專利名稱：一株兼性厭氧海洋紅細(xì)菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株兼性厭氧海洋光合細(xì)菌，特別是該種海洋菌株培養(yǎng)物的活 性提取物及其制法和該提取物在抗細(xì)菌藥物方面的用途。
背景技術(shù)：
海洋微生物來源的新藥開發(fā)是二十一世紀(jì)世界范圍的研究熱點(diǎn)問題，以其 新菌種來源、產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)活性物質(zhì)、克服傳統(tǒng)抗生素耐藥性以及實(shí)現(xiàn)資源可持 續(xù)等特點(diǎn)而為人們所普遍關(guān)注。目前已經(jīng)從各類海洋微生物中分離到許多結(jié)構(gòu) 新穎的抗細(xì)菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗腫瘤抗生素以及一些 抗炎癥和鎮(zhèn)痛的活性物質(zhì)、酶抑制劑等。海洋中存在一類兼性厭氧的微生物-光合細(xì)菌，這類微生物在自身代謝過程中能夠分解低分子有機(jī)物，在地球化學(xué) 循環(huán)中起著極為重要的作用。至今尚未見有報(bào)道從兼性海洋光合細(xì)菌類群中分 離提取到具有藥理活性的次生代謝產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種光合細(xì)菌海洋菌株培養(yǎng)液的活性提取物。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了該活性提取物的分離方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供了該活性提取物在制備抗細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及的一株兼性厭氧海洋細(xì)菌PSB-01是從中國(guó)渤海海域的海洋底 泥中分離獲得。該菌株合適的生長(zhǎng)鹽濃度范圍為0.5% 5.0%;對(duì)熒光假單胞菌、 銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抗性。依據(jù)《Bergy，s manual of systematical bacteriology》(vol. 3. The Williams and wilkins Co. Baltimore. 1984， 28 29)，經(jīng)鑒定為海洋紅細(xì)菌朋oG^W"歷歷ari，瓜己于2008年10月30日保 藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(其簡(jiǎn)稱為CGMCC)， 保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)為 CGMCC No. 2731。
海洋菌株P(guān)SB-01具有下述性質(zhì)菌株細(xì)胞呈短桿狀，菌體大小為0.3pm 0.6|imxl.0^im 1.2^im，革蘭氏染色為陰性，兼性厭氧，胞內(nèi)含菌綠素a和類胡 蘿卜素。最佳生長(zhǎng)溫度范圍26 30。C，最佳生長(zhǎng)pH為6.8 7.0。對(duì)有機(jī)碳源的 利用情況如下在(1)乙酸鹽，(2)丙酮酸鹽，(3)蘋果酸鹽等條件下生長(zhǎng) 良好。
海洋菌株P(guān)SB-01的16SrDNA序列(1249bp)己向美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中 心(NCBI)的GenBank基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)提交，登陸號(hào)為EU910275。其全序列扭 下ACCATGGG
這種海洋菌株P(guān)SB-Ol可以利用常規(guī)的液體培養(yǎng)方式，可使培養(yǎng)基中含有 用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其他營(yíng)養(yǎng)源。對(duì)溫度、時(shí)間等培養(yǎng)條件并無(wú)嚴(yán) 格的限制，以適宜于PSB-01海洋菌株生長(zhǎng)為準(zhǔn)，并以選擇使培養(yǎng)物的活性提 取物的收率最高的條件為好。當(dāng)然這些培養(yǎng)基的組分、氫離子的濃度、培養(yǎng)溫 度、攪拌條件等均應(yīng)根據(jù)所使用的菌株種類及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，并 獲得最好的效果。由以上所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當(dāng)?shù)姆椒ň湍芴崛∑?中的活性組分，這些方法是常用于提取代謝物的方法，例如可利用活性提取物 與其它雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行提 取，這些方法可以單獨(dú)使用，也可以適當(dāng)配合或反復(fù)使用。其中，以如下培養(yǎng) 基、培養(yǎng)方法和提取方法來培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-Ol產(chǎn)生抗生素最佳 液體培養(yǎng)基為
蛋白胨 2.5g;
2.5g;
1000 ml;
人工海水配方:
人工海水(或陳海水)
調(diào)節(jié)pH為6.8~7.0。
NaCl
Na2S04
KC1
NaHC03 KBr H3B03 NaF
1.0mol/LMgCl2溶液 1.0 mol/1 CaCl2溶液 0.1 mol/L Sr02溶液
25.0g;
4.0g;
0.7g;
0.20g;
0.10g;
0.03g;
O細(xì)g;
53 mL; 10mL; 0.90 ml;
蒸餾水1000 ml，調(diào)節(jié)pH為6.8 7.0。A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-Ol，并用無(wú)菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 3(TC下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時(shí)間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5~10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-01菌液，于26 3(TC恒溫培 養(yǎng)10~15天；
C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 'C減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠
薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄層層 析生物自顯影活性測(cè)試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層 板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲垸甲醇=2:
1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用Ci8反相柱， 用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100% 甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰 組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
