專(zhuān)利名稱(chēng)：一種木脂素類(lèi)化合物及其制備方法、鑒定方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及木脂素類(lèi)化合物，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種從五味子 中分離出的新穎的木脂素類(lèi)化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述化合物的鑒 定方法、制備方法及其在藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
五味子科(5fe/H'^m/raeeae)植物全世界共有50種，分布于亞洲東南部和 北美東南部。我國(guó)約29種，主產(chǎn)于西南部和中南部。五味子科包括兩個(gè)屬， 即五味子屬(5fe/H'^w/ra)和南五味子屬(《^&Mra)。中國(guó)藥典中記載的五味子 和南五味子分別為五味子屬的五味子《S. c/^era&(rwrcz.)萬(wàn)m7/.和華中五味 子5". ^;^wa"f/;era7 e;^ W附h.的果實(shí)，是傳統(tǒng)的滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥，具收斂固 澀、益氣生津,補(bǔ)益寧心之功效。本草考證，五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》 列為上品。《圖經(jīng)本草》記載"五味皮肉甘甜，核中辛苦，都有咸味，此 則五味俱也。"故名五味子， 一直沿用至今。木脂素是五味子科植物中的主 要生物活性成分，結(jié)構(gòu)類(lèi)型多，立體化學(xué)復(fù)雜。
迄今為止從該科植物中分離得到的木脂素有近200個(gè)，根據(jù)骨架類(lèi)型 可分為五大類(lèi)I .聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)(dibenzocyclooctadinenes)， II.螺苯并呋喃型 聯(lián)苯環(huán)辛烯類(lèi)(spirobenzofliranoid dibenzocyclooctadienes) ， III.芳基四氫萘類(lèi) (aryltetralins) ， IV. 二芳基丁烷類(lèi) (diaiylbutanes) ， V.四氬吹喃類(lèi) (tetrahydroforans)。它們大多具有抑制中樞神經(jīng)，降低血清轉(zhuǎn)氨酶，抗癌， 抗HIV，抗胃潰瘍，抗過(guò)氧化等作用。而近年來(lái)開(kāi)發(fā)新藥的一個(gè)主要的途 徑就是從傳統(tǒng)藥物中尋找活性成分，并根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行人工合成或以 此為先導(dǎo)物合成一系列衍生物，從中找出有效的藥物。治療肝炎藥物聯(lián)苯 雙酯就是在研究五味子有效成分化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，進(jìn)行人工合成中產(chǎn)生的。 然而傳統(tǒng)的分離方法有出層析法、后來(lái)發(fā)展到釆用柱層析和中壓液相色譜結(jié)合的方法，它們存在者消耗試劑量大，很難提純化合物，消耗時(shí)間長(zhǎng)等 缺點(diǎn)，并且這些方法很難分離出新化合物，就算發(fā)現(xiàn)了效率也是非常低。 這是本技術(shù)領(lǐng)域中一個(gè)長(zhǎng)期存在的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種木脂素類(lèi)新的化合物。 本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供所述新化合物的制備方法與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定 方法。同時(shí)，本發(fā)明目的還在于對(duì)所述化合物的藥物活性進(jìn)行研究，以期
尋找抗腫瘤或抗HIV活性強(qiáng)的化合物。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
A.本發(fā)明提供了一種新的木脂素類(lèi)化合物，該化合物用下述通式(I ) 表不
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(I)
其中1，2，3，4,5,6,7,8,9，10，11，12，13,14，15，16,17,18分別表示C1,C2， C3，C4，C5， C6,C7，C5， C8,C9，C10, C11，C12，C13， C14，C15， C16，C17,C18 。
B.本發(fā)明提供了一種所述化合物的制備方法，該方法包括下述步驟 l.以鶴慶狹葉五味子(S. w&o"/a"a )為原料，將五味子果實(shí)粉末用 乙酸乙酯浸提三次，每次5天，期間每隔3小時(shí)超聲一次， 一次l小時(shí)；合并提取液減壓蒸餾至浸膏，浸膏用它體積的 一半的氯仿溶解與硅膠拌樣，
