專利名稱：攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子微生物學和感染免疫領域，涉及攜帶結核分枝桿菌基因ESAT6 和Ag85B的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗，涉及該疫苗的制備方法，這種重組的減 毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗可以用以抵抗結核分枝桿菌的感染，也具有能抵抗傷寒 沙門菌感染的免疫中的應用。
背景技術：
結核病(Tuberculosis,TB)是一種由結核桿菌感染引起的嚴重危害人類健康的 傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計資料顯示，全球有近1/3的人感染結核桿菌， 每年有300萬人死于結核病，每年新發(fā)病人數(shù)達800 1000萬?？ń槊?BCG)是 目前唯一的結核預防性疫苗，但其對成人結核病的預防效果不穩(wěn)定，保護效果從0 % 80%不等，而且會干擾對結核病的診斷。因此尋找一種安全、有效、廉價且操 作簡便的預防結核病的新型疫苗成為當務之急。
在結核分支桿菌中，抗原85 (antigen 85， Ag85)復合體為優(yōu)勢的分泌蛋白及 保護性抗原，包括Ag85A、 Ag85B和Ag85C三種蛋白成分。Ag85B含量最大，是 一種能誘導明顯Thl型免疫反應的免疫原性蛋白，早期分泌性的6-kD的蛋白(early secreted antigenic target 6-kDa antigen,ESAT6)是結核感染機體早期分泌的 一種同樣可以誘導明顯Thl型免疫應答的優(yōu)勢抗原，可以誘導T細胞發(fā)生明顯細胞 免疫應答。
而卡介苗(BCG)是目前唯一預防結核分枝桿菌感染的疫苗，但其缺失ESAT6 基因，而ESAT6是一種保護性抗原。因而有必要構建具有ESAT6等保護性疫苗以 彌補BCG疫苗的不足。
而減毒鼠傷寒沙門氏菌&/附0"6//" /)^Wwwn'iwj SL7207是細胞內侵襲性細菌， 可以通過腸道及上呼吸道途徑感染，侵入粘膜相關淋巴組織(MALT)，被MALT 內的專職抗原遞呈細胞(APC)吞噬，并在其中增殖。減毒鼠傷寒沙門氏菌與機體 相互作用可產(chǎn)生特異性的免疫應答，誘導IgG及腸sIgA的生成，并產(chǎn)生特異性細胞免疫，由于其能靶向感染APC，因而是一種很好的疫苗備選載體，從粘膜免疫方面 進一步提高機體對呼吸道病原微生物如結核等感染的防御能力。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗 Sa/mcme"a iy_p/n' nwn'wmSL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及 SaZmoneWa (yj /u'mwn'Mm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，疫苗可以穩(wěn)定表達結核分支桿菌的優(yōu)勢抗原。該 減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗制備方便，經(jīng)口服途徑免疫后，可以明顯增強小鼠的 細胞免疫、體液免疫以及粘膜免疫應答，全面提高機體的抗結核分支桿菌的免疫力， 它們產(chǎn)生的黏膜和血清SIgA水平強于BCG和DNA疫苗。并且5Wwo"e〃a (y; /n'附wr/wm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)免疫保護能力大于DNA疫苗或 S^Zmowe//a J>_p/ imwn'w i SL7207(pVAX-l-Ag85B);聯(lián)合^f吏用Sa/moweZ/fl /^p/ >nwn.w 7 SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)和BCG的免疫保護作用最強，大于單獨BCG的免 疫保護作用。
本發(fā)明的另個一目的是在于提供了一種制備攜帶結核基因的減毒細菌載體結核 疫苗的方法，該方法較簡便易行，且所制備的疫苗可以穩(wěn)定的表達結核分支桿菌蛋 白。
本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗 在制備治療或預防結核分枝桿菌的感染藥物中的應用。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明選用減毒鼠傷寒沙門氏菌Sa/mo"e"a 0^"'附"Hmwj SL7207菌株做為載體，與其他傷寒沙門氏菌株相比，安全性較高。
本發(fā)明的目的基因是結核分支桿菌基因Ag85B以及ESAT6， 二者在結核感染 的過程中發(fā)揮重要的作用，可以明顯誘導Thl型免疫應答，是制備結核分支桿菌疫 苗的首選抗原。
