專利名稱：Omi蛋白及其編碼基因的一種新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及0MI蛋白及其編碼基因的一種新用途。
背景技術(shù)：
帕金森病是一種常見的老年神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率在65歲以上人群中達(dá) 到1%。帕金森病的主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的喪失，致病機(jī)制目前 依然不明。由a-synuclein (神經(jīng)退行性致病蛋白類的突觸囊泡核蛋白)作為主要 成份在神經(jīng)元胞漿內(nèi)形成的路易小體(Lewy body)是帕金森病的病理學(xué)特征。現(xiàn) 有的治療帕金森的藥物和方法主要包括乙酰膽堿酯酶抑制劑，包括L-D0PA腎細(xì) 胞轉(zhuǎn)移阻斷劑的組合物、2- ( 2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰)-1 、 3-環(huán)己二酮、 (2-咪唑啉-2-基氨基)喹噁啉；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子法；多巴胺能 神經(jīng)元和具有增殖能力的前體細(xì)胞法；神經(jīng)干細(xì)胞法和中藥法等。
a-synuclein基因是較早發(fā)現(xiàn)的與帕金森病相關(guān)的致病基因，它編碼一個由 143個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢。研究發(fā) 現(xiàn)，a-sy皿clein的第53位氨基酸突變A53T與家族性帕金森病相關(guān)，A53T a -synuclein突變蛋白與野生型蛋白相比，在體外易形成寡聚體的纏結(jié)，在細(xì)胞內(nèi)其 聚集會引起高爾基體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。a-synuclein蛋 白主要通過兩種方式降解，分別是泛素-蛋白酶體途徑和酸性細(xì)胞器-溶酶體途徑。 而a -synuclein突變體很少經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑，主要是通過溶酶體途徑降解。 因此，探索如何促進(jìn)a -synuclein突變體在溶酶體途徑的降解將對帕金森病的治療 探索提供有利的基礎(chǔ)理論和治療指導(dǎo)。
現(xiàn)有的提高細(xì)胞溶酶體降解活性的主要商業(yè)化藥物有雷帕霉素，海藻糖，這些 藥物由于廣泛地非特異性地提高溶酶體活性，導(dǎo)致正常蛋白和結(jié)構(gòu)的降解，存在細(xì) 胞毒性高，副作用強(qiáng)的缺點(diǎn)。因此探索一種特異性強(qiáng)且副作用低的提高細(xì)胞溶酶體 降解突變a -synuclein能力的方法對帕金森病的治療有重要指導(dǎo)意義。
0MI是一種線粒體蛋白酶，主要存在于線粒體的膜間質(zhì)中，也在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾 基體中有分布。0MI在神經(jīng)退行性疾病和細(xì)胞凋亡中行使重要的作用，在帕金森病 的病理標(biāo)志-路易小體中就能檢測到0MI蛋白的存在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供OMI蛋白及其編碼基因的一種新用途。 本發(fā)明提供了 0MI蛋白的編碼基因在制備促進(jìn)A53T a-synuclein突變體蛋白 降解的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子
1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；
3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子；
所述A53T a-synuclein突變體蛋白是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)
(c) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(d) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了 OMI蛋白的編碼基因在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用；所 述0MI蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子
1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；
3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。
本發(fā)明還提供了 OMI蛋白的編碼基因在促進(jìn)溶酶體降解中的應(yīng)用；所述OMI蛋 白的編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)的DNA分子-
1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子;
3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。
本發(fā)明還提供了 OMI蛋白的編碼基因在制備促進(jìn)溶酶體降解的藥物中的應(yīng)用； 所述0MI蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子
1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子;
3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì) 的DNA分子。本發(fā)明還提供了 0MI蛋白在制備促進(jìn)A53T ci-symiclein突變體蛋白降解的藥 物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)；
