達情況進行計算并傳遞相應藥物片段，不同通道的計算是同時獨立進行的，互不干 擾； 所述微流控芯片中的輸出單元含有一條通道和一個酶連池，酶連池中含有不完整 的自殺基因分子和T4DNA連接酶反應體系；從計算單元不同通道傳遞來的藥物片段分子通 過輸出單元的通道匯集到酶連池中進行酶連反應； 在輸出單元的通道中固定了一段空白水凝膠，它不僅可以起到閥的作用，并且由 于水凝膠有濃縮DNA分子的作用，從計算單元傳遞來的藥物片段分子在此處檢測要比在酶 連池中檢測更為靈敏，參見圖2。 所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法滿足下述兩種要求之 其一，在計算原癌基因表達是否升高并在其升高時能以對應的量取代相應藥物片 段的微流控芯片的計算單元的通道中，固定有兩段水凝膠；第一段水凝膠中僅固定相應的 計算分子；第二段水凝膠中所固定的計算分子上，還預先雜交有相應的藥物片段分子；
當原癌基因分子(即含有癌癥相關(guān)基因的待檢測分子中的一類，另一類待檢測分 子是抑癌基因)在低壓電場作用下，進入第一段水凝膠，和相應的計算分子雜交而被其捕 獲；捕獲的速度與原癌基因分子的濃度呈相關(guān)性； 當基因表達在正常范圍的上限時，經(jīng)過一定時間的電泳，原癌基因恰好走到第一 段水凝膠的另一側(cè)邊緣；而當基因表達升高時，由于雜交的速度更快，經(jīng)過相同時間的電 泳，升高部分的原癌基因可穿過第一段水凝膠，到達其下游，并在電場作用下，進入第二段水凝膠和計算分子雜交，而將相應的藥物片段分子取代下來，取代的量與基因表達升高的
量相對應，取代下來的藥物片段分子在電場的作用下進一步傳遞到輸出單元。 其二，在計算抑癌基因表達是否降低并取代相應藥物片段的微流控芯片的計算單
元的通道中，固定有兩段水凝膠第一段水凝膠中固定相應的計算分子，并預先雜交有相應
的藥物片段分子；第二段水凝膠為空白水凝膠，僅起到閥的作用，不參與計算； 抑癌基因分子在低壓電場作用下，首先進入第一段水凝膠，將相應的藥物片段分
子取代下來(取代的速度與抑癌基因分子的濃度呈相關(guān)性)； 當抑癌基因表達在正常范圍下限時，經(jīng)過一定時間的電泳，抑癌基因恰好走到第 一段水凝膠的另一側(cè)邊緣，將所有的藥物片段分子全部取代下來，被取代下來的藥物片段 分子隨后被棄除；當抑癌基因表達降低時，由于取代速度變慢，經(jīng)過相同時間的電泳，仍有 一部分藥物片段不會被取代下來而保留在水凝膠中，取代下來的部分被棄除。保留在水凝 膠中的部分在改變電泳條件時沖洗下來，這部分的量和基因表達降低的量相對應，在電場 的作用下進一步傳遞到輸出單元。 在作為載體的微流控芯片的輸出單元中，當原癌基因表達升高，抑癌基因表達降 低時被傳遞來的相應的藥物片段，可在不完整的自殺基因分子相應的缺口的位置與之雜 交，并在T4DNA連接酶的作用下將藥物片段分子與不完整的自殺基因之間的縫隙連接上， 將相應的缺口填補。當所有的缺口都被填補時，沒有抗癌活性的不完整的自殺基因分子就 成為完整的自殺基因分子，具有了抗癌活性。 總之，本發(fā)明首次采用微流控芯片作為載體將DNA計算機應用于癌癥的基因診斷 和治療當中，利用微流控芯片高通量的特點，同時計算多種癌癥相關(guān)基因的表達情況(原 癌基因是否升高、抑癌基因是否降低)，在診斷成立時合成并釋放功能性的藥物——完整的 自殺基因，在診斷不成立時，釋放的僅為無功能的藥物片段。該方法與納米技術(shù)和微加工技 術(shù)相結(jié)合，有助于提高癌癥的靶向治療。


下面結(jié)合附圖及實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明 圖1為該DNA計算機的分子之間關(guān)系示意圖； 圖2為該DNA計算機的載體——微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖(含一條計算原癌基因表