本發(fā)明中從海洋菌株P(guān)SB-01中提取得到的活性提取物，通過抗菌模型篩選， 采用瓊月旨稀釋法(National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Approved standard: M2 A7， 7th ed. NCCLS， Wayne, Pa.)測(cè)定對(duì)熒光假單胞菌、 銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實(shí)其培養(yǎng)液的乙酸乙 酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性乙酸乙酯相中制備出的活性組分抗 熒光假單胞菌的MIC值為0.83 pg/mL;抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.70 iug/mL; 抗表皮葡萄球菌的MIC值為0.97 pg/mL;抗枯草芽孢桿菌的MIC值為0.68 ng/mL; 正丁醇相中制備出的活性組分抗熒光假單胞菌的MIC值為0.90 |Lig/mL;抗銅綠假 單胞菌的MIC值為0.81 |ig/mL;抗表皮葡萄球菌的MIC值為1.38pg/mL;抗枯草 芽孢桿菌的MIC值為0.83 pg/mL。利用本發(fā)明的活性提取物中的有效組分，可以用于制備抗菌的藥物。 以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.液體培養(yǎng)基為
蛋白胨 2.5g;
酵母膏 2.5g; 人工海水(或陳海水) 1000 ml;
調(diào)節(jié)pH為6.8 7.0。
人工海水配方
NaCl 25.0g; Na2S04 4.0g; KC1 0.7g; NaHC03 0.20g; KBr 0.10g; H3B03 0.03g; NaF O扁g; 1.0mol/LMgCl2溶液 53 mL;
1.0mol/lCaCl2溶液 10 mL;
0.1 mol/L Sr02溶液 0.90 ml;
蒸餾水1000 ml,調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。
A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-01 ，并用無(wú)菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 30'C下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時(shí)間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5~10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-01菌液，于26 30'C恒溫培
養(yǎng)10 15天；C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50。C減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50
'c減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠 薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄層層 析生物自顯影活性測(cè)試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層 板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲醇=2: 1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用ds反相柱，
用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100% 甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰 組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。 實(shí)施例2.液體培養(yǎng)基為
NaCl 酵母膏 丁二酸鈉 KH2P04 MgS04 7H20 NH4C1
CaCl2 2H20 檸檬酸鐵(0.1%) SL~6
無(wú)水乙醇
調(diào)節(jié)pH為6.8 士 0.2。 其中SL 6為微量元素溶液，配方為: H3B03 CoCl2.6H20 ZnS04.7H20 MnCl2'4H20
30.4 g;
1.0 g;
1.0 g;
0.5 g;
3.0 g;
0.4 g; 0.05 g; 5.0 mL; 1.0 mL; 0.5 mL;
0.3 g;
0.2 g;
0.1 g; 0.0!3 gNaMo04.2H20
NiCl2.6H20
CuCl22H20
蒸餾水
用HCl調(diào)節(jié)pH為3.4。
100 mL;
0.03 g; 0.02 g; 0.01 g;
A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105Mpa滅菌20min;冷卻后 接種海洋菌株P(guān)SB-Ol，并用無(wú)菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶于 28 3(TC下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光源 距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時(shí)間為7 10天；
B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5 10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-01菌液，于26 3(TC恒溫培
養(yǎng)10 15天；
C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 "C減壓蒸干，得兩份干固體。
D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠
薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄層層 析生物自顯影活性測(cè)試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層 板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲醇=2:
1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用d8反相柱， 用體積濃度為5~100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100% 甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰 組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。 實(shí)施例3.活性組分活性測(cè)定結(jié)果
采用瓊脂稀釋法(National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Approved standard: M2 A7， 7th ed. NCCLS, Wayne, Pa.)測(cè)定對(duì)熒光假單胞菌、 銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的MIC值，證實(shí)其培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相均具有抗菌活性乙酸乙酯相中制備出的活性組分抗