所述A53T a-synuclein突變體蛋白是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)
(c) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(d) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了 0MI蛋白在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用；所述0MI蛋白 是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
U)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了OMI蛋白在促進(jìn)溶酶體降解中的應(yīng)用；所述OMI蛋白是如下(a) 或(b)的蛋白質(zhì)
(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還提供了 0MI蛋白在制備促進(jìn)溶酶體降解的藥物中的應(yīng)用；所述0MI蛋 白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明將0MI蛋白及其編碼基因與溶酶體的降解活性聯(lián)系起來，揭示了該蛋白 對細(xì)胞酸性細(xì)胞器-溶酶體的調(diào)節(jié)功能和對A53T a -synuclein-EGFP蛋白降解的促 進(jìn)作用。將OMI蛋白的編碼基因?qū)爰?xì)胞，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)溶酶體的活性，促進(jìn)A53T a-synuclein-EGFP蛋白降解。本發(fā)明為帕金森病的臨床治療提供了新的思路，具 有重大意義。
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。


圖1為哺乳動物真核表達(dá)載體pEGFP-Nl的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為質(zhì)粒I的酶切鑒定圖。
圖3為哺乳動物真核表達(dá)載體pCDNA3. 1-MYC的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖4為質(zhì)粒II的酶切鑒定圖。
圖5為質(zhì)粒ni的酶切鑒定圖。
圖6為穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein突變蛋白的細(xì)胞系的熒光照片；(a) HeLa
細(xì)胞系；(b)N2a細(xì)胞系。
圖7為穩(wěn)定表達(dá)A53T a -synuclein突變蛋白的細(xì)胞系的western雜交結(jié)果。 圖8為在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，0MI蛋白對A53T a-synuclein突變體蛋白降解
的促進(jìn)作用。
圖9為在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein突變體蛋白的細(xì)胞中，0MI蛋白對A53T a -synuclein突變體蛋白降解的促進(jìn)作用。
圖IO為降低OMI的表達(dá)量對A53T a-Synuclein突變體蛋白降解的影響。
圖11為氯喹對OMI促進(jìn)A53T a -synuclein-EGFP降解的抑制作用。
圖12為導(dǎo)入OMI蛋白后細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的變化。
圖13為導(dǎo)入OMI蛋白后細(xì)胞內(nèi)溶酶體底物水平的變化。
圖14為降低OMI的表達(dá)量后細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的變化。
圖15為沉默HtrA2/0MI的HeLa細(xì)胞中，對細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)缺乏實(shí)驗(yàn)后，酸性染 料MDC的染色結(jié)果。
圖16為降低OMI的表達(dá)量后細(xì)胞內(nèi)溶酶體底物水平的變化。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 以下實(shí)施例中所用的細(xì)胞裂解液為RIPA lysis buffer (25 mM Tris-HCl、 150 mMNaCl、 1%NP-40 (體積比)、1% Sodium deoxycholate (質(zhì)量百分比);pH7.6)。 實(shí)施例l、試驗(yàn)相關(guān)質(zhì)粒和細(xì)胞系的獲得 一、質(zhì)粒I (A53T a-synuclein-EGFP突變體質(zhì)粒)的構(gòu)建 1、 a-sy皿clein蛋白編碼基因的獲得
以成人胎腦cDNA文庫(clontech公司，Catalog No. 638831)為模板，PCR獲得 全長的a-synuclein蛋白編碼基因(野生型)。PCR的引物如下上游引物5-GAAGATCTCCATGGATGTATTCATG-3; 下游引物5-GCGTCGACAAGGCTTCAGGTTCGTAG-3 。
2、 A53T a-synuclein突變體蛋白編碼基因的獲得
使用Takara公司MutanBEST突變試劑盒，以步驟l獲得的a -synuclein蛋白編碼 基因(野生型)為模板進(jìn)行PCR，獲得A53T a-synuclein突變體蛋白編碼基因。PCR 引物如下
上游引物5-GTGGTGCATGGTGTGACAACAGTGGCTGAGAAG-3; 下游引物5-CTTCTCAGCCACTGTTGTCACACCATGCACCAC-3 。
3、 質(zhì)粒I的構(gòu)建
pEGFP-Nl質(zhì)粒(clonetech公司，Catalog No. 6085-1)中的標(biāo)記為綠色熒光蛋 白(EGFP)，結(jié)構(gòu)示意圖見圖l。該載體能在插入的外源基因表達(dá)蛋白的C末端融合表 達(dá)一個綠色熒光蛋白，從而能夠通過熒光顯微鏡方便其觀察及細(xì)胞系構(gòu)建。同時(shí)， 該載體表達(dá)G418抗性蛋白，適合用于細(xì)胞系篩選。