達是否升高的通道和一條計算抑癌基因表達是否降低的通道)； 圖3為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之一 ； 圖4為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之二 ； 圖5為計算原癌基因表達是否升高的原理示意圖之三； 圖6為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之一 ； 圖7為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之二 ； 圖8為計算抑癌基因表達是否降低的原理示意圖之三； 圖9為功能性藥物連接示意圖； 圖10為正常范圍上限的原癌基因C-erbB-2在第一段水凝膠中的電泳熒光圖； 圖11為五種不同濃度的原癌基因C-erbB-2的計算結(jié)果圖； 圖12改變電泳條件時藥物片段B被洗脫的電泳熒光 圖13為五種不同濃度的抑癌基因nm23的計算結(jié)果圖； 圖14為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之一 ； 圖15為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之二 ； 圖16為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖制三； 圖17為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之四； 圖18為不同診斷情況下的藥物合成的結(jié)果電泳譜圖之五。
具體實施方式

實施例1 我們以乳腺癌為例，說明基于微流控芯片的自動合成并靶向釋放抗癌藥物的制備 方法的可行性。我們計算了與乳腺癌關(guān)系最為密切的兩種基因，即原癌基因C-erbB-2和抑 癌基因nm23，表達升高和降低的情況，并在兩者表達均符合診斷標準時，合成完整的自殺基 因HSV-tk作為抗癌藥物并將其釋放。 在體外實驗中，我們采用合成的較短的DNA分子來代替較長的原癌基因和抑癌基 因。與原癌基因相對應的為計算分子1和藥物片段A，與抑癌基因相對應的為計算分子2和 藥物片段B。用與藥物片段A和B互補的模板鏈來代替不完整的自殺基因分子。藥物片段 A和B可與模板鏈相結(jié)合，形成雜交雙鏈，并在T4DNA連接酶的作用下連接成完整的雙鏈， 這個完整的雙鏈表示功能性的藥物，如圖9所示。為了便于檢測，在基因分子和藥物片段分 子的末端用熒光基團標記，F(xiàn)AM基團在494nm波長激發(fā)，522nm波長檢測時發(fā)出綠色熒光， TAMRA基團在560nm波長激發(fā)，582nm波長檢測時發(fā)出紅色熒光。藥物片段A和B連接時需 要有磷酸根基團(P04-)的參與。計算分子標記有丙烯酰胺基團(acrylamide-)，可通過共 價鍵固定在丙烯酰胺水凝膠中。分子的序列和修飾的情況詳見表1。
表1為DNA計算機所需分子的核苷酸序列及標記
序列(S ' -3 ')
原癌基因(C-erbB-2)FAM-GGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCAT
計算分子1acrylamide-ATGAGCTGCGGTGCCTGTGGTGGACCATGCCC
藥物片段ATAMRA曙GGGCAGGGTCCAC
抑癌基因(nm23)TAMRA-CTGTGATACAGGAACCATGGCCAACTGTGAGC
計算分子2acrylamide- GCTCACAGTTGGCCATGGTTCCTGTATCACAG
藥物片段BP04 -AGGAACCATGGCCAAC國FAM