攪拌均勻后將溶劑揮干，碾磨均勻；
2. 用硅膠干法填充層析柱，用氯仿:丙酮(1:0~0:1)梯度洗脫，收集 各部份洗脫液；
3. 將洗脫液用高效液相色譜法分離純化，根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰收集目
標(biāo)級(jí)分；
4. 目標(biāo)級(jí)分濃縮干燥后即可得到所需的化合物單體。
其中，在步驟(2)中所用的硅膠規(guī)格是200~300目；步驟(3)中的 洗脫液選擇9:1和8:2部分。
C.本發(fā)明提供了一種對(duì)所述化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的方法，該方法包 括以下步驟
1. 本發(fā)明制備得到的白色粉末，["]^-5.44。 ， EIMS顯示分子離子峰 m/z404結(jié)合NMR譜，確定分子式為C22H2807，并經(jīng)髙分辨ESIMS譜([M+Na]+， m/z427)證實(shí)不飽和度為9;
2. HPLC-UV在240.8具有聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素的特征吸收，IR (KBr) 光譜顯示存在羥基(3347cm")，芳環(huán)和雙鍵(1640， 1600， 1500cm" )， 'H 和"CNMR譜說(shuō)明分子中有兩個(gè)苯環(huán)，4個(gè)甲氧基(Sc135.9， 135.8, 135.6， 135.4), 2個(gè)甲基(5h0.73, 3H， d, 1.38,3H, s), —個(gè)季碳(Sc 72.8), 一個(gè)次甲基(5C41.79)，兩個(gè)亞甲基(Sc39.2， 34.2)和兩個(gè)羥基;
3. 與已知的木脂素類(lèi)化合物波譜數(shù)據(jù)比較確定該化合物為聯(lián)苯環(huán)辛烯 木脂素，經(jīng)HMBC譜H-17與C-6、 C-7和C-8相關(guān)，H-18與C-7、 C-8 和C-9相關(guān)，兩個(gè)羥基氫分別與C- 11、 C誦12、 C-13和C-6、 C-7、 C-8 相關(guān)說(shuō)明兩個(gè)甲基分別位于G-7、 C-8上，兩個(gè)羥基分別位于C-12、 C-7 上；
4. CD譜在250nrn處有很強(qiáng)的負(fù)Cotton效應(yīng)，結(jié)合ROESY和COSY
確定化合物的聯(lián)苯為M螺旋，即構(gòu)型為S構(gòu)型，此化命物與已知化合物gomisinJ相似，但是此化合物C-l和C-3上的取代基剛好與gomisinJ相反， 并且此化合物C-7上還有一個(gè)羥基。
綜合上述分析，確定了新化合物的結(jié)構(gòu)為通式(I )所示，經(jīng)文獻(xiàn)檢 索證實(shí)該化合物為一種新化合物。
D.本發(fā)明提供了所述新化合物的抗HIV活性實(shí)驗(yàn)
本發(fā)明對(duì)新化合物做了 HIV感染細(xì)胞的保護(hù)作用試驗(yàn)將8x 105/mL MT4細(xì)胞50pL/孔接種到含有100inL/孔倍比稀釋化合物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 上，培養(yǎng)板的一半孔加入50pL的HIV-l腦稀釋(M.ai.0.006)，另 一半孔加 入50nL培養(yǎng)基。每個(gè)濃度梯度2個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含化合物的對(duì)照 孔和空白對(duì)照孔，37。C,5。/。C02培養(yǎng)，第三天每孔補(bǔ)加100]LiL新鮮培養(yǎng)基， 第五天或第六天釆用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率。ELx800ELISA儀測(cè)定 OD值，測(cè)定波長(zhǎng)為595nm,參考波長(zhǎng)為630 nm。按Reed&Muench法計(jì) 算出化合物抑制病毒的50%有效濃度(EC5o)， 50%抑制細(xì)胞生長(zhǎng)濃度 (CC5Q)及抗HIV-l活性的治療指數(shù)TI值(Therapeutic index),結(jié)果如表 l所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的新化合物顯示出較顯著的抗HIV活 性，其選擇指數(shù)有值得深入研究的價(jià)值，有可能成為抗艾滋病的后選藥物 或后選藥物的先導(dǎo)化合物，預(yù)示了良好的藥用前景。
表l.本發(fā)明的化合物抗HIV活性試驗(yàn)結(jié)果
毒性(CC50)
合胞體抑制(EC50) (ng/mL) TI 感染細(xì)胞的保護(hù)
(ng/mL)
樣品名
EC50
12 1 2 12 CC50(嗎/mL) TI
(jig/mL )
新化合物A >200>200 7.28 6.84 >29,24 >200 15.2 >13.16
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明提出了一種髙效的分離方法。此法至今尚未見(jiàn)到有關(guān)報(bào)道。本 發(fā)明提供的方法步驟簡(jiǎn)單、效率高、直觀、重現(xiàn)性好、出新率高。高效液