限制性內(nèi)切酶BglII和SalI雙酶切步驟2獲得的a -synuclein突變體蛋白編碼 基因，并將酶切產(chǎn)物連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切的pEGFP-Nl載體上， 得到質(zhì)粒I。
4、 A53T a -synuclein-EGFP突變體質(zhì)粒的鑒定
1) 酶切鑒定
用限制性內(nèi)切酶Eco47 III和Kpn I對質(zhì)粒I進(jìn)行酶切，結(jié)果見圖2。
2) 測序鑒定
將質(zhì)粒I進(jìn)行測序，結(jié)果表明，插入的外源DNA具有序列表的序歹U1自5'末端 第1至420位核苷酸。A53T a-synuclein突變體蛋白編碼基因如序列l(wèi)所示，A53T a -571111(:16111突變體蛋白如序列2所示。
A53T a -synuclein突變體蛋白編碼基西與a -synuclein蛋白編碼基因 (Genbank Accession Number:醒—000345)只存在l個核苷酸(單位點(diǎn)突變)的差 別(序列1自5，末端第157位核苷酸)，A53T a -synuclein突變體蛋白與a -synuclein蛋白(Genbank Accession Number: NP—000336)只有自氨基末端第53 位氨基酸殘基不同。
二、 HtrA2/0MI真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1、 HtrA2/0MI基因序列的克隆以成人胎腦cDNA文庫(clontech公司，Catalog No. 638831)為模板，PCR獲得 全長的HtrA2/0MI基因cDNA序列。PCR的引物如下
上游引物5-AATGGTACCCCACCATGGCTGCGCCGAGGGCGG-3; 下游引物5-CGCTCGAGTTCTGTGACCTCAGGGGTC -3。
2、 HtrA2/0MI真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
pCDNA3. l-MYC真核表達(dá)載體(購自invitrogen公司，Catalog No. V80020)中 的標(biāo)記為MYC，結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。該載體能在插入的外源基因表達(dá)蛋白C末端融 合表達(dá)一段MYC短肽標(biāo)簽，可用MYC抗體檢測外源蛋白的表達(dá)。限制性內(nèi)切酶KpnI 和Xhol雙酶切步驟1獲得的HtrA2/0MI基因序列，并將酶切產(chǎn)物連接到經(jīng)限制性 內(nèi)切酶Kpnl和Xhol雙酶切的pCDNA3. 1-MYC真核表達(dá)載體上，得到質(zhì)粒II 。
pKH3-HA真核表達(dá)載體(購自www. addgene. com網(wǎng)站，質(zhì)粒編號12555，網(wǎng)址 http:〃www. addgene. org/pgvecl f=c&cmd=f indpl&identif ier=12555&attag=n) 中的標(biāo)記為HA。該載體能在插入的外源基因表達(dá)蛋白C末端融合表達(dá)一段HA短肽 標(biāo)簽，可用HA抗體檢測其表達(dá)。限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI雙酶切質(zhì)粒II并將 酶切產(chǎn)物連接到pKH3-HA相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)，得到質(zhì)粒m。
3、 HtrA2/0MI真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
1) 酶切鑒定
用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI對質(zhì)粒n進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖4。 用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI對質(zhì)粒ni進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果見圖5。
2) 測序鑒定
分別將質(zhì)粒ii和質(zhì)粒m進(jìn)行測序，結(jié)果表明，插入的外源DNA具有序列表的序
列3自5，末端第l至1374位所示的核苷酸。序列3所示的核苷酸為Genbank Accession Number: NM—013247. 4自起始密碼子起第1-1377位核苷酸，編碼序列表的序列4所示 的蛋白質(zhì)，序列4所示的蛋白質(zhì)為Genbank Accession Number: NPJ)37379自氨基端 第1-458位氨基酸殘基。
三、穩(wěn)定表達(dá)A53T ct-synuclein突變體蛋白的細(xì)胞系的構(gòu)建
1、 將質(zhì)粒I接種于含卡那霉素(60ug/ml)的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，提取 并純化質(zhì)粒，通過紫外分光光度計(jì)測定濃度。
2、 HeLa細(xì)胞(ATCC， Catalog No. 30-2003)和N2a細(xì)胞(ATCC， Catalog CCL-131) 分別接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度約3-5X104/孔，過夜培養(yǎng)，待用。3、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