藥物模板GTTGGCCATGGTTCCTGTGGACCCTGCCC 本實施例所用載體為微流控芯片，具體如圖2所示是含有兩條并行通道的玻璃 芯片，通道寬200 ii m，深80 ii m，全長(從樣品池1或6到酶連池13)約50mm，通道中固定的每段水凝膠長度均為lmm，液池的直徑為2mm。 將含有10 m計算分子的丙烯酰胺溶液注入通道中，待通道中充滿該溶液時，用 黑色不透明膠布將芯片的其他部分遮蓋住，僅將需要形成水凝膠的通道部分露出，在紫外 燈下曝光5分鐘，暴露的部分就形成了固定有計算分子的水凝膠。將其他部位未形成水凝 膠的丙烯酰胺溶液，通過真空泵從水凝膠兩側(cè)的液池吸走。通過此方法，可在計算原癌基因 是否升高的通道中形成兩段含有計算分子1的水凝膠，在計算抑癌基因是否降低的通道中 形成一段含有計算分子2的水凝膠和一段空白水凝膠(不含任何計算分子)，在輸出單元的 通道內(nèi)形成一段空白水凝膠(不含任何計算分子)。將藥物片段A加入液池4中，在液池4 和5之間施加48v電壓，藥物片段A進入水凝膠中和計算分子1雜交，經(jīng)5分鐘電泳后，雜 交達到飽和，將液池4和5中的剩余液體棄除，同樣可將藥物片段B預先雜交在計算分子2 上，各個緩沖液池中均充入高鹽的緩沖液1 X TE和0. 5M NaCl 。計算的過程在熒光顯微鏡下 檢測。 我們設定l 2ym為基因表達的正常范圍。在計算原癌基因是否升高的通道中， 首先考察正常范圍上限即2ym的原癌基因C-erbB-2到達第一段水凝膠右側(cè)邊緣的時間， 實驗證明為3分鐘，結(jié)果如圖IO所示。因此我們將第一步電泳的時間定為3分鐘?？疾? 種不同濃度的C-erbB-2的計算結(jié)果。不同濃度的C-erbB-2分別從液池1中輸入，在液池1 和3之間施加48v的電壓，電泳時間為3分鐘，然后在液池3和5之間施加48v電壓4分鐘， 再在液池5和13之間施加48v電壓5分鐘，結(jié)果如圖11所示經(jīng)3分鐘電泳，C-erbB-2表 達升高時(5和lOiim)，穿過第一段水凝膠，經(jīng)第二步電泳，進入第二塊水凝膠，取代了藥物 片段A，被取代下來的藥物片段A經(jīng)第三步電泳，經(jīng)過空白水凝膠到達液池13。當C-erbB-2 表達不升高時(l和O. 2iim)，經(jīng)第一步電泳尚未到達第一段水凝膠的右側(cè)邊緣，液池5中不 會出現(xiàn)C-erbB-2，應此不能取代藥物片段A。以上結(jié)果驗證了 ，只有原癌基因表達升高時才 會有相應的藥物片段被傳遞到輸出單元。 如圖12所示，改變電泳條件時，將電壓方向切換，緩沖液由高鹽(IXTE和O. 5M NaCl)改為低鹽(1XTE)后，經(jīng)6分鐘電泳，藥物片段B可全部被沖洗下來。
在計算抑癌基因是否降低的通道中，首先考察正常范圍下限即1 P m的抑癌基因 nm23到達第一段水凝膠右側(cè)邊緣的時間，也就是將藥物片段B全部取代下來的時間，實驗 證明為4分鐘?？疾?種不同濃度nm23的計算結(jié)果。不同濃度的nm23分別從樣品池6中 輸入，在液池6和8之間施加48v的電壓，電泳時間為4分鐘，然后將液池8中的液體棄去， 重新加入緩沖液1 X TE和0. 5M NaCl ，將樣品池6中的液體改為1 X TE，切換液池6和8之 間的電壓方向，電泳6分鐘，然后再經(jīng)第三步電泳(液池8和13之間)，時間為8分鐘。結(jié) 果如圖13所示經(jīng)4分鐘電泳，nm23表達降低時(0. 2和0. 02 y m)，尚未到達第一段水凝膠 的右側(cè)邊緣，不能將藥物片段B完全取代，保留的藥物片段B在改變電泳條件時，經(jīng)第二步 電泳，被沖洗下來，被沖洗下來的藥物片段B經(jīng)過第三步電泳，經(jīng)過兩段空白水凝膠到達液 池13。當nm23表達不降低時(1和0. 2 y m)，經(jīng)第一步電泳藥物片段B被完全取代下來后 并棄除，因此，即使改變電泳條件，也不會有藥物片段B被沖洗下來。以上結(jié)果驗證了，只有 抑癌基因表達降低時才會有相應的藥物片段被傳遞到輸出單元。 在液池13中預先存放有藥物模板和T4DNA連接酶反應體系，在經(jīng)過上下兩條通道 均完成三步電泳后，于室溫下(25t:左右)，在酶連池中進行30分鐘的酶連反應。由于藥物
