專利名稱：：法氏囊五肽、其衍生肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性的法氏囊五肽、其衍生肽及其應(yīng)用。二
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)生物活性肽(Biologicallyactivepeptides,BAP)指的是一類分子量小于6000D,具有多種生物學(xué)功能的多肽。其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不一，可從簡單的二肽到環(huán)形大分子多肽，而且這些多肽可通過磷酸化、糖基化或?；恍揎棥；钚噪牡姆N類很多，在動物體內(nèi)廣泛存在，并且具有重要的生理學(xué)功能，從具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、類激素、類抗生素到調(diào)味及改變飼料味覺等功能。如免疫活性肽不僅能增強機體的免疫能力，在動物體內(nèi)起重要的免疫調(diào)節(jié)作用；而且還能刺激機體淋巴細胞的增殖和增強巨嗜細胞的吞噬能力，提高機體對外界病原物質(zhì)的抵抗能力。再如抗氧化肽具有較強的抑制生物大分子過氧化和清除體內(nèi)自由基的功能。生物活性肽在機體內(nèi)含量甚微，代謝快，很容易降解，因此，對于新的活性肽的獲得及生物活性的檢測具有一定的困難。近年來，隨著各種高靈敏多肽分離純化、定量技術(shù)的應(yīng)用，新的活性肽不斷被發(fā)現(xiàn)，對活性肽的分布與功能的認識不斷加深。新的活性肽的研究取得迅速發(fā)展。免疫系統(tǒng)的基本功能是保護機體免于疾病的侵害。這些疾病不僅包括由于細菌、病毒及其他病原體引起的疾病，同時也包括癌癥以及由于免疫失調(diào)自身免疫紊亂導(dǎo)致的疾病。免疫系統(tǒng)包括參與免疫應(yīng)答的各種器官、組織細胞和免疫效應(yīng)分子。胸腺和法氏嚢是中樞免疫器官。胸腺不僅是T細胞分化、發(fā)育和成熟的場所，而且還可以分泌多種胸腺激素、調(diào)節(jié)機體的免疫功能，特別是細胞免疫功能。1966年Goldestein等從小牛胸腺中提取了具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，命名為胸腺素(thymosin)。之后，相繼有文獻報道了純化胸腺激素的方法，先后分離出胸腺素al(thymosinalpha1)、胸腺素B(thymosinbeta4)、血清胸腺因子(thymulin)等多種具有有免疫生物學(xué)活性的蛋白和多肽因子。胸腺激素在疾病診斷和治療中有重要的作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、腫瘤、癌癥和免疫缺陷等的研究中，是一類免疫增強劑或免疫調(diào)節(jié)劑。法氏嚢是禽類的特有免疫器官，是細胞發(fā)育分化和成熟的場所，法氏囊除具有中樞免疫器官的地位外，還作為外周免疫器官發(fā)揮作用。而對于與胸腺具有相同地位的法氏嚢免疫活性因子的研究不多。1960年Glick報道，法氏囊(BF)粗提物用丙酮處理后，多次注射去除BF的仔雞，可使其恢復(fù)產(chǎn)生抗體的能力。1972年Toivanen等報道，給去除BF的雛雞注射雞胚干細胞后，可使其恢復(fù)體液免疫的能力。1976年Baba等報道，17日齡摘除BF的雛雞連續(xù)注射5天法氏囊提取也能有效恢復(fù)對牛血清白蛋白(BSA)的抗體生成能力。1976年Brand等報道在外用雞BF提取物誘導(dǎo)新生雞骨髓淋巴細胞的分化，對T、B淋巴細胞分化都有誘導(dǎo)作用，提示可能存在一種淋巴細胞分化激素---bursopoietin。1977年Baba報道丙酸睪酮(TP)可以制雞法氏嚢發(fā)育，產(chǎn)生抗體多為IgM，而法氏嚢提取物可恢復(fù)抗體水平，促使抗體類型由IgM向IgG轉(zhuǎn)化。1986年Audyha首次利用各種層析技術(shù)從法氏嚢中分離到一種物質(zhì)Bursin,是一種三肽，其氨基酸組成順序為Lys-His-Gly-NH2,它可誘導(dǎo)哺乳動物和禽類B細胞的分化，提高人DaudiB細胞中的cAMP和cGMP水平。1991年鄭昌學(xué)等報告，北京鴨法氏嚢提取物能顯著提高小鼠脾臟空斑形成細胞(PFC)的數(shù)量，對淋巴細胞抑制劑環(huán)磷酰胺具有明顯的拮抗作用，并從法氏嚢提取物中進一步分離到一種分子量小于750Da的肽類物質(zhì)。1992年Murthy等報道，大劑量的法氏囊組織提取物在體外可以促進PHA誘導(dǎo)的淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，并確信是囊素之外的物質(zhì)在起作用。