Lipofectamine2000每孔1. 1，溶解在100 y 1 DMEM (無血清無抗生素)培 養(yǎng)基中，充分混合后室溫孵育5rain;質(zhì)粒I每孔2u g，溶解在100 u 1 DMEM培養(yǎng) 基中，充分混合后室溫孵育5min;然后兩種溶解混合均勻，室溫孵育20-25min。 HeLa細(xì)胞(或N2a細(xì)胞)用DMEM (含血清無抗生素)培養(yǎng)基洗滌2次后加入孵育 過的混合物，在37"， 5% C02培養(yǎng)條件培養(yǎng)4-6h后，補(bǔ)充培養(yǎng)基成分，使培養(yǎng)基 成為歷EM完全培養(yǎng)基(含血清抗生素)，每孔300ul，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時(shí)，到細(xì) 胞增長接近95%密度時(shí)按1: 4密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
4、 去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入G418濃度為400yg/ml的篩選培養(yǎng)基(含 有10% (體積比)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
5、 換液
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每3-5天更換一次篩選培養(yǎng)基。當(dāng)有大量 細(xì)胞死亡時(shí)，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選10 14天后，可見有抗性的 克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待克隆逐漸增大后進(jìn)入步驟6的實(shí)驗(yàn)。
6、 挑單克隆
制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到l個/10ul。在96孔板中加入 培養(yǎng)基150ul/孔，再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待克隆出現(xiàn)并逐漸增大后轉(zhuǎn)入到48 孔中增殖。
7、 單克隆鑒定
細(xì)胞大量擴(kuò)增后，收取部分細(xì)胞，用熒光顯微鏡拍照，照片見圖6。用細(xì)胞裂 解液處理細(xì)胞，然后用EGFP抗體(購自santa cruz公司，Catalog No: sc-73556) 對細(xì)胞裂解液進(jìn)行western雜交檢測，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，在HeLa和N2a兩種 細(xì)胞系中均可穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP蛋白。
本實(shí)施例制備的質(zhì)粒I、質(zhì)粒II、質(zhì)粒ni、穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP 蛋白的HeLa細(xì)胞系、穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP蛋白的N2a細(xì)胞系用于以 下實(shí)施例2和實(shí)施例3的試驗(yàn)。
實(shí)施例2、 0MI蛋白促進(jìn)A53T a-synuclein突變體蛋白降解 以下試驗(yàn)中，HeLa細(xì)胞、N2a細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synUclein-EGFP突變體 的HeLa細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的N2a細(xì)胞的細(xì)胞密度均為3X104-4X10MV孔。
1、 OMI蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中促進(jìn)A53T a-synuclein突變體蛋白降解
在HeLa細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒I和質(zhì)粒III (質(zhì)粒I的轉(zhuǎn)染量為lug/孔；質(zhì)粒 III的轉(zhuǎn)染量為lug/孔)；同時(shí)，在HeLa細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒I和質(zhì)粒pKH3-HA， 作為對照。48h后，用EGFP抗體和HA抗體(購買自santacruz公司，Catalog No. sc-57592)對細(xì)胞裂解液進(jìn)行western雜交，western雜交中的內(nèi)參蛋白為GAPDH (該抗體購買自santa cruz公司，Catalog No. sc-47724)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。圖8中，1:對照；2:轉(zhuǎn)入質(zhì)粒I和質(zhì)粒III的HeLa細(xì)胞。結(jié) 果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒m的細(xì)胞中，A53T a-synuclein-EGFP蛋白的表 達(dá)量明顯降低，說明在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入外源HtrA2/0MI基因能提高細(xì)胞對 神經(jīng)退行性疾病致病蛋白(A53T a-synuclein)的降解能力。
2、 0MI蛋白在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein突變體蛋白的細(xì)胞中促進(jìn)A53T a -synuclein突變體蛋白降解
在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒III (轉(zhuǎn) 染量為lug/孔)；同時(shí)，在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的HeLa細(xì)胞 中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKH3-HA (轉(zhuǎn)染量為lug/孔)，作為對照。48h后，用EGFP抗體和 HA抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行western雜交，western雜交中的內(nèi)參蛋白為ERKl/2 (購 買自santa cruz公司，CatalogNo. sc-93)，結(jié)果見圖9-A。圖9-A中，1:對照； 2:轉(zhuǎn)入質(zhì)粒III的HeLa細(xì)胞。