本發(fā)明利用同源重組的方法將結核分支桿菌基因插入到真核表達載體質粒中， 然后將構建成功的真核表達質粒轉入減毒鼠傷寒沙門氏菌中使其穩(wěn)定表達結核分支 桿菌抗原，刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應答。
本發(fā)明釆用以下技術方案
發(fā)明的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗5Wwo"e//a O^/z/mwn'ww SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以 及 Sa/wo"e/Za /^/ /H7nwr/w附SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B),已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存，CCTCC: M 208241及CCTCC:M 208242。其制備步驟如下
一、構建含有結核分支桿菌H37Rv菌株Ag85B以及ESAT6-Ag85B (相關文獻在 《J Immunol.》第154巻上發(fā)表)融合基因真核表達質粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B。 antigen 85B (Ag85B) 以及早期分泌抗原(early secreted antigenic target 6-kDa antigen, ESAT6)以結核分支桿菌H37Rv菌株基因組為模板通過 PCR方法獲得。Ag85B上下游弓l物分另lJ是5'-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3， 和5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，,(酶切位點分別是5amHI、五coRI)， 然后將獲得的Ag85B與pVAX-l分別作3"wHI 、 ￡coRI雙酶切后連接得到 pVAX-l-Ag85B真核表達質粒；ESAT6上下游引物分別為 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 禾口 5'-TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'.(酶切位點分別為歷"dIII and 5"附HI)，然后將PCR獲得的ESAT6以及構建成功的pVAX-l-Ag85B分別做歷"din and BtzmHI雙酶切，連接獲得pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表達質粒。
二、利用電轉化的方法(相關文獻在1999年《FOLIA MICROBIOLOGICA》 第44巻發(fā)表)將克隆構建的真核表達質粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B轉化到&/mo"e//。 0^"'附""'"w LB5000菌株(相關文獻在 1992年《VACCINE》第IO巻發(fā)表)中進行修飾后提取質粒再轉化至減毒鼠傷寒沙 門氏菌5W附o"e/Zfl 0^hi附wi"附SL7207 (相關文獻已發(fā)表在《infection and immunity》 第61巻)中，并將其傳代20代后鑒定其穩(wěn)定性，免疫印跡(WesternBlot)檢測構 建的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗中GST-Ag85B以及GST-ESAT6-Ag85B融合蛋白 的表達；最后保存鑒定正確后的菌種&/wo"e〃a 0^W附wWwm SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及Sa/附o"eZ/a 0^2z'附wzm/m SL7207(pVAX-l國ESAT6-Ag85B)。
一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗Sa/nto"e"a (y; Wmwiwn SL7207(pVAX-l-Ag85B)以及&Zwo"e//a O^/jz'mwWwm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)
的應用過程是