11片段分子是否連接成完整的雙鏈，僅依靠熒光無法證明，需要通過長度來驗證。因此，酶連 結(jié)果在另一塊十字芯片上，進行芯片電泳，將酶連反應后的不同組分分離后，激光誘導熒光 檢測，電泳譜圖如圖14 18所示。圖中B表示藥物片段B，AB表示藥物片段A和B連接后 的完整的功能性藥物，藥物片段A標記的熒光在本實驗檢測條件下被濾掉，因此檢測不到 藥物片段A的峰。圖14為標準樣品的電泳譜圖；圖15為原癌基因升高、并且抑癌基因降低 時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖；圖16為只有原癌基因升高、抑癌基因表達不降低時藥物合成 結(jié)果的電泳譜圖；圖17為只有抑癌基因表達降低、原癌基因不升高時藥物合成結(jié)果的電泳 譜圖；圖18為原癌基因不升高、并且抑癌基因也不降低時藥物合成結(jié)果的電泳譜圖。從圖 中可以看出，只有原癌基因和抑癌基因表達均符合診斷標準，即診斷成立時，才會有功能性 的藥物合成并釋放，只要有一種不符合診斷標準，即診斷不成立時，沒有功能性的藥物合成 并釋放，釋放的僅為無功能的藥物片段。這說明該DNA計算機有助于癌癥的靶向治療。
實施例2 針對與肝癌相關(guān)的四種基因設計了四種相應的計算分子、藥物片段分子和有四個 缺口的自殺基因分子以及有四條并行通道的微流控芯片。按照與實施例l相同的計算原理 對基因的表達情況進行計算當匪P-9和CD34基因表達升高，同時野生型P53和Rb基因表 達降低時，有相應的藥物片段傳遞到輸出單元，將自殺基因上的缺口填補，形成完整的自殺 基因；當其中任何一種基因表達不符合診斷標準時，則沒有完整的自殺基因形成并釋放。
實施例3 針對與前列腺癌相關(guān)的六種基因設計了六種相應的計算分子、藥物片段分子和有 六個缺口的自殺基因分子以及有六條并行通道的微流控芯片。按照與實施例l相同的計算 原理對基因的表達情況進行計算當PSMA、 Pim-l、 KLKll、 PSA表達升高，同時IGF1和P27 表達降低時，有相應的藥物片段傳遞到輸出單元，將自殺基因上的缺口填補，形成完整的自 殺基因；當其中任何一種基因表達不符合診斷標準時，則沒有完整的自殺基因形成并釋放。
實施例4 一種基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法
本實施例與實施例1內(nèi)容基本相同，其不同之處主要在于 1)我們針對下述與乳腺癌相關(guān)的原癌基因(C-erbB-2、 EGFR、 c-myc、 ras、 int-2、 bcl-2、 BAG-1、 BCSG-2、 survivin)中的至少一種和與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因(P53、 nm23、 PTEN、 Rb、 P16、 P21、 CHEK2、 BRCA1、 BRCA2)中的至少一種作為設計依據(jù)，進行藥物片段分子 的預先設計工作和相應的制備過程。 2)我們針對1)中所選的藥物片段分子設計帶有缺口的不完整的自殺基因分子， 具體為帶有與其所選定的藥物片段分子相對應的相同序列的缺口的雙鏈DNA分子。
3)作為載體的微流控芯片的計算單元以及計算通道根據(jù)上述1) 、2)過程的具體 情況選用，試驗參數(shù)等也與之匹配。
權(quán)利要求
基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法是使用作為運算介質(zhì)的生物分子，通過生化反應，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達情況進行計算；當計算結(jié)果符合要求時自動合成并靶向釋放有效的抗癌藥物完整的自殺基因；在上述的計算過程中，所述作為運算介質(zhì)的生物分子具體是DNA分子和/或酶；所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法以微流控芯片為載體，所述微流控芯片具體分為三個功能單元輸入單元、計算單元和輸出單元；其中，計算單元布置在輸入單元和輸出單元之間，這三個單元之間液體流路順序聯(lián)接，并在電場作用下可以形成特定物質(zhì)的定向移動控制。
2. 按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，作為運算介質(zhì)的DNA分子具體為與每種癌癥相關(guān)基因相對應的計算分子和藥物片段分子，以及帶有多個缺口的不完整的自殺基因分子；所述自殺基因分子上缺口的序列和數(shù)量與藥物片段分子的序列和數(shù)量相對應。