從生物體提取具有免疫活性或免疫調(diào)節(jié)作用的活性肽的文獻很多。如美國專利6337093,發(fā)明人申請了從昆蟲體內(nèi)提取具有免疫調(diào)節(jié)和抗菌作用的活性肽的專利。WO96/04005發(fā)明人申請了組藥用復(fù)合物專利，該組藥用復(fù)合物的主要成分是從山羊、豬、牛肝等組織中提取的一種具有激活主要組織相同性抗原、增強免疫反應(yīng)的多肽。胸腺五肽(Thymopentin)是胸腺生成素(Thymopoieti,43肽)種氨基酸序列32-36的五肽，商品名日達仙，作為一種免疫因子已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，在抗感染、抗腫瘤、免疫缺乏癥的治療上獲得可喜成果。由于外界環(huán)境及機體自身新陳代謝，生物體內(nèi)不斷產(chǎn)生活性氧。所謂活性氧，是指機體內(nèi)或者自然環(huán)境中含氧并且活潑的物質(zhì)的總稱。主要有一種單線態(tài)氧(~10_2);三種氧自由基，即超氧離子自由基('02)、羥自有基('OH)和氫過氧自由基(HOO');兩種過氧化物，即過氧化氫(H202)和過氧化脂質(zhì)(ROOH)以及一種含氮氧化物(NO)等。在機體中常見的活性氧有超氧自由基、羥自有基、單線態(tài)氧、過氧化氫、脂過氧基等?；钚匝趸瘜W(xué)性質(zhì)活潑，參與部分生物功能。如前列腺素的合成、凝血酶原的合成、機體內(nèi)的解毒功能、吞噬細胞殺菌過程以及核糖核苷的還原等。但過多的活性氧則會引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致組織細胞、亞細胞和分子結(jié)構(gòu)的破壞，并隨著破壞層次逐漸擴展造成功能損傷，引起心臟病、癌癥、和衰老等疾病，構(gòu)成很多疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。在人體內(nèi)存在一整套防御活性氧損傷的體系，如1、谷胱甘肽過氧化物酶體系(GHS-PX),可系統(tǒng)地保護生物膜免受脂質(zhì)過氧化損害。2、超氧化物歧化酶(SOD),此酶能清除超氧陰離子，進而阻斷脂質(zhì)過氧化等一系列自由基反應(yīng)，保護細胞免受損傷。3、過氧化氫酶，其主要作用是清除11202、SOD。事實上，GSH-PX、SOD、CAT和VE等構(gòu)成了一個相互保護的防御體系，維持機體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除的平衡。此外，生物體內(nèi)還存在一些天然的抗氧化肽，如肌肽、谷胱甘肽等。一些分泌激素如黃體生成素釋放激素，腦啡肽，血管緊張素，催產(chǎn)素等其第二功能就是抗氧化作用。這些激素具有清除過氧化自由基、防止低密度脂蛋白的氧化和抑制腦膜脂質(zhì)過氧化的功能。因此，在各種情況下，有重要的原因研究機體的各種生物活性肽，而同時具有免疫活性和抗氧化活性的生物活性肽必將在生物制藥、保健品、化妝品、食品和飼料等行業(yè)有著廣泛的用途。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明提供一種具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性的法氏嚢五肽、其衍生肽及其應(yīng)用。該法氏囊五肽(Bp5)結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，無化學(xué)毒性，無免疫原性，制備簡單。法氏嚢五肽(Bp5)可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖、提高機體的體液免疫和細胞免疫的水平、還可以提高機體抗過氧化應(yīng)激的能力，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的免疫調(diào)節(jié)、免疫治療和抗過氧化作用的藥物或制劑?？捎糜诨A(chǔ)研究、臨床治療、營養(yǎng)保健和美容化妝等領(lǐng)域。才支術(shù)方案一種法氏嚢五肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。一種法氏嚢五肽的衍生肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為X-R1-R2-R3-R4-R5-Y，其中X:H、乙酰氨基或者氨基乙?