將申請人制備的疫苗Sa/wo"e〃a 0^"'wwn'ww SL7207(pVAX-1 -Ag85B)以及 0^"'OT"Wwm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)在含有卡那霉素及鏈霉素的無菌LB培養(yǎng)基中37度培養(yǎng)過夜，收集細菌后以無菌PBS調整其濃度，按每只小鼠l Xl()SCFU的量以灌胃途徑免疫BalB/C小鼠，每兩周免疫一次，共免疫三次。免疫后 小鼠一部分用于特異性抗體、黏膜免疫和細胞免疫等免疫指標的檢測，另一批小鼠 免疫三次后在ABSL-III級實驗室進行結核分枝桿菌H37Rv攻毒(尾靜脈及滴鼻)實 驗，觀察感染后小鼠的生存率、脾臟肺臟的病理變化及結核分枝桿菌菌落計數(shù)、肺 臟結核分枝桿菌的抗酸染色等進一步評估攜帶結核分枝桿菌Ag85B以及 ESAT6-Ag85B的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗對結核分枝桿菌感染的免疫保護作
用。所構建的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗可以作為制備治療或預防結核分枝桿菌 的感染藥物中的應用，以及作為制備治療或預防結核分枝桿菌感染的疫苗藥物中的 應用。
發(fā)明的優(yōu)點和效果
本發(fā)明構建了一種可以穩(wěn)定表達結核分支桿菌基因的減毒傷寒沙門氏菌載體疫 苗5^/附0"6//" />p/ >wwn'ww SL7207(pVAX-l國Ag85B)以及iSfl/mo"e〃a /^p/zzTwt/n'ww SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，這種減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗能激發(fā)有效的 體液免疫、細胞免疫的同時，會顯著的誘導機體產(chǎn)生粘膜性免疫應答，可以很好的 用來預防結核分支桿菌的感染。這種疫苗具有很多優(yōu)點①可以穩(wěn)定表達結核分枝 桿菌蛋白；②免疫后可有效的誘導粘膜和系統(tǒng)免疫應答；③制備方法及使用途徑簡 便，成本低，具有顯著的經(jīng)濟效益。動物實驗表明以這種減毒鼠傷寒沙門氏菌載 體疫苗免疫小鼠，小鼠能產(chǎn)生抗結核分支桿菌感染的特異性免疫應答，因此本發(fā)明 可以作為抗結核分支桿菌的候選疫苗。本發(fā)明為進一步拓展減毒傷寒沙門氏菌作為 口服疫苗載體的應用打下了基礎，并為結核疫苗的研制提供了一條新的思路。


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圖1 .含有結核分支桿菌基因Ag85B以及ESAT6-Ag85B融合基因的真核表達質粒 構建示意圖。
1為DNA marker, 2為重組質粒pVAX-l-Ag85B酶切鑒定，3為重組質粒 pVAX-l -ES AT6-Ag85B的酶切鑒定。
將真核表達質粒酶切鑒定，pVAX-l大小為3.0kb， Ag85片段大小為860bp， ESAT6-Ag85B融合基因片段大小為1140bp，鑒定正確。圖2.減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗的穩(wěn)定性檢測及Western Blot檢測真核蛋白 Ag85B、 ESAT6-Ag85B的表達示意圖
將疫苗菌株傳代20代后提取質粒，做酶切鑒定，圖2A: 1為DNA marker, 2 為疫苗51"^0"2//<3 /);p/zZww/wm SL7207(pVAX-l-Ag85B)的質粒表達鑒定，3為疫苗 Sfl/mowW/aO^^wi^wm SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)的質粒表達鑒定。圖2B:為 免疫后小鼠肌肉、脾臟、肺臟及腸道中蛋白Ag85B、 ESAT6-Ag85B的真核表達。
將減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗傳代20代后提取質粒鑒定，質粒沒有丟失， 構建的真核表達質粒在Sa/mo"d/a 0^"'mwn'wm SL7207中穩(wěn)定表達；疫苗免疫小鼠 后在多個臟器中穩(wěn)定表達真核蛋白Ag85B、 ESAT6-Ag85B。
圖3.質粒DNA疫苗以及減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫小鼠血清特異性抗體 的ELISA檢測的示意圖.
陰性對照以真核表達載體pVAX-l以及減毒傷寒沙門氏菌株5Wmo"e/to 妙/z/,n',SL7207免疫的小鼠；空白對照以PBS免疫的小鼠。
血清中抗體隨著免疫次數(shù)的增加而明顯升高且減毒傷寒載體疫苗組明顯高于空 載體對照組，減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫三次后的小鼠血清中抗體亞型 IgG2a也明顯高于空載體對照組。
圖4.質粒DNA疫苗以及減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫小鼠的特異性黏膜 免疫水平，即胃腸及血清SIgA的ELISA檢測的示意圖.