3. 按照權(quán)利要求2所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述作為運算介質(zhì)的DNA分子中，與每種癌癥相關(guān)基因相對應的計算分子和藥物片段分子為單鏈DNA分子，帶有缺口的不完整的自殺基因分子為雙鏈DNA分子。
4. 按照權(quán)利要求3所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，當被檢測對象中對應的癌癥相關(guān)基因表達超出正常范圍時，超出部分的癌癥相關(guān)基因可將全部或部分的藥物片段分子從其與計算分子的匹配關(guān)系中置換取代下來，使原有的計算分子與癌癥相關(guān)基因雜交的結(jié)構(gòu)變?yōu)樾碌母鼮榉€(wěn)定的結(jié)構(gòu)；當癌癥相關(guān)基因的表達不符合診斷標準時，亦即藥物片段分子中的部分或者全部沒有從其與計算分子的匹配關(guān)系中被置換取代下來時，就不能與帶有缺口的不完整的自殺基因分子結(jié)合形成完整的自殺基因分子從而具有抗癌作用。
5. 按照權(quán)利要求4所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中所述作為運算介質(zhì)的酶為T4DNA連接酶；所述藥物片段分子與計算分子在結(jié)構(gòu)上互補，其二者能夠?qū)崿F(xiàn)雜交；具體而言，所述藥物片段分子與不完整的自殺基因分子上的缺口序列相同；藥物片段分子在T4DNA連接酶的作用下能夠?qū)⒉煌暾淖詺⒒蛏系娜笨谔钛a，使其形成完整的自殺基因；相對于藥物片段分子而言，癌癥相關(guān)基因與計算分子互補序列較長，癌癥相關(guān)基因更易于與計算分子雜交而將藥物片段分子取代下來。
6. 按照權(quán)利要求5所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于當癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳乃幬锲畏肿訌钠渑c計算分子的匹配對應關(guān)系中取代下來后，被取代下來的藥物片段分子在電場作用下靶向釋放到對應的目的區(qū)域；從而與不完整的自殺基因在T4DNA連接酶體系中合成具有抗癌作用的完整藥物。
7. 按照權(quán)利要求6所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于當癌癥相關(guān)基因?qū)⑾鄳乃幬锲畏肿訌钠渑c計算分子的匹配對應關(guān)系中取代下來后，藥物片段分子被輸送到特定的目標區(qū)域和不完整的自殺基因雜交并在T4DNA連接酶的作用下進行酶連反應，將相應的缺口填補；所述的特定目標區(qū)域中包含有不完整的自殺基因；當癌癥相關(guān)基因的表達符合要求時，相應的藥物片段將不完整的自殺基因上的缺口全部填補，此時即有完整的自殺基因被合成并作為抗癌藥物釋放；只要有一種基因表達不符合診斷標準，缺口就不會被完全填補，對應地就不能有完整的自殺基因被合成，釋放的僅為沒有抗癌作用的不完整的自殺基因。
8. 按照權(quán)利要求1 7其中之一所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法中，計算分子固定在作為載體的微流控芯片的計算單元上；藥物片段分子預先雜交在計算分子上；不完整的自殺基因和T4DNA連接酶體系預先放置在輸出單元中。