；籖l:D-Cys或者L-Cys;R2:D-Lys、D-Arg、D-His、L-Lys、L隱Arg或者L-His;R3:D-Asp、D-Glu、L-Asp或者L-Glu;R4:D-Val或者L-Val;R5:D-Tyr或者L-Tyr;Y:-OH、NH2或Od—6烷基。上述肽在治療免疫缺陷病、機體免疫調(diào)節(jié)、控制腫瘤增長、抗病毒感染、治療與^L體過氧化有關(guān)的疾病藥物中的應(yīng)用。上述肽在用于機體抗過氧化及清除體內(nèi)自由基的抗衰老藥品、化妝品或保健品中的應(yīng)用。上述肽在食品、銅料抗氧化劑中的應(yīng)用。本發(fā)明充分利用現(xiàn)代科技成果，采用先進的技術(shù)途徑從雞的法氏嚢中提取到一種新的活性肽，即法氏囊五肽(Bp5)其氨基酸序列為Cys-Lys-Asp-Val-Tyr(見實施例l)。首先利用超濾濃縮技術(shù)，回收分子量1000Da以下的法氏嚢組織有效活性成分。超濾濃縮技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種分離、純化技術(shù)，它具有效率高、利于工廠化生產(chǎn)，可在室溫或低溫下操作，對樣品損害小，回收利用率高，不宜污染，不用化學(xué)試劑，濃縮的同時可部分純化以及選擇范圍廣等優(yōu)點，因此，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)制品、生物制品及生物技術(shù)產(chǎn)品的下游工程等方面。超濾濃縮技術(shù)的主要原理是通過微孔濾膜在外來壓力作用下使溶液中的溶質(zhì)得到濃縮或分離，采用排阻率為1000Da的濾膜，可以使小于1000Da的小分子量的物質(zhì)濾過。這樣通過超濾濃縮技術(shù)就可以獲得含有有效成分的法氏囊組織超濾液。超濾液經(jīng)真空冷凍干燥后獲得粗制品。粗制品經(jīng)適量的蒸餾水溶解后用1N的三氟乙酸溶液調(diào)pH值到2-3,充分搖勻后經(jīng)12000轉(zhuǎn)離心15分鐘棄沉淀取上清液，再經(jīng)真空冷凍干燥。凍干品用適量的蒸餾水溶解后用1N的三氟乙酸溶液調(diào)PH值到2-3,用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離、純化活性成分。本發(fā)明充分利用了C18反相硅膠HPLC在分離、鑒定肽類物質(zhì)時所具有的速度快、靈敏度高、分辨率好等優(yōu)點，結(jié)合梯度濃度洗脫的操作手段，成功地從雞法氏囊組織超濾液中獲得了可用于分子量測定、多肽測序等生化分析說必需的高純度的法氏嚢活性肽。在獲得高純度的法氏嚢活性肽后，發(fā)明人利用美國Finnigan公司的LCQDECAXP系統(tǒng)進行了液相色鐠-電噴霧質(zhì)譜分析，測得該法氏嚢活性肽的分子量為626.27。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人對該法氏囊活性肽進行了氨基酸序列的測定。眾所周知，肽的氨基酸測定有很多方法，其中最常用的是化學(xué)法，通常用Edman降解法。其基本原理是多肽鏈-端的氨基酸的氨基與苯異硫氰酸酯(PITC)試劑在弱堿條件下形成苯異硫曱氨?；苌?PTC-肽)，后者在無水三氟乙酸(TFA)下裂解釋放出末端的苯氨基噻唑啉酮氨基酸(ATZ-氨基酸)，然后轉(zhuǎn)化成乙內(nèi)酰苯硫氨基酸(PTH-氨基酸)，這些氨基酸可用HPLC法加以鑒定。發(fā)明人根據(jù)Edman降解法原理，采用當今最先進的PROCISEcLC蛋白測序系統(tǒng)(AppliedBiosystems)進行氨基酸序列測定。在所進行的五個測定循環(huán)中，第一個循環(huán)未見典型的氨基酸峰，第2-5個循環(huán)出現(xiàn)典型的氨基酸特征峰，它們分別是賴氨酸(Lys,K)、天冬氨酸(Asp,D)、纈氨酸(Val,V)、酪氨酸(Tyr，Y)結(jié)合分子量判斷該多肽第一個氨基酸可能是半胱氨酸(Cys,C)。由于在PTH-氨基酸分析的體系中，PTH-半胱氨酸在該系統(tǒng)中沒有色譜峰，必須對半胱氨酸進行修飾才能測定。所以，為了進一步確定該法氏嚢活性肽氨基6酸序列中的第一個氨基酸，獲得完整的氨基酸序列，使用了另一種多肽氨基酸序列測定方法。即毛細管液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS-MS,英國Micromass公司)分析法測定氨基酸序列。最終根據(jù)質(zhì)譜圖確定了法氏囊活性肽的完整的氨基酸序列。即半胱氨酸(Cys，C)-賴氨酸(Lys,K)-天冬氨酸(Asp,D)-纈氨酸(Val,V)-酪氨酸(Tyr,Y)。獲得法氏囊五肽的途徑并不局限于上述方法，還可以通過固相多肽合成技術(shù)或DNA重組技術(shù)獲得。