減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗組小鼠的腸道及血清SIgA水平最高，進一步提高 機體的抗結核分支感染能力。
圖5.ELISP0T法檢測免疫后小鼠特異性T細胞分泌的細胞因子的表達示意圖。
傷寒沙門氏菌載體疫苗組分泌IFN-Y的細胞數(shù)量明顯高于對照組，而IL4不明顯， 呈現(xiàn)出以Thl型免疫反應為主的免疫應答。
圖6.流式細胞術檢測細胞免疫水平CD8+T細胞顆粒酶釋放結果示意圖。
顆粒酶釋放實驗顯示減毒傷寒沙門氏菌載體疫苗組的CD8+T淋巴細胞針對結 核分支桿菌的特異性免疫應答增強。
圖7.經(jīng)疫苗免疫后小鼠感染結核分枝桿菌后生存率觀察結果示意圖。
減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗可以明顯延長感染結核分枝桿菌的小鼠的生存時 間，提高其生存率。圖8.經(jīng)疫苗免疫后小鼠感染結核分枝桿菌后小鼠肺臟結核分枝桿菌的抗酸染色 結果示意圖。
圖9.經(jīng)疫苗免疫后小鼠感染結核分枝桿菌后小鼠肺臟HE染色結果示意圖。 經(jīng)減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫組的小鼠肺臟病理變化明顯輕于對照組， 肺組織結構清晰，肺泡融合少。
具體實施例方式
實施例l:
減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗5b/wo"e〃a 0^&附"hww SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以及fe/mo"e〃fl/^p/zz'ww/wm SL7207(pVAX隱l-ESAT6-Ag85B)的制備，其步驟是
A、 構建含有結核分支桿菌H37Rv菌株Ag85B以及ESAT6-Ag85B (相關文獻在 《J Immunol.》第154巻上發(fā)表)融合基因真核表達質粒pVAX-l-Ag85B以及
pVAX-l-ESAT6-Ag85B?？乖?5B (Ag85B) 以及分泌性6-kDa蛋白(ESAT6)以 結核分支桿菌H37Rv菌株基因組為模板通過PCR方法獲得。Ag85B上下游引物分別 是 5'-T^MEI￡AAATGTTCTCCCGGCCG-3' 和
5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，,(酶切位點分別是Sa附HI、五coRI)，然 后將獲得的Ag85B與pVAX-l分別作SamHI、五coRI雙酶切后連接得到pVAX-l-Ag85B 真核表達質粒 ；ESAT6 上下游引物分別為 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 和 5'-TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'.(酶切位點分別為州wdIII and ^ mffl)，然后將PCR獲得的ESAT6以及構建成功的pVAX-l-Ag85B分別做/Z/"d111 and BawHI雙酶切，連接獲得pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表達質粒。
B、 利用電轉化的方法(相關文獻在1999年《FOLIA MICROBIOLOGICA》 第44巻發(fā)表)將克隆構建的真核表達質粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B轉化到&/wo"e//a O^/zz'ww/w/w LB5000菌株(相關文獻在 1992年《VACCINE》第IO巻發(fā)表)中進行修飾后提取質粒再轉化至減毒鼠傷寒沙 門氏菌5b/wo"e//fl 0^/ >wwn-ww SL7207 (相關文獻已發(fā)表在《infection and immunity》 第61巻)中，鑒定后保存菌種&/附0加//"0/; /2^^/"附31^7207(^/^-1-八經(jīng)858)以及
0^/z/附wn'ww SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)。將保存的菌種傳代(傳代 方法取10微升保存的菌液，加入到含有5微升卡那霉素和5微升鏈霉素的5毫升LB培養(yǎng)基中，37度搖床中培養(yǎng))20代后提取質粒鑒定疫苗的穩(wěn)定性并免疫小鼠后 檢測真核蛋白Ag85B以及ESAT6-Ag85B的表達情況。 重組疫苗效果的鑒定
申請人將該減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗Sa/mone〃a 0^Wwwn'wm SL7207(pVAX-l-Ag85B)以及5W/mo"e〃a O^/nmwzww SL7207(pVAX隱l隱ESAT6陽Ag85B) 按每只小鼠lXl()SCFU的量以灌胃途徑免疫BalB/C小鼠，每兩周免疫一次，共免疫 三次。每次免疫后兩周取各組小鼠的尾靜脈血檢測血清中針對結核分支桿菌Ag85B 蛋白的特異性抗體IgG;第三次免疫后兩周取小鼠尾靜脈血檢測結核分支桿菌Ag85B 蛋白的特異性抗體IgGl、 IgG2a以及小鼠胃、腸、血清中的分泌性IgA表達；同時， 還將另一批小鼠免疫三次后進行結核分枝桿菌H37Rv攻毒(尾靜脈及滴鼻)實驗， 觀察感染后小鼠的生存率、脾臟肺臟的病理變化及結核分枝桿菌菌落計數(shù)、肺臟結 核分枝桿菌的抗酸染色等進一步評估攜帶結核分枝桿菌Ag85B以及ESAT6-Ag85B 的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗對結核分枝桿菌感染的免疫保護作用。