在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的N2a細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒II (轉(zhuǎn) 染量為lug/孔)；同時(shí)，在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的N2a細(xì)胞 中，轉(zhuǎn)入pCDNA3. 1-MYC (轉(zhuǎn)染量為lug/孔)，作為對照。48h后，用EGFP抗體、 MYC抗體(該抗體購買自santa cruz公司，Catalog No. sc-70468)和OMI抗體(購 買自santa cruz公司，Catalog No. sc-25606)對細(xì)胞裂角軍液進(jìn)行western雜交， western雜交中的內(nèi)參蛋白為ERKl/2,結(jié)果見圖9-B。圖9-B中，1:對照；2:轉(zhuǎn) 入質(zhì)粒II的N2a細(xì)胞。
結(jié)果顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)入外源HtrA2/0MI基因的細(xì)胞中，A53T a -synuclein-EGFP蛋白量明顯減少，說明在穩(wěn)定表達(dá)A53T a -synuclein-EGFP突變 體的細(xì)胞中，外源HtrA2/0MI基因能提高細(xì)胞對神經(jīng)退行性疾病致病蛋白A53T a -synuclein-EGFP突變體的降解能力。3、 降低簡I的表達(dá)量對A53T a-synuclein突變體蛋白降解的影響 設(shè)計(jì)針對0MI的SiRNA序列(Si-0MI)如下
上游引物5'-GGGGAGUUUGUUGUUGCCAdTdT-3'; 下游引物5'-UGGCAACAACAAACUCCCCdTdT-3'。 對照SiRNA序列(Si-對照)如下 上游引物5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'; 下游引物5' -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。
在穩(wěn)定表達(dá)A53T a -synuclein-EGFP突變體的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Si-0MI (35 pmoles/well);在穩(wěn)定表達(dá)A53T a-synuclein-EGFP突變體的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn) 染Si-對照(35 pmoles/well)，作為對照。24h后，用EGFP抗體和OMI抗體(OMI 抗體購買自santacruz公司，Catalog No. sc-25606)通過western雜交檢測A53T a -synuclein-EGFP的量，western雜交中的內(nèi)參蛋白為GAPDH。
結(jié)果見圖IO。圖10中，1: Si-對照；2: Si-OMI。結(jié)果表明相對于對照組， 轉(zhuǎn)染Si-OMI的細(xì)胞中，A53T a-symiclein-EGFP的水平有顯著的提高。
4、 0MI促進(jìn)A53T a-synuclein-EGFP降解的機(jī)理分析
氯喹(CQ)是常用的溶酶體抑制劑，該藥物能破壞溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境，從而 破壞一切由溶酶體所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解。在HeLa細(xì)胞中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒I和質(zhì)粒 III (質(zhì)粒I的轉(zhuǎn)染量為lug/孔；質(zhì)粒III的轉(zhuǎn)染量為lug/孔)，24小時(shí)后，加入藥 物氯喹(購買自SIGMA， catalog No. 25745)，氯喹的作用濃度為20幽，作用 12h后，western雜交檢測A53T a -synuclein-EGFP蛋白的量。
用pKH3-HA空載體作為質(zhì)粒in的對照，pCDNA3. 1-MYC空載體作為質(zhì)粒I的對 照，用DMS0作為氯喹的溶劑對照。
結(jié)果如圖ll所示。圖11中，按照從上往下的順序，轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒或加入相應(yīng)
藥物(+代表加入，-代表不加入)1: pKH3-HA質(zhì)粒；2:質(zhì)粒III; 3: pEGFP質(zhì)粒； 4:質(zhì)粒I; 5: DMS0; 6:氯喹。
在不加入藥物的情況下，0MI可以顯著的降解A53T a-sy皿clein-EGFP蛋白。 然而，加入CQ后，A53T a-Synuclein-EGFP的降解被抑制。同時(shí)，無論是否加入 藥物，0MI都對綠色熒光蛋白EGFP的降解沒有影響。這充分說明，OMI所針對的A53T a -synuclein-EGFP的降解是一個溶酶體特異性的過程，而沒有泛素蛋白酶體參與。 同時(shí)也證明OMI特異性地促進(jìn)A53T a -synuclein突變體降解而不降解EGFP蛋白。這種特異性說明OMI很適合選為一個促進(jìn)A53T a -synuclein突變體降解的治療基 因，其作用通路也適合被選擇為藥物靶點(diǎn)，其高特異性意味著更低的副作用。
實(shí)施例3、 OMI蛋白對溶酶體活性的調(diào)節(jié)作用
以下試驗(yàn)中，HeLa細(xì)胞、N2a細(xì)胞的細(xì)胞密度均為3X 104-4X 104個/孔。
1、 導(dǎo)入OMI蛋白后細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的變化