眾所周知，化學(xué)合成多肽的方法見著與免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、食品學(xué)、藥物學(xué)等許多文獻中。在肽合成的技術(shù)方面取得了突石皮'f生進展的是R.BruceMerrifield,(Merrifield,R.B.,"Solidphasepeptidesynthesis1.Thesynthesisofatetrapeptide，"丄Am.Chem.Soc.85:7129(1963))他設(shè)計了一種肽的合成途徑并定名為固相合成途徑。固相合成的優(yōu)點主要表現(xiàn)在最初的反應(yīng)物和產(chǎn)物都是連接在固相載體上，因此可以在一個反應(yīng)容器中進行所有的反應(yīng)，便于自動化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離?；瘜W(xué)合成多肽現(xiàn)在可以在程序控制的自動化多肽合成儀上進行。DNA重組技術(shù)是最近二三十年發(fā)展起來的最重要的新興技術(shù)之一，目前已有很多基因工程新型藥物及疫苗投放市場，產(chǎn)生了巨大的社會效應(yīng)和經(jīng)濟效應(yīng)。具體到本發(fā)明，可以利用DNA重組技術(shù)將編碼上述活性肽的核酸序列插入到載體DNA中構(gòu)建一個表達載體，繼而將構(gòu)件的表達載體導(dǎo)入到宿主細胞中獲得一個基因工程宿主細胞，將基因工程宿主細胞放入一個適宜的環(huán)境中以利于基因工程宿主細胞表達上述活性肽。再通過基因工程后處理將表達的活性肽分離、純化。本發(fā)明提供的五肽具有非常好的免疫調(diào)節(jié)作用(見實施例2),利用上述的法氏囊五肽(Bp5)或其推導(dǎo)的等價序列肽的免疫增強或免疫調(diào)節(jié)作用制造藥物或醫(yī)藥組合物(藥劑、藥品)?？扇菀椎仳炞C上述的法氏囊五肽(Bp5)或其推導(dǎo)的等價序列肽的免疫增強或免疫調(diào)節(jié)作用。如淋巴細胞免疫活性監(jiān)測、CTL、、細胞因子量的多少、抗體的產(chǎn)生等。諸如此類的免疫學(xué)檢測方法見實施例部分本發(fā)明提供的法氏嚢五肽(Bp5)具有抗氧化活性。(見實施例3)本發(fā)明在體外試驗采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基檢測嚢素五肽那清除羥基自由基的能力、采用改良的鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生超氧陰離子來檢測嚢素五肽清除超氧陰離子的能力；采用FRAP(ferricreducingantioxidantpower)法檢測嚢素五肽的總的抗氧化能力、TBARS法檢測囊素五肽的抗脂質(zhì)體過氧化活性。上述檢測方法祥見實施例3。從試驗結(jié)果可知，嚢素五肽具有很強的清除羥基自由基、超氧陰離子的能力。體外試驗同樣表明嚢素五肽具有較強的抗脂質(zhì)體過氧化能力。鑒于囊素五肽具有良好的免疫促進作用和較強的抗氧化作用，其應(yīng)用相當廣泛。首先，可以利用嚢素五肽作為人和動物一些疾病的預(yù)防和治療的綜合措施之一。如流感的防止措施中可以將囊素五肽同流感疫苗或抗病毒藥物聯(lián)合使用以加強疫苗或抗病毒藥物的效果。嚢素五肽對疾病的防治作用可以延伸到抗感染及抑制腫瘤的生長。因此，本發(fā)明一個可實施的方案是將嚢素五肽和其他藥劑如抗病毒制劑、抗感染制劑、抗肺瘤制劑混合或整合在一起組成藥物組合物。該情況下只要藥物組合物含有本發(fā)明的目的成分即嚢素五肽就屬于本發(fā)明的藥劑范疇。本發(fā)明中，用嚢素五肽制造的醫(yī)藥組合物可用于人和動物的免疫功能異常的治療(如免疫缺陷或免疫功能低下)、抗病毒、抗感染、抑制腫瘤的生長以及治療機體過氧化相關(guān)的疾病(冠心病和衰老等疾病)。本發(fā)明另一個可實施的方案是利用囊素五肽作為免疫佐劑制造疫苗復(fù)合物，即利用現(xiàn)有^L術(shù)通過物理的方法將該該佐劑成^f分與適當?shù)目乖旌?。本發(fā)明另外一個可實施的方案是利用嚢素五肽用于制造飲食品，包括保健品、功能性食品、飲料。特別是與調(diào)節(jié)機體免疫功能及抗氧化有關(guān)的飲食品。本發(fā)明另一個可拓展的實施方案是利用囊素五肽制造化妝品。即利用嚢素五肽具有較好的抗氧化能力、無毒副作用的特性，將囊素五肽與其他化妝品成分組合可以很好地提高化妝品的抗老化、去角質(zhì)、美白的功效。本發(fā)明嚢素五肽的施用量可根據(jù)使用目的、使用方法、制劑的形式等適當選擇。組合物的有效肽的用量可以在較大范圍內(nèi)變化。此外，肽的使用量取決于該組合物的施用方法和所用的特別配劑。