9. 按照權(quán)利要求8所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于將計算分子固定在作為載體的微流控芯片的計算單元的具體過程是將末端修飾有丙烯酰胺基團或氨基基團的計算分子溶解于丙烯酰胺溶液中，終濃度為5 20 ii m ;經(jīng)紫外曝光后，固定在丙烯酰胺水凝膠中；所述作為載體的微流控芯片中，輸入單元含有1 300個樣品池，不同的癌癥相關(guān)基因分別由不同的樣品池輸入；所述微流控芯片中的計算單元具體為分別與各個樣品池相連的同等數(shù)量的并行通道；每個通道里含有與癌癥相關(guān)基因相對應的計算分子和藥物片段分子，分別對不同基因的表達情況進行計算并傳遞相應藥物片段，不同通道的計算是同時獨立進行的，互不干擾；所述微流控芯片中的輸出單元含有一條通道和一個酶連池，酶連池中含有不完整的自殺基因分子和T4DNA連接酶反應體系；從計算單元不同通道傳遞來的藥物片段分子通過輸出單元的通道匯集到酶連池中進行酶連反應；在輸出單元的通道中固定了一段空白水凝膠，它不僅可以起到閥的作用，并且由于水凝膠有濃縮DNA分子的作用，從計算單元傳遞來的藥物片段分子在此處檢測要比在酶連池中檢測更為靈敏。
10. 按照權(quán)利要求9所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，其特征在于所述基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法還滿足下述兩種要求之其一，在計算原癌基因表達是否升高并在其升高時能以對應的量取代相應藥物片段的微流控芯片的計算單元的通道中，固定有兩段水凝膠；第一段水凝膠中僅固定相應的計算分子；第二段水凝膠中所固定的計算分子上，還預先雜交有相應的藥物片段分子；當原癌基因分子在低壓電場作用下，進入第一段水凝膠，和相應的計算分子雜交而被其捕獲；捕獲的速度與原癌基因分子的濃度呈相關(guān)性；當基因表達在正常范圍的上限時，經(jīng)過一定時間的電泳，原癌基因恰好走到第一段水凝膠的另一側(cè)邊緣；而當基因表達升高時，由于雜交的速度更快，經(jīng)過相同時間的電泳，升高部分的原癌基因可穿過第一段水凝膠，到達其下游，并在電場作用下，進入第二段水凝膠和計算分子雜交，而將相應的藥物片段分子取代下來，取代的量與基因表達升高的量相對 應，取代下來的藥物片段分子在電場的作用下進一步傳遞到輸出單元。其二，在計算抑癌基因表達是否降低并取代相應藥物片段的微流控芯片的計算單元的 通道中，固定有兩段水凝膠第一段水凝膠中固定相應的計算分子，并預先雜交有相應的藥 物片段分子；第二段水凝膠為空白水凝膠，僅起到閥的作用，不參與計算；抑癌基因分子在低壓電場作用下，首先進入第一段水凝膠，將相應的藥物片段分子取 代下來；當抑癌基因表達在正常范圍下限時，經(jīng)過一定時間的電泳，抑癌基因恰好走到第一段 水凝膠的另一側(cè)邊緣，將所有的藥物片段分子全部取代下來，被取代下來的藥物片段分子 隨后被棄除；當抑癌基因表達降低時，由于取代速度變慢，經(jīng)過相同時間的電泳，仍有一部 分藥物片段不會被取代下來而保留在水凝膠中，取代下來的部分被棄除。保留在水凝膠中 的部分在改變電泳條件時被沖洗下來，這部分的量和基因表達降低的量相對應，在電場的 作用下進一步傳遞到輸出單元。
全文摘要
基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法使用作為運算介質(zhì)的生物分子，通過生化反應，對與癌癥相關(guān)的各種基因之一或其組合的表達情況進行計算；計算結(jié)果符合要求時自動合成并靶向釋放抗癌藥物完整的自殺基因。作為運算介質(zhì)的生物分子是DNA分子和/或酶；所述制備方法的載體為微流控芯片具體分為輸入單元、計算單元和輸出單元共三個功能單元；三個單元之間液體流路順序聯(lián)接，并在電場作用下可以形成特定物質(zhì)的定向移動控制。本發(fā)明首次提出一種基于微流控芯片的能自動合成的抗癌藥物的制備方法，在條件成立時合成并釋放功能性的藥物完整的自殺基因。該方法與納米技術(shù)和微加工技術(shù)相結(jié)合，有助于提高癌癥的靶向治療。
文檔編號A61P35/00GK101745122SQ20081022939
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者于浩, 張宇, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所