細(xì)胞的酸性細(xì)胞器(主要是溶酶體)的活性可以被酸性染料MDC (monodancylcadaverine) (SIGMA， catalog no. M-4008)的染色強(qiáng)度所顯示。在 HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒III (lug/孔)，24h后用MDC進(jìn)行染色；在HeLa細(xì)胞中， 轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKH3-HA (lug/孔)，24h后用MDC進(jìn)行染色，作為對照。
結(jié)果見圖12。圖12中，(a)為對照細(xì)胞；(b)為轉(zhuǎn)入質(zhì)粒m的細(xì)胞。結(jié)果 表明在HtrA2/0MI高表達(dá)的細(xì)胞中，酸性染料的著色強(qiáng)度更高，點(diǎn)狀分布更明顯， 這提示細(xì)胞的溶酶體活性處在高水平。
2、 導(dǎo)入0MI蛋白后細(xì)胞內(nèi)溶酶體底物水平的變化
Sequestosome 1/p62 (—種胞質(zhì)蛋白)是公認(rèn)的溶酶體降解底物。在HeLa細(xì) 胞中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒m (lug/孔);在HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pKH3-HA (lug/孔)，24h 后裂解細(xì)胞，作為對照。用p62抗體(購買自santacruz公司，catalog No. sc-28359) 和HA抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行western雜交，內(nèi)參蛋白為GAPDH。
結(jié)果見圖13。圖13中，1:對照；2:轉(zhuǎn)入質(zhì)粒III的細(xì)胞。結(jié)果表明在HtrA2/0MI 高表達(dá)的細(xì)胞中，p62蛋白水平出現(xiàn)明顯的降解，提示細(xì)胞的溶酶體降解通路被 HtrA2/0MI所激活。
3、 降低0MI的表達(dá)量后細(xì)胞內(nèi)溶酶體數(shù)量的變化 設(shè)計(jì)針對OMI的SiRNA序列(Si-OMI)如下 上游引物5'-GGGGAGUUUGUUGUUGCCAdTdT-3'; 下游引物5'-UGGCAACAACAAACUCCCCdTdT-3'。 對照SiRNA序列(Si-對照)如下
上游引物5， -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'. 下游引物5， -ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'.
在兩組HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Si-OMI (35pmoles/孔);在另外兩組HeLa細(xì)胞中， 轉(zhuǎn)染Si-對照(35 pmoles/孔)，作為對照。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，轉(zhuǎn)入HBSS (Invitrogen，Catalog Number, 14025092.)緩沖液中培養(yǎng)4小時(shí)，作為饑餓刺激(starvation)。 將一組轉(zhuǎn)染Si-0MI的HeLa細(xì)胞和一組轉(zhuǎn)染Si-對照的HeLa細(xì)胞進(jìn)行western
雜交實(shí)驗(yàn)內(nèi)參蛋白為GAPDH。結(jié)果見圖14。圖14中，1: Si-對照；2: Si-OMI。 將一組轉(zhuǎn)染Si-0MI的HeLa細(xì)胞和一組轉(zhuǎn)染Si-對照的HeLa細(xì)胞進(jìn)行MDC染色。
結(jié)果見圖15。圖15中，(a)為轉(zhuǎn)染Si-對照的HeLa細(xì)胞；(b)為轉(zhuǎn)染Si-OMI
的HeLa細(xì)胞。
結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Si-0MI，成功下調(diào)了0MI基因，OMI蛋白的表達(dá)量大大降低。 當(dāng)用營養(yǎng)缺乏刺激細(xì)胞時(shí)，對照細(xì)胞的酸性細(xì)胞器活性有明顯的上升，而OMI低表 達(dá)細(xì)胞則顯示溶酶體活性下降。
4、降低0MI的表達(dá)量后細(xì)胞內(nèi)溶酶體底物水平的變化
在HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Si-OMI (35 pmoles/孔)；在HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Si-對 照(35 pmoles/孔)。24h后裂解細(xì)胞。用p62抗體和OMI抗體對細(xì)胞裂解液進(jìn)行 western雜交，內(nèi)參蛋白為GAPDH。
結(jié)果見圖16。圖16中，1:對照；2:轉(zhuǎn)入SiRNA的細(xì)胞的細(xì)胞裂解液。結(jié)果 表明在轉(zhuǎn)染了針對OMI的SiRNA后，細(xì)胞內(nèi)溶酶體底物p62蛋白的水平出現(xiàn)明顯 的上升，這顯示了 OMI是細(xì)胞溶酶體降解通路中一個關(guān)鍵的蛋白。序列表
<110〉中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
〈120〉 OMI蛋白及其編碼基因的一種新用途
〈130〉 CGGNARY81993
〈160〉 4
<210〉 1
〈211〉 423
<212> DNA
<213> 人屬人(j%M7(9 S^3/W'e/750
<400〉 1
3tgg3tgt3ttcatgaaagg3ctttcaaaggccaaggagg gagttgtggc tgctgctgag60
aaaaccaaacagggtgtggcagaagcagcagg3a3g3c犯aagsgggtgt tctct3tgt3120
ggctccaaaaccaaggagggagtggtgcatggtgtgaceia csgtggctga gaagaccaaei180
gagcaagtgacaaatgttggaggagcagtggtgacgggtg tgacagcagt agcccagaag240