有益效果本發(fā)明涉及從雞法氏嚢中提取到一種新的具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗氧化活性的法氏囊五肽(Bursopentin,Bp5)、其衍生肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的法氏嚢五肽(Bp5)的氨基酸結(jié)構(gòu)序列為Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。本發(fā)明的法氏嚢五肽(Bp5)結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，無化學(xué)毒性，無免疫原性，制備簡單，既可以從雞或其它禽類的法氏嚢提取，也可以化學(xué)合成，化學(xué)合成時成本很低，可以大量制備。法氏嚢五肽(Bp5)可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖、提高機體的體液免疫和細胞免疫的水平、還可以提高機體抗過氧化應(yīng)激的能力，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的免疫調(diào)節(jié)、免疫治療和抗過氧化作用的藥物或制劑?？捎糜诨A(chǔ)研究、臨床治療、營養(yǎng)保健和美容化妝等領(lǐng)域。四圖1:純化囊素五肽的反相高效液相色譜圖。圖2:Q-TOF質(zhì)譜分析圖圖3:HI抗體分析圖。與AIV免疫組比較，差異顯著P〈0.05;差異極顯著P<0.01。圖4~6:HA抗體和抗體亞型分析圖。與AIV免疫組比較，差異顯著P<0.05;差異極顯著P〈0.01。其中圖4為HA抗體IgG亞型分析圖；圖5為HA抗體IgGl亞型分析圖；圖6為HA抗體IgG2a亞型分析圖圖7:嚢素五肽能夠提高特異性CTL對靶細胞的殺傷活性。與AIV免疫組比較，差異顯著P〈0.05;差異極顯著P〈0.01。圖8:囊素五肽具有較強的還原能力，采用FRAP法可以檢測出嚢素五肽具有非常有效的還原能力。從而揭示了囊素五肽具有電子供體的特性從而具有中和自由基的能力。圖9:嚢素五肽具有抗脂質(zhì)體過氧化的能力，從圖中可知嚢素五肽能非常有效地抑制由Fe231發(fā)的卵磷脂分散體系的過氧化作用，而且所測定的濃度范圍內(nèi)隨囊素五肽濃度的增大而增強。圖10:嚢素五肽能夠有效地清除超氧陰離子，從圖中可以看到囊素五肽對超氧陰離子有較強的清除作用，并具有明顯的劑量效應(yīng)。圖11:嚢素五肽能夠有效地清除羥基自由基，從圖中可以看到囊素五肽對羥基自由基有較強的清除作用，并且具有明顯的劑量效應(yīng)。五具體實施例方式實施例1、嚢素五肽(Bp5)的制備囊素五肽(Bp5)既可以從雞或其他禽類法氏囊中通過生物化學(xué)方法提取，又可以通過人工合成的方法獲得。1)從法氏嚢中提取取剔除筋膜和脂肪組織的新鮮雞法氏囊組織1000g,用予冷至4-10。C的質(zhì)量濃度0.85%的生理鹽水洗滌一次。瀝干置于勻漿機中再加入4-10。C的質(zhì)量濃度0.85%的生理鹽水在0-10。C下組織搗碎機中高速勻漿三次，每次30秒。4。C超聲裂解勻漿液兩次，每次5分鐘。水浴加熱裂解液到80°C(5分鐘)，迅速冰浴冷卻至10。C以下，4°C,4000rpm離心30min。合并所得上清，-20°。反復(fù)凍融兩9次。4°C,12000rpm離心30min,收集上清。上清用美國Millipore公司的超濾系統(tǒng)進行超濾，濾膜排阻為1000Da。收集分子量1000Da以下超濾液，冷凍干燥后得到法氏嚢粗提物。粗制品經(jīng)適量的蒸餾水溶解后用10%三氟乙酸溶液調(diào)PH值到2-3,充分搖勻后4。C過夜，經(jīng)12000rpm離心15分鐘棄沉淀耳又上清液，再經(jīng)真空冷凍干燥。凍干品用適量的蒸餾水溶解后用10%三氟乙酸溶液調(diào)PH值到2-3,用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離、純化活性成分。色諳柱為ZorbaxC-18(ODS)柱(150x4.6mm)。流動相A相為0.1%TFA(v/v)的水溶液；B相為0.1%TFA的乙晴溶液；線性梯度為5-18%B/A,流速lmL/min,30°C，20min。280nrn檢測。收集保留時間為19.098分鐘的活性峰(見附圖1)?；钚苑褰?jīng)真空冷凍干燥后得到2.12mg粉末。即為天然囊素小肽。分離純化得到的嚢素小肽經(jīng)過質(zhì)語分析得到氨基酸一級結(jié)構(gòu)是Cys-Lys-Asp-Val-Tyr(見附圖2)2)化學(xué)合成囊素五肽(Bp5)用化學(xué)方法合成氨基酸結(jié)構(gòu)相同的五肽。