相色譜分析表明，采用該方法制備的木脂素類(lèi)新化合物純度高達(dá)99%以上。


圖l為本發(fā)明的工藝流程示意圖2為本發(fā)明粗提物的HPLC圖3為經(jīng)高效液相色譜法純化后的HPLC圖4為新化合物的ESIMS圖5為新化合物的1HNMR圖6為新化合物的"CNMR圖7為新化合物HMBC圖8為新化合物的COSY圖9為新化合物的ROESY圖。
具體實(shí)施例方式
通過(guò)下面給出的具體實(shí)施例，可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明。但它們 并不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。 實(shí)施例1
——鶴慶狹葉五味子(S. w&o"/a"a )的提取和粗分離 將鶴慶狹葉五味子SM;z7Mw/awa的果實(shí)干燥、粉碎過(guò)80目篩，用十倍 于其體積的乙酸乙酯浸泡提取三次，.每次5天，期間每隔3小時(shí)超聲一次， 一次1小時(shí)，合并提取液減壓蒸餾濃縮至浸膏，浸膏用它體積一半的氯仿 溶解與硅膠拌樣，攪拌均勻后將溶劑揮干，碾磨均勻；用硅膠干法填充層 析柱，用氯仿:丙酮為1:0洗脫，收集洗脫液,將洗脫液部分減壓蒸餾濃縮近 干，用適量的甲醇溶解，過(guò)0.45pm濾頭到進(jìn)樣瓶中，用75%的甲醇劃段，收集每一段，濃縮干燥，重復(fù)上述操作，降低甲醇比例直到將每個(gè)峰分開(kāi)， 即可得到各化合物單體。
實(shí)施例2
重復(fù)實(shí)施例l，用氯仿:丙酮(9:1和8:2)洗脫，收集各部分洗脫液，將洗 脫液部分減壓蒸餾濃縮近干，用適量的甲醇溶解，過(guò)0.45pm濾頭到進(jìn)樣 瓶中，用75%的甲醇劃段，收集每一段，濃縮干燥，重復(fù)上述操作，降低 甲醇比例直到將每個(gè)峰分幵，即可得到新化合物單體。(見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例3
重復(fù)實(shí)施例1，用氯仿:丙酮(分別為7:3， 6:4， 5:5, 4:6, 3:7, 2:8， 1:9， 0:1)洗脫，收集各部分洗脫液，將洗脫液部分減壓蒸餾濃縮近干，用 適量的甲醇溶解，過(guò)0.45]um濾頭到進(jìn)樣瓶中，用75°/。的甲醇劃段，收集 每一段，濃縮干燥，重復(fù)上述搡作，降低甲醇比例直到將每個(gè)峰分開(kāi)，即 可得到各化合物單體，但不是本專(zhuān)利所述的新化合物。
實(shí)施例4
重復(fù)實(shí)施例1,改變乙酸乙酯的體積，提取次數(shù)，天數(shù)，超聲時(shí)間， 結(jié)果同樣得到相同的化合物單體(李蓉濤等釆用常規(guī)方法從小花五味子中 分離出43個(gè)化合物，其中4個(gè)新化合物，出新率近10%,而本法分離鶴 慶五味子，分離出40個(gè)化合物，其中20個(gè)新化合物，出新率為50% )。
實(shí)施例5
以鶴慶狹葉五味子(5: w&o"&"a )為原料，將五味子果實(shí)粉末用乙
酸乙酯浸提三次，每次5天，期間每隔3小時(shí)超聲一次， 一次l小時(shí)； 合并提取液減壓蒸餾至浸膏，浸膏用它體積的一半的氯仿溶解與硅膠拌樣， 攪拌均勻后將溶劑揮干，碾磨均勻。用硅膠干法填充層析柱，用氯仿:丙酮 (9: l和8: 2)洗脫，收集各部份洗脫液。將洗脫液用高效液相色譜法分 離純化，根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰收集目標(biāo)級(jí)分；目標(biāo)級(jí)分濃縮干燥后即可得 到所需的化合物單體。實(shí)施例6
實(shí)施例3中所述的高效液相色譜法所用的流動(dòng)相為以甲醇和水的混合 物為流動(dòng)相。 實(shí)施例7
當(dāng)兩個(gè)化合物分離度不好時(shí)可以調(diào)節(jié)甲醇和水的比例，具體方法為 從甲醇含量80%-50%不斷變化，尋找能夠?qū)⒒衔锓珠_(kāi)的最佳比例，甲醇 比例的變化必然要影響出峰時(shí)間，甲醇比例越低出峰時(shí)間越長(zhǎng)，為了節(jié)約
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p、j ipj , 個(gè)久h/j wv ^nn正ii —j不/n -tt-為;izti卞口v刀/z: 、"i升廠/i卞j "手山兀廠乂i而文 的時(shí)間t和第一個(gè)峰和最后一個(gè)峰之間相隔的時(shí)間z3t，通過(guò)實(shí)踐未出峰前 進(jìn)樣的次數(shù)n- (t-Jt) /Jt)。每隔(Jt-lmin)進(jìn)一次樣，這樣便可以節(jié) 約因降低甲醇比例而延長(zhǎng)的時(shí)間)。 實(shí)施例8
實(shí)施例3所述的高效液相色譜色譜法所用的半制備柱為Agilent ZORBAX-C18 (9.4x250nm、 5pm)。 實(shí)施例9
實(shí)施例6所i的高效液相色譜色譜法所用的半制備柱并不僅限于這一 個(gè)廠家，同樣適用于其他的不同廠家的半制備柱。 實(shí)施例10