acagtggagggagcaggg3gcattgcagcagccactggct ttgtcaaaaa ggaccagttg300
ggcaagaatg3卿aggagccccacaggsaggaattctgg aagatatgcc tgtggatcct360
geicaatgaggcttatgaaatgccttctgaggaagggtatc aagactacga acctgaagcc420
423
〈210〉 2
〈211〉 140
<212> PRT
<213> 人屬人(j7。膨s邵ie/ 50
〈400> 2<formula>formula see original document page 16</formula>acccgttcgcgcgcgtggctggcggtggcgctgggcgctgggggggcagtgctgttgttg360
ttgtggggcgggggtcggggtcctccggccgtcctcgccgccgtccctagcccgccgccc420
gcttctcccccaacttcatcgc卿tgtggtgg卿卿cagcacctgcc480
gtggtctatatcgagatcctggaccggcaccctttcttgggccgcgaggtccctatctxg540
aacggctcaggattcgtggtggctgccgettgggctcattgtcaccaacgcccatgtggtg600
gctgatcggcgcagagtccg"tgtg卿ctgct肌gcggcgacacgtatgaggccgtggtc660
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cccacgctgcctctgggacgctcagctgatgtccggcaaggggagtttgttgttgccatg780
ggaagtccctttgcactgcaga^ca^cgatcacatccggcattgttagctctgctcagcgt840
ccagccagagacctgggactcccccaaacc￡L8Ltgtgg￡iatacat "t caaactgatgcagct900
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t￡lC3ttggggtgatgatgctgaccctgagtcccagcatccttgctgaactacagcttcgs1140
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cctgcacaccgggctggtctgcggcctggtgatgtgattttggccattggggsgc卿tg1260
gt^C￡L￡L3￡ltgCtg3ag3tg"tttatgaagct:gttcg犯ccceiatcccagttggcagtgcag1320
8tCCggCggggacgaga^cactgaccttatatgtgacccctgaggtcac1377
〈210〉 4 <211> 458 〈212〉 PRT
〈213〉 人屬人(Zfo膨卿ie/ s) <400> 4
Met Ala Ala Pro Arg Ala Gly Arg Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Ala 15 10 15
Trp Arg Ala Leu Gly Gly lie Arg Trp Gly Arg Arg Pro Arg Leu Thr 20 25 30Pro Asp Leu Arg 35
Thr Tyr
Arg Val 50 Val Thr 65
Ala Gin Leu Thr
Gly
Glu Pro Arg
Ala Leu Leu Thr Ser Gly Thr Ser 40 Ser
Glu Asn Ser Gly 100
Ala Val Leu Leu
Thr Pro Ser Leu Trp Ala Arg
55 60
Ala Cys Leu Thr Ser Gly Thr
70 75
Val Thr Pro Asp Thr Arg Thr 90
Trp Leu Ala
Ala 85
Thr Arg Ser Arg
Ala Gly Gly 115
Val Leu Ala Ala
Pro Ala 130 Ser Gin 145
Val Val
Tyr Asn Phe Tyr
lie
Glu 165 Asn
lie 150 lie
Val 135 Ala
Leu 120 Pro
Ala 105
Leu Trp Gly Gly
Asp Pro 45
Leu Ser
Pro Gly
Arg Glu
Val Ala 110 Gly Arg 125
Ala Ser
Asp Leu Asp Gly Ser Gly
Val Pro lie Ser 180
Asn Ala His Val
Ser Pro Pro Pro 140
Val Val Glu Lys Thr Ala 155
Arg His Pro Phe Leu Gly 170
Val Val Ala
lie Val Thr 195
Arg Leu Leu Ser Gly Asp 210
Pro Val Ala Asp lie Ala 225 230 Pro Thr Leu Pro Leu Gly
Val 200 Tyr
Thr 215
Thr Leu Arg
Phe 185
Ala Asp Arg Arg
Glu
Val Val Ala Met 260
Leu 245
Gly Ser Pro Phe
Ala Val Val 220
lie Gin Thr 235
Arg Ser Ala Asp Val Arg 250
Leu Gin Asn
Ala 265
Ala Asp 190 Arg Val 205
Thr Ala
Lys Glu
Gin Gly
Thr lie 270
Arg Ala
Val Gly
Pro Arg
80 Ala Ser 95
Leu Gly
Gly Pro
Pro Arg
Pro Ala 160 Arg Glu 175
Gly Leu
Arg Val
Val Asp
Pro Leu 240 Glu Phe 255
Thr SerGly lie Val Ser Ser Ala Gin Arg Pro Ala Arg 275
Asn Val Glu Tyr
Gin Thr 290 Asn Ser 305
Asn Thr Arg Leu Gly lie
Arg 280
Gin Thr Asp Ala
Gly
Met
Arg
Gly Lys
Pro
Va丄 325 Phe
Leu 310 Thr
lie 295
Val Asn Leu Ala Gly lie
Gly
Leu His Arg
Glu 340
Gly Ser Gin Arg
Ser 355
Pro Ser lie Leu
Gly 345 Tyr
Asp
Asp
Ser 330 Glu
lie
Asp Leu 285 Ala lie 300
Glu Val
Gly Leu Pro Asp Phe Gly
lie
Gly 315
Phe Ala lie Pro
Leu Ser 370
Pro Asp Val Gin His 385
Pro Ala His Arg
Arg 360
Glu Leu Gin Leu
Lys Lys Asn Gly
Gly Val 320 Ser Asp 335
Ser Ser
Ala 375
Val Leu lie His
Gly 390
Gly Leu Arg Pro
Val
Arg 380 Val
Ser 350
Met Leu Thr
Met 365
Glu Pro Ser Phe
Ala 405
Val Gin Asn Ala
Gly Glu Gin Met 420
Gin Leu Ala Val
Gly 410 Asp
Lys 395
Asp Val lie Leu
Val
Thr Gin Ser 435
Thr Leu Tyr Val Thr Pro 450
Glu
425
lie Arg Arg
Glu 455
Gin 440
Val Thr Glu
Tyr Gly
lie Leu Gly Ser 400 Ala lie 415
Val Arg
Glu
Arg 445
Ala 430
Glu Thr Leu
權(quán)利要求
1、OMI蛋白的編碼基因在制備促進(jìn)A53Tα-synuclein突變體蛋白降解的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；所述A53Tα-synuclein突變體蛋白是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2、 OMI蛋白的編碼基因在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白的編 碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋O的DNA分子；3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
3、 OMI蛋白的編碼基因在促進(jìn)溶酶體降解中的應(yīng)用；所述OMI蛋白的編碼基因?yàn)?如下1)或2)或3)的咖A分子1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋O質(zhì)的 DNA分子。
4、 OMI蛋白的編碼基因在制備促進(jìn)溶酶體降解的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白的 編碼基因?yàn)槿缦耹)或2)或3)的DNA分子1) 其編碼序列是序列表中序列3所示的DNA分子；2) 在嚴(yán)格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3) 與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
5、 0MI蛋白在制備促進(jìn)A53T a-symiclein突變體蛋白降解的藥物中的應(yīng)用；所 述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)；所述A53T a-synuclein突變體蛋白是如下(c)或(d)的蛋白質(zhì)(c) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d) 將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
6、 0MI蛋白在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白是如下(a)或 (b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
7、 0MI蛋白在促進(jìn)溶酶體降解中的應(yīng)用；所述OMI蛋白是如下(a)或(b)的蛋 白質(zhì)(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
8、 OMI蛋白在制備促進(jìn)溶酶體降解的藥物中的應(yīng)用；所述OMI蛋白是如下(a) 或(b)的蛋白質(zhì)(a) 由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b) 將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與序列4具有相同功能的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種OMI蛋白及其編碼基因的一種新用途。本發(fā)明提供的新用途是OMI蛋白及其編碼基因在制備促進(jìn)A53T α-synuclein突變體蛋白降解的藥物中的應(yīng)用，在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用，在促進(jìn)溶酶體降解中的應(yīng)用和在制備促進(jìn)溶酶體降解的藥物中的應(yīng)用。OMI蛋白是序列表的序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，OMI蛋白的編碼基因是序列表的序列3所示的DNA分子。本發(fā)明將OMI蛋白及其編碼基因與溶酶體的降解活性聯(lián)系起來，揭示了該蛋白對細(xì)胞酸性細(xì)胞器-溶酶體的調(diào)節(jié)功能，和對A53T α-synuclein-EGFP蛋白降解的促進(jìn)作用，為帕金森病的臨床治療提供了新的思路，具有重大意義。
文檔編號A61K38/43GK101417126SQ20081023931
公開日2009年4月29日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者斌 李, 王光輝 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)