方法為采用雙通道全自動多肽合成系統(tǒng)合成。實施例2囊素五肽(Bp5)的免疫調(diào)節(jié)活性天然的嚢素五肽具有增強有絲分裂原誘導(dǎo)的鼠脾臟T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖的能力。在此基礎(chǔ)之上，發(fā)明人以4-6周齡小鼠為動物模型，以H9亞型禽流感病毒為抗原與不同濃度的嚢素五肽混合免疫，分別于0、14、28天共免疫三次，分析了囊素五肽的免疫調(diào)節(jié)功能(見附表1)。通過下列實驗可以發(fā)現(xiàn)囊素五肽不但能提高機體體液免疫的功能而且還能提高機體的細胞免疫功能，并且具有平衡Thl和Th2類型免疫反應(yīng)的功能。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>1)囊素五肽(Bp5)具有提高血凝抗體滴度的能力(見附圖3)分別與免疫后7、21、35天分離血清，檢測HA蛋白特異性血清效價。測定方法按照O正標準進行。2)囊素五肽(Bp5)能夠提高特異性抗體(IgG)的分泌水平且具有平衡抗體亞型(IgGl和IgG2a)分泌水平的能力(見附圖4A、4B、4C)分別于免疫后7、21、35d分離血清才全測H9N2HA抗體，用0.05McarbonatebufferpH9.6(CBS)稀釋大腸桿菌表達的重組H9N2HA蛋白至IOng/mL,加入96孔酶標板中，每孔100//L，4。C過夜包被，后用PBST洗涂3次。用1%BSA(m/v)于室溫下封閉3h，PBST洗滌3次。力o入1:10-1:105(v/v)稀釋的小鼠血清(每孔100〃L)作用1h，再次以PBST洗滌3次。加入1:1000(v/v)稀釋的過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG和1:2000(v/v)稀釋的過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgGl、IgG2a(每孔100^L)作用1h,PBST洗滌3次，拍干，加入現(xiàn)配的TMB顯色液(每孔100〃L),室溫避光反應(yīng)20min后，以2MH2S04終止反應(yīng)。在酶標儀上讀取OD45o。每個血清褲釋度對應(yīng)一個ELISAOD值，繪制血清稀釋度(logscale)對應(yīng)OD值曲線。通過擬合曲線回歸分析halfmaximalOD時的血清稀釋度。計算該血清稀釋度的logarithm值來作為實驗結(jié)果。每個血清滴定被重復(fù)三次。3)囊素五肽(Bp5)能夠4是高細胞因子的分泌水平TreatmentIL-2(pg/mL)IFN-y(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-10(pg/mL)PBSprime44.22±8.5377.22±11.2358.35±9.5632,65±7.89AIVprime58.18±10.7875.45±9.6777.09±12.3145.89±6.92AIV+500ugBP5prime67.34±13.9595.65±17.81*90.57±9.9943.94±11.66AIV+100ugBP5prime66.26±12.3100.56±12.33*95.87±23.11*52.79±13.63AIV+20ugBP5prime77.27±13.23*103.12±25.11**100.35±11.23*68.56±9.88b*H9N2Vaccineprime69.98±23.5696,31±23.09*87.66±9.6750.37±8.91PBS1stboost47.58±7.9575.89±13.9956.57±21.0931.07±5.89AIV1stboost69.13±15.1182.06±16.8888.93±31.0946.19±14.74AIV+500ugBP51stboost76.33±10.79100.67±22.66*99.98±24.7748.71±8.53AlV+100ugBP51stboost79.23±22.11107.46±23.77*120.78±17.92**55.22±8.76AIV+20ugBP51stboost90.42±18.99*110.23±26.34**123.88±19.99**85.36±12.58**H9N2Vaccine1stboost88.25±21.06*101.73±19.04*92.22±14.6652.93±7.88PBS2ndboost39.87±13.5579.48±9.9753.87±11.7831.67±9.67AIV2ndboost73.33±14.9992.03±21.0694.33±19.9945.88±5.88AIV+500ugBP52ndboost88.57±15.87106.38±19.88105.39±24.8150.73±10.23ATV+100ugBP52ndboost91.93±21.67*118.44±25.53*125.89±19.47**65.91±10.79*AIV+20ugBP52ndboost103.38±19.91**133.79±26.77**130.22±21.11**93.58±18.91**H9N2Vaccine2ndboost99.44±19.77*110.08±19.35*110.27±22.1145.41±11.26StandardgroupisAIV.