熒光假單胞菌的MIC值為0.83 pg/mL;抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.70 pg/mL;抗表皮葡萄球菌的MIC值為0.97 pg/mL;抗枯草芽孢桿菌的MIC值為0.68 pg/mL;正丁醇相中制備出的活性組分抗熒光假單胞菌的MIC值為0.90 )Lig/mL;抗銅綠假單胞菌的MIC值為0.81 pg/mL;抗表皮葡萄球菌的MIC值為1.38pg/mL;抗枯草芽孢桿菌的MIC值為0.83 pg/mL。序列表
SEQUENCE LISTING
<110>大連交通大學(xué)
<120> —株兼性厭氧海洋紅細(xì)菌的活性提取物及其制法和用途<160> 1
< 170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 1239<212> DNA
<213> 海洋菌株P(guān)SB-01的16S rDNA序列<400> 1
cgcgtgggaa tctacccagt ggtacgggat aacccgagga aactcgagct aataccgtat 60acgcccttcg ggggaaagat ttattgccat tggatgagcc cgcgtcggat tagcttgttg 120gtggggtaac ggcctaccaa ggcaacgatc cgtagctggt ctgagaggat gatcagccac 180actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tcttggacaa 240tgggggaaac cctgatccag ccatgccgcg tgagtgaaga aggccctagg gttgtaaagc 300tctttcagcg gggaagataa tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta acttcgtgcc 360agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgcg 420cgtaggcgga ttgttaagtc aggggtgaaa teccagagct caactctgga actgcctctg 480atactggcaa tctcgagtcc ggaagaggtt ggtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc 540gtagatattc ggaggaacac cagaggcgaa ggcggccaac tggtccgaga ctgacgctga 600ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 660tggatgctag ccgttggtgg gtatactcat cagtggcgca gctaacgcat taagcatccc 720gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 780<formula>formula see original document page 12</formula>
權(quán)利要求
1. 一株兼性厭氧海洋紅細(xì)菌PSB-01CGMCC No.2731培養(yǎng)液的活性提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的海洋菌株P(guān)SB-01培養(yǎng)液的活性提取物，其特征 在于為乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物；對(duì)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、表 皮葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抗性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海洋菌株P(guān)SB-01培養(yǎng)液的活性提取物的制備方 法，其特征在于包括下列步驟A. 種子培養(yǎng)將液體培養(yǎng)基灌裝到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血 清瓶蓋微旋緊以利透氣，于高壓消毒器中121、 0.105 Mpa滅菌20 min;冷卻 后接種海洋菌株P(guān)SB-01 ，并用無(wú)菌培養(yǎng)基補(bǔ)滿，瓶蓋旋緊不透氣；將血清瓶 于28 3(TC下恒溫光照培養(yǎng)，采用白熾燈作光源，功率為15W 40W為宜，光 源距離培養(yǎng)容器20厘米 30厘米，兩側(cè)安置。培養(yǎng)時(shí)間為7 10天；B. 擴(kuò)大培養(yǎng)按體積比5 10%的種子培養(yǎng)液接種，利用密封培養(yǎng)容器， 采取類同種子培養(yǎng)的過程大量培養(yǎng)海洋菌株P(guān)SB-01菌液，于26 3(TC恒溫培養(yǎng)10-15天；所述種子培養(yǎng)和擴(kuò)大培養(yǎng)中，液體培養(yǎng)基為蛋白胨 2.5g;2.5g; 1000 ml;人工海水配方人工海水(或陳海水) 調(diào)節(jié)pH為6.8~7.0。NaClNa2S04KC1NaHC03KBrH3B0325.0g; 4.0g;0.7g;0.20g;O.lOg; 0.03g;；1.0 mol/L MgCl2溶液 53 mL; 1.0mol/lCaCl2溶液 10mL; 0.1 mol/L Sr02溶液 0.90 ml;蒸餾水1000 ml，調(diào)節(jié)pH為6.8-7.0。C. 提取將完成擴(kuò)大培養(yǎng)過程的菌液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于5(TC減壓濃縮至原 體積的十分之一，濃縮液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯連續(xù)抽提3次，抽提 后的水相再用等體積的正丁醇連續(xù)抽提3次，提取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50 。C減壓蒸干，得兩份干固體。D. 提純將以上兩份干固體分別滴加少量甲醇溶解，點(diǎn)樣于分析型硅膠薄層板上，選用體積比為二氯甲垸甲醇=10: 1的展開劑展開，采用薄層層析生物自顯影活性測(cè)試法追蹤活性斑點(diǎn)。再將樣品分別點(diǎn)樣于制備型硅膠薄層板，用上述展開劑展開，將活性條帶刮下，分別用體積比為二氯甲烷甲醇=2:1的混合溶劑洗脫。洗脫相蒸干后通過HPLC進(jìn)一步純化，使用Ci8反相柱， 用體積濃度為5 100%的甲醇水作為流動(dòng)相，進(jìn)行30分鐘梯度洗脫，再用100% 甲醇洗脫20分鐘，檢測(cè)254nm紫外吸收，通過逐步活性追蹤，制備出活性峰 組分，將含活性組分的洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得兩份油狀物。
4.權(quán)利要求1或2所述的海洋菌株P(guān)SB-01培養(yǎng)液的活性提取物在制備抗 細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一株兼性厭氧活性海洋紅細(xì)菌、該菌株培養(yǎng)物的活性提取物及其制法，以及該提取物在抗菌藥物方面的應(yīng)用價(jià)值。一株從中國(guó)渤海分離獲得的海洋菌株P(guān)SB-01，鑒定為海洋紅細(xì)菌Rhodobium marinum，其乙酸乙酯提取相和正丁醇提取相經(jīng)硅膠薄層層析和反相高效液相分離，得到兩個(gè)有效部分的油狀物，對(duì)熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌有抗性，具有作為抗菌藥物的潛在用途。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101455687SQ20081022946
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月8日
發(fā)明者翼 張, 朱秀華, 軍 穆, 董學(xué)偉, 趙友寶, 顧曉潔 申請(qǐng)人:大連交通大學(xué)