實(shí)施例3所述的高效液相色譜色譜法所用的檢測(cè)波長(zhǎng)采用三波長(zhǎng) (210nm、 254nm、 300nm)，如果三個(gè)波長(zhǎng)下的吸收峰相似、對(duì)稱(chēng)性相似， 線條平滑便可判定已經(jīng)分純。
權(quán)利要求
1. 下述通式(I)化合物其中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18分別表示C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C5，C8，C9，C10，C11，C12，C13，C14，C15，C16，C17，C18。
2. 權(quán)利要求1化合物的制備方法，其特征在于該方法包括下述步驟: (1)以鶴慶狹葉五味子(S. w/to)"/a"a )為原料，將五味子果實(shí)粉末用乙酸乙酯浸提三次，每次5天，期間每隔3小時(shí)超聲一次， 一次l小時(shí)； 合并提取液減壓蒸餾至浸膏，浸膏用它體積的一半的氯仿溶解與硅膠拌樣， 攪拌均勻后將溶劑揮干，碾磨均勻；(2) 用硅膠干法填充層析柱，用氯仿:丙酮(1:0~0:1)梯度洗脫，收 集各部份洗脫液；(3) 將洗脫液用高效液相色譜法分離純化，根據(jù)紫外檢測(cè)器譜峰收集目標(biāo)級(jí)分；(4) '目標(biāo)級(jí)分濃縮干燥后，得到所需的化合物單體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于在步驟(2)中所用 的硅膠規(guī)格是200 ~ 300目。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中的洗脫 液選擇9:1和8:2部分。
5. —種對(duì)權(quán)利要求1化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定的方法，該方法包括以下(1) 本發(fā)明制備得到的白色粉末，[°^-5.44° , EIMS顯示分子離子 峰m/z 404結(jié)合NMR譜，確定分子式為C22H2807，并經(jīng)高分辨ESIMS譜([M+Na]+， m/z427)證實(shí)不飽和度為9;(2) HPLC-UV在240.8具有聯(lián)苯環(huán)辛烯木脂素的特征吸收，IR(KBr) 光譜顯示存在羥基(3347cm")，芳環(huán)和雙鍵(1640， 1600， 1500cm" )， & 和"CNMR譜說(shuō)明分子中有兩個(gè)苯環(huán)，4個(gè)甲氧基(Sc 135.9， 135.8， 135.6, 135.4), 2個(gè)甲基(Sh0.73， 3H, d， 1.38，3H, s), —個(gè)季碳(Sc 72.8), 一個(gè)次甲基(5C41.79),兩個(gè)亞甲基(Sc39.2， 34.2)和兩個(gè)羥基；(3) 與已知的木脂素類(lèi)化合物波譜數(shù)據(jù)比較確定該化合物為聯(lián)苯環(huán)辛 烯木脂素，經(jīng)HMBC譜H-17與C-6、 C-7和C-8相關(guān)，H-18與C-7、 C-8 和C-9相關(guān)，兩個(gè)羥基氬分別與C- 11、 C- 12、 C-13和C-6、 C-7、 C-8 相關(guān)說(shuō)明兩個(gè)甲基分別位于C-7、 C-8上，兩個(gè)羥基分別位于C-12、 C-7 上；(4) CD譜在250nrn處有很強(qiáng)的負(fù)Cotton效應(yīng)，結(jié)合ROESY和COSY 確定化合物的聯(lián)苯為M螺旋，即構(gòu)型為S構(gòu)型，此化合物與已知化合物 gomisin J相似，但是此化合物C-l和C-3上的取代基剛好與gomisin J相反， 并且此化合物C-7上還有一個(gè)羥基，據(jù)此，確定化合物的結(jié)構(gòu)為通式(I ) 所示。
6. 權(quán)利要求1所述化合物在制備抗HIV活性的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的通式(I)的木脂素類(lèi)化合物，其中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18分別表C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C5，C8，C9，C10，C11，C12，C13，C14，C15，C16，C17，C18。本發(fā)明還涉及從五味子中分離出新穎的木脂素類(lèi)化合物的制備方法和鑒定方法。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物在制備抗HIV活性的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101429107SQ200810233600
公開(kāi)日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日
發(fā)明者李干鵬, 楊海英, 范逸平, 董秀華 申請(qǐng)人:云南民族大學(xué)