**Significantasp<0.01，*Significantasp<0.05嚢素五肽不但能提高代表Thl類型免疫反應(yīng)的細胞因子IL-2和IFN-y的水平，同時能顯著提高代表Th2類型的細胞因子IL-4和IL-10的水平。具體的檢測方法是分別于免疫后7、21、35d分離血清檢測免疫后小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-IO、TNF-a和IFN-y的含量，應(yīng)用商品化的小鼠細胞因子試劑盒檢測。按試劑盒說明書進行操作。每次分析時，使用對照的重組細胞因子標準品繪制標準曲線，通過標準曲線來計算血清樣品中細胞因子的含量。4)囊素五肽(Bp5)能夠顯著提高脾臟T淋巴細胞CD3+CD4+和CD3+CD8+的百分率Spleniclymphocyte(2"06)TreatmentBPSAIVAIV+highdosesofBp5AIV+middledosesofBp5AIV+lowdosesofBp5CommercialH9N2VaccineCD3+CD4+CD8-23.15±2.1437.09±1.2240.49±2.1643.80±2.37*50.35±1.75**37.59±2.23CD3+CD48+CD4-15.37±1.8916.90±2.1321.43±1.38*24.22±1.56*25.03±2.12**19.63±1.86StandardgroupisAIV.Significantasp<0.01，*Significantasp<0.05具體的檢測方法是最后一次免疫后7天分離小鼠脾淋巴細胞，通過流式細胞儀分析小鼠免疫后脾淋巴細胞中T細胞亞群和NK-T細胞的變化。制備的小鼠脾淋巴細胞(2xl06cells/mL)用100//1PBS液重懸，加入5//1FITC標記的anti-CD3mAb,接下來加入5;/1PEanti-CD4mAb或anti-CD8mAb,于4。C孵育30min,1200rpm,離心10min,PBS洗滌2次后用100〃L封閉液(PBS/1%BSA/0.1%NaN3)(m/v)重懸，4°C保存待檢測。通過FACScan流式細胞^0險測不同表面抗原分子的熒光信號(BD,LSR)，應(yīng)用CellQuest軟件分析實驗數(shù)據(jù)。獲取雙參數(shù)散點圖。5)囊素五肽能夠提高特異性CTL對靶細胞的殺傷活性(見附圖5)效應(yīng)細胞制備第三次免疫后1周后處死各組小鼠，在超凈臺內(nèi)無菌操作取出脾臟，制備成單個脾細胞懸液，取淋巴細胞分離液入離心管管底，沿管壁小心加入兩倍體積的脾細胞懸液，1200rpm,離心20min,沿管壁小心吸出界面層細胞，PBS洗滌3次，RPMI1640營養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)細胞，使達到lxl07cells/5mL。參照同樣的方法分離未免疫的同品系小鼠脾淋巴細胞，用100/^無血清的RPMI1640營養(yǎng)液重懸細胞，使?jié)舛冗_到5xl06cells/100凡。細胞用H9亞型禽流感病毒林A/Duck/Jiangsu/NJ08/05(107PFU)37。C感染2h,用RPMI1640營養(yǎng)液洗滌3次，用5mlRPMI1640營養(yǎng)液重懸細胞，37°C,5%C02培養(yǎng)3h后，3000rad照射。接下來將5mL的免疫的小鼠脾淋巴細胞和禽流感病毒感染未免疫的同品系小鼠脾淋巴細胞37°C5%C02培養(yǎng)箱共孵育6d,然后收集細胞，2000rpm離心10min。細胞沉淀用含5%FBS(m/v)的RPMI1640懸浮，調(diào)整細胞濃度至1xlO7cells/mL,即為效應(yīng)細月包。靶細胞的制備將NIH3T3細胞培養(yǎng)成致密單層，用JS林H9亞型禽流感病毒(108PFU)37。C感染2h,然后收集細胞，2000rpm離心IOmin。細胞沉淀用含5%FBS(m/v)的RPMI1640懸浮，調(diào)整細胞濃度至lxl()6cells/mL,即為靶細胞。