實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)構建的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫后的小鼠抗原85B特異 性的抗體IgG、 IgGl、 IgG2a以及分泌粗gA表達水平明顯提高，提高了小鼠的體液 免疫和粘膜免疫功能；同時，構建的傷寒沙門氏載體疫苗還可以顯著促進IFN-Y、 顆粒酶等的分泌和釋放，極大的提高了小鼠的細胞免疫功能；同時，小鼠感染實驗 也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)構建的減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗免疫的小鼠，生存率明顯提高，肺 臟病理變化明顯減輕，脾肺結核分枝桿菌計數(shù)明顯減少。從多方面證實，所構建的 減毒鼠傷寒沙門氏菌載體疫苗可以作為制備治療或預防結核分枝桿菌的感染藥物中 的應用，以及作為制備治療或預防結核桿菌感染的疫苗藥物中的應用。
權利要求
1、一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗，其特征在于Salmonellatyphimurium SL7207(pVAX-1-Ag85B)，CCTCC保藏號為CCTCCM 208241。
2、 一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗，其特征在于Salmonella typhimurium SL7207(pVAX陽l-ESAT6-Ag85B), CCTCC保藏號為CCTCC: M 208242。
3、 一種用于實現(xiàn)權利要求1或2所述的攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗的制備方法，它包括下列步驟A、 構建含有結核分支桿菌Ag85B以及ESAT6-Ag85B融合基因真核表達質粒 pVAX-l-Ag85B以及pVAX-l-ESAT6-Ag85B， Ag85B和ESAT6基因分別以結核分支 桿菌H37Rv菌株基因組為模板通過PCR方法獲得，Ag85B上下游引物分別是 5'-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3 ， 和 5'-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3，，然后將獲得的Ag85B與pVAX-l分別作 5amHI、五coRI雙酶切后連接得到pVAX-l-Ag85B真核表達質粒；ESAT6上下游引物 分 另U 為 5'-GCAAGCTTATGACAGAGCAGCAGTGGAA-3， 和 5'隱TTCCTAGGTGCGAACATCCCAGTGACGT-3'，然后將PCR獲得的ESAT6以及構 建成功的pVAX-l-Ag85B分別做歷mlin and BawHI雙酶切，連接獲得 pVAX-l-ESAT6-Ag85B真核表達質粒；B、 利用電轉化的方法將克隆構建的真核表達質粒pVAX-l-Ag85B以及 pVAX-l-ESAT6-Ag85B轉化到LB5000菌株中進行修飾后提取質粒再轉化至減毒鼠 傷寒沙門氏菌SL7207中，鑒定后保存菌種SWmoweZ/fl 0^^附""wm SL7207(pVAX-l-Ag85B) 以 及 5^/附o"e//(3 />p/zz'mwn'w/w SL7207(pVAX-l-ESAT6-Ag85B)，將保存的菌種傳代20代后提取質粒鑒定疫苗的穩(wěn) 定性并免疫小鼠后檢測真核蛋白Ag85B以及ESAT6-Ag85B的表達。
4、根據(jù)權利要求1或2所述的一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗在制 備治療或預防結核分枝桿菌的感染藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種攜帶結核基因的減毒細菌載體結核疫苗及制備方法和應用，首先構建含有結核分支桿菌Ag85B、ESAT6-Ag85B基因的真核表達質粒；其次是利用電轉化的方法將所構建的真核表達質粒轉化至減毒鼠傷寒沙門氏菌中，減毒鼠傷寒沙門氏菌可以穩(wěn)定表達結核分枝桿菌蛋白。聯(lián)合使用Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)和BCG的抵抗結核桿菌感染免疫保護作用最強，大于單獨BCG的免疫保護作用；它們產(chǎn)生的黏膜和血清SIgA水平強于BCG和DNA疫苗。并且Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-ESAT6-Ag85B)免疫保護能力大于DNA疫苗或Salmonella typhimurium SL7207(pVAX-1-Ag85B)。方法簡便，成本低，使用方便，具有能抵抗傷寒沙門菌感染，又能抵抗結核桿菌感染的免疫保護。穩(wěn)定表達結核分枝桿菌蛋白，免疫后可誘導粘膜和系統(tǒng)免疫應答，具有顯著的經(jīng)濟效益。
文檔編號A61K39/112GK101428143SQ20081023672
公開日2009年5月13日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權日2008年12月9日
發(fā)明者王其龍, 章曉聯(lián) 申請人:武漢大學