CTL的檢測按CytotoxicityAssay試劑盒說明書確定靶細胞的最佳濃度。效應(yīng)細胞與靶細胞數(shù)按效把比100:1、50:1兩個比例均勻混合于100含5%FBS(m/v)的RPMI1640培養(yǎng)基中，作為試驗組。同時設(shè)立以下對照:效應(yīng)細胞自發(fā)釋放組、靶細胞自發(fā)釋放組、靶細胞最大釋放組、培養(yǎng)液對照以及體積校正對照組，各組均設(shè)4個重復(fù)孔，每孔總體積100。4h后，于570nm波長下測定OD值。按照下列公式計算特異性細胞毒性T細胞的百分率CTL(%)=(試驗孔值-效應(yīng)細胞自發(fā)釋放OD值-靶細胞自發(fā)釋放值)/(靶細胞最大釋放OZ)值-耙細胞自發(fā)釋放OZ)值)。實施例3嚢素五肽的抗氧化活性由于嚢素五肽的獨特的結(jié)構(gòu)，使得嚢素五肽具有非常好的抗氧化功能，主要表現(xiàn)在以下幾方面131)嚢素五肽具有較強的還原能力(見附圖6)采用FRAP法可以;險測出嚢素五肽具有非常有效的還原能力。從而揭示了嚢素五肽具有電子供體的特性從而具有中和自由基的能力。2)囊素五肽具有抗脂質(zhì)體過氧化的能力(見附圖7)采用TBARS法評價嚢素五肽的抗脂質(zhì)體過氧化的能力。從圖中可知囊素五肽能非常有效地抑制由Fe^引發(fā)的卵磷脂分散體系的過氧化作用，而且所測定的濃度范圍內(nèi)隨嚢素五肽濃度的增大而增強。3)嚢素五肽能夠有效地清除超氧陰離子(見附圖8)采用改良的鄰苯三酚自氧化法產(chǎn)生活性氧來檢測嚢素五肽清除活性氧的能力。從圖中可以看到囊素五肽對超氧陰離子有較強的清除作用，并具有明顯的劑量效應(yīng)。4)囊素五肽能夠有效地清除羥基自由基(見附圖9)采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基來檢測囊素五肽清除羥基自由基的能力。從圖中可以看到嚢素五肽對輕基自由基有較強的清除作用，并且具有明顯的劑量效應(yīng)。權(quán)利要求1.一種法氏囊五肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。2.一種法氏嚢五肽的衍生肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為X-R1-R2-R3-R4-R5-Y,其中X:H、乙酰氨基或者氨基乙?；?；Rl:D-Cys或者L-Cys;R2:D-Lys、D-Arg、D-His、L國Lys、L-Arg或者L-His;R3:D-Asp、D-Glu、L-Asp或者L-Glu;R4:D-Val或者L隱Val;R5:D-Tyr或者L-Tyr;Y:-OH、NH2或Od—6烷基。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肽在治療免疫缺陷病、機體免疫調(diào)節(jié)、控制腫瘤增長、抗病毒感染、治療與機體過氧化有關(guān)的疾病藥物中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肽在用于機體抗過氧化及清除體內(nèi)自由基的抗衰老藥品、化妝品或保健品中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述肽在食品、飼料抗氧化劑中的應(yīng)用。全文摘要一種法氏囊五肽，其氨基酸結(jié)構(gòu)序列為Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。本發(fā)明的法氏囊五肽(Bp5)結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，無化學(xué)毒性，無免疫原性，制備簡單，既可以從雞或其它禽類的法氏囊提取，也可以化學(xué)合成，化學(xué)合成時成本很低，可以大量制備。法氏囊五肽(Bp5)可以促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖、提高機體的體液免疫和細胞免疫的水平、還可以提高機體抗過氧化應(yīng)激的能力，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的免疫調(diào)節(jié)、免疫治療和抗過氧化作用的藥物或制劑?？捎糜诨A(chǔ)研究、臨床治療、營養(yǎng)保健和美容化妝等領(lǐng)域。文檔編號A61P17/18GK101434650SQ20081024357公開日2009年5月20日申請日期2008年12月23日優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日發(fā)明者李德元,耿志榮,